CUANTIFICACIÓN DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA Y DE LA ACTIVIDAD ESPECÍFICA DE LAS ENZIMAS

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1 CUANTIFICACIÓN DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA Y DE LA ACTIVIDAD ESPECÍFICA DE LAS ENZIMAS I. INTRODUCCIÓN No siendo posible medir la cantidad de enzima directamente de los líquidos y estructuras biológicas por la enorme dificultad que entraña individualizarlas, se recurre a la medida de la velocidad de la reacción que cataliza. Ello es posible gracias al hecho de que, en condiciones adecuadas de medida la velocidad de la reacción es directamente proporcional a la cantidad de enzima. De esta manera es posible expresar la cantidad de una enzima en términos de unidades enzimáticas, con el entendimiento de que una unidad enzimática es la cantidad de ella que produce cierta velocidad de reacción bajo determinadas condiciones. Esa velocidad de reacción se expresa como la cantidad de sustrato transformado en cierto tiempo. A fin de evitar ambigüedades surgidas por la utilización de distintas unidades para expresar la cantidad de sustrato y el tiempo, se ha definido por convención una unidad para que pueda ser aplicada a casi todas las enzimas y que permite comparar las actividades e enzimas diferentes. La definición recomendada por la Unión Internacional de Bioquímica a través de su Comisión de Enzimas es la siguiente: Una unidad internacional (UI) de cualquier enzima, es la cantidad de enzima que cataliza la transformación de un micromol (µmol) de sustrato por minuto, bajo condiciones definidas de medida. Dos casos merecen una aclaración especial: 1. Cuando el sustrato es una proteína o un polisacárido o cualquier otra molécula en la cual son atacados más de un anión, debe remplazar la definición de un micromol de sustrato por un microequivalente del grupo involucrado, es decir, en los ejemplos mencionados más que el número de moléculas completamente hidrolizadas, se toma como medida de la reacción el número de uniones peptídicas o glicosídicas atacadas, respectivamente. 2. En caso de reacciones bimoleculares de tipo: 2A B+C, en que dos moléculas idénticas reaccionen entre sí, una unidad será la cantidad de enzima que cataliza la formación de 2 micromoles de sustrato por minuto. En cuanto a las mencionadas condiciones de medida debe establecerse: - La temperatura a la cual se define la unidad - ph - La concentración del sustrato o los sustratos y cofactores y en general de todos aquellos factores que de una u otra manera pueden modificar la actividad de la enzima. - ACTIVIDAD ESPECÍFICA La actividad de una enzima expresada en términos del contenido de proteína de la preparación se denomina actividad específica y se expresa como el número de unidades de la enzima por miligramo Q.F. FREDY MARTOS RODRÍGUEZ 1

2 de proteína. Esta aumenta durante el proceso de purificación de las enzimas en los homogenizados biológicos y llega a ser máxima y constante cuando la enzima se halla en estado puro. Entonces, la actividad específica además de cuantificar la enzima, constituye una medida del grado de pureza de la enzima durante el proceso de purificación. En este último caso, y siempre que se conozca un peso molecular, se puede definir otra unidad la actividad molecular o molar o número de recambio (índice catalítico), definido como el número de moléculas de sustrato transformado por minuto y por molécula de enzima (o por un solo centro activo) en condiciones experimentales tales que se estén midiendo la velocidad máxima (concentración saturante del sustrato). Su relación con la UI es la siguiente: Un katal es igual a 6x10 7 UI. Una UI es igual a 0,01667 microkatales, igual a 16,67 nanokatales. La actividad específica se expresa en esta nueva unidad como katales por Kilogramo de proteína ( o microkatales por miligramo de proteína ) y la actividad molar en katales por mol de enzima. II. OBJETIVOS - Cuantificar las unidades de sacarasa (invertasa) que existe en la muestra. - Cuantificar la concentración de proteínas contenidas en el sistema. - Calcular la actividad específica de la enzima, previa determinación de las unidades de enzima y la concentración de proteínas. III. MATERIALES Y REACTIVOS - Preparado enzimático 2% - Tubo de ensayo 13x 100 mm (Fusarium moniliforme) - Baño María 37 C - Buffer acetato 0,02M ph 5,0 - Centrífuga - Sacarosa 0,17M - Cocina eléctrica - Hidróxido de bario 0,3N - Beaker 250 ml - Sulfato de Zinc 5% - Espectrofotómero y cubetas - Reactivo Folin Wu - Piseta 500 ml - Reactivo Biuret - Pipeta 0,5mL - Agua destilada - Pipeta 1mL - Pipeta 10mL - Pipeta 5mL - Gradilla porta tubos IV. DIAGRAMA EXPERIMENTAL 1. Armar el siguiente sistema Reactivos Tubos (ml) I II Sacarosa 0,17M - 0,3 Buffer acetato 0,02M ph 5,0 0,5 0,5 Q.F. FREDY MARTOS RODRÍGUEZ 2

3 Pre incubar a 37 C por 2Minutos Preparado enzimático 0,2 0,2 Mezclar e incubar a 37 C por 20 minutos Detener la reacción empleando: Hidróxido de bario 0,3N 0,5 0,5 Sulfato de zinc 5% 0,5 0,5 Sacarosa 0,17M 0,3 - Agua destilada 8,0 8,0 - Mezclar: separar el precipitado de proteínas filtrando o centrifugando a 3500 rpm por 10 minutos. 2. Determinación de la reacción (azúcar reductora): se empleará los filtrados libres de proteínas del paso anterior y se determinará azúcar reductora mediante el siguiente procedimiento: Reactivos Tubos (ml) I II III Filtrado I 0,5 - - Filtrado II - 0,5 - Agua destilada 0,5 0,5 1,0 Solución cúprica alcalina 1,0 1,0 1,0 Colocar en baño de agua hirviendo por 8 minutos Enfriar en chorro de agua Solución fosfomolibdica 1,0 1,0 1,0 - Mezclar, agregar 7 ml de agua destilada. Mezclar y dejar en reposo durante 10 minutos. - Leer la absorbancia de los tubos a 420 nm, considerando que el tubo III es el blanco. Factor: 0,045UI/mL= 22,5 spa. 3. Calculo de la concentración de productos (hexosas = glucosa y fructosa) (Absorbancia tubo II Absorbancia tubo I) x Factor = µm hexosas/ml 4. Calculo de las unidades Internacionales (UI) UI= µm de sustrato transformado/mililitro/tiempo de incubación (min) = [(µm de hexosa/2)/min] 5. Cuantificación de la actividad específica: a. Determinación de la concentración de proteínas en la preparado enzimático: (Reactivo de Biuret) Reactivos Tubos (ml) I II Preparado enzimático - 0,2 Agua destilada 1,0 0,8 Reactivo Biuret 4,0 4,0 - Mezclar y poner en reposo por 30 minutos - Leer las absorbancias a 540 nm considerando al tubo I como blanco. Factor: 65 Q.F. FREDY MARTOS RODRÍGUEZ 3

4 - Cálculo: (Absorbancia tubo II) x Factor = mg de proteína/ml b. Cálculo de la actividad específica (A.E): A.E = UI/mg proteína V. RESULTADOS Q.F. FREDY MARTOS RODRÍGUEZ 4

5 VI. DISCUSIÓN VII. CONCLUSIONES VIII. BIBLIOGRAFÍA Q.F. FREDY MARTOS RODRÍGUEZ 5

6 ESQUEMA DEL PROCEDIMIENTO DE LA PRÁCTICA Q.F. FREDY MARTOS RODRÍGUEZ 6