TAXONOMÍA MOLECULAR. Dra. Alicia Luque CEREMIC

Transcripción

1 TAXONOMÍA MOLECULAR Dra. Alicia Luque CEREMIC

2 Taxonomía clásica Carecen de reproducibilidad: los caracteres fenotípicos pueden variar con las condiciones ambientales. PLEOMORFISMO Debido al bajo poder discriminatorio y a la frecuente incongruencia de los datos morfológicos y fisiológicos el sistema diagnóstico se hace bastante complicado.

3 Taxonomía molecular Se han desarrollado un gran número de técnicas moleculares para la identificación de hongos filamentosos y levaduras debido a: Rapidez y grado de simplicidad de las habilidades requeridas. Sensibilidad. Reproductibilidad.

4 Taxonomía molecular Caracterización de ácidos nucleicos. El estudio del DNA de los hongos se complica por el hecho de que estas poseen un genoma complejo, consistente en DNA nuclear (ndna), DNA mitocondrial (mtdna) y en algunos casos DNA plasmídico. restricción del ADN mitocondrial polimorfismos de ADN generados aleatoriamente por PCR (RAPD-PCR) electroforesis de campo pulsante amplificación y restricción del DNA ribosomal secuenciación de genes nucleares y mitocondriales

5 RESTRICCIÓN DEL ADN MITOCONDRIAL Características del ADN mitocondrial Estructura del ADN mitocondrial: la pobreza en genes del mtdna está compensada por la gran complejidad estructural de algunas regiones intergénicas y también por la presencia de intrones (contribuyen en gran manera a incrementar las diferencias inter- e intraespecíficas existentes en los genomas mitocondriales) Restricción del ADN mitocondrial Digestión del mtdna con endonucleasas de restricción, que nos permitan generar polimorfismos en el tamaño de los fragmentos (RFLP).

6 Métodos basados en la utilización de la PCR PCR-RFLP. la amplificación de un fragmento de ADN mediante dos cebadores específicos que es sometido posteriormente a digestión con una endonucleasa generando un número discreto de bandas. rep-pcr. Este método se basa en la amplificación de secuencias repetitivas que se encuentran repartidas aleatoriamente a lo largo del genoma y cuya secuencia se encuentra conservada a nivel de muchos miembros de la misma familia. Mediante el empleo de cebadores dirigidos a estas secuencias consenso se obtienen directamente perfiles que reflejan la diferente disposición de estas secuencias repetitivas a lo largo del genoma. ribotipado mediante PCR. Esta técnica aprovecha los polimorfismos existentes en los genes o en las regiones espaciadores intergénicas asociadas a los RNA ribosomales y de transferencia.

7 Métodos basados en la utilización de la PCR POLIMORFISMOS DE DNA GENERADOS ALEATORIAMENTE POR AMPLIFICACIÓN POR PCR (RAPD-PCR) Utilizando un único cebador de secuencia arbitraria y corta (normalmente de pb) y una baja temperatura de hibridación, que produce polimorfismo entre los patrones del DNA amplificado. Existen otros dos métodos basados en el mismo principio pero con la diferencia principal en el tamaño del cebador, la AP-PCR (arbitrarily primed PCR)- y DAF (DNA-amplified fingerprinting).

8 POLIMORFISMOS DE DNA GENERADOS ALEATORIAMENTE POR AMPLIFICACIÓN POR PCR (RAPD-PCR) La amplificación se lleva a cabo con condiciones poco restrictivas para favorecer la unión del cebador al ADN molde. Cuando estas uniones se producen, de manera suficientemente estable entre dos zonas separadas una distancia susceptible de ser amplificada, se obtendrá un producto de amplificación de un determinado tamaño. Dependiendo del ADN molde, de la secuencia del cebador que se emplee, así como de las condiciones de amplificación, el número y el tamaño de los fragmentos obtenidos es variable.

9 POLIMORFISMOS DE DNA GENERADOS ALEATORIAMENTE POR AMPLIFICACIÓN POR PCR (RAPD-PCR) Ventajas 1.- La mayor ventaja es que no necesitamos ninguna información previa del organismo de que se trata, ya que sirve para cualquier organismo. Tampoco necesitamos conocer la secuencia del DNA que vamos a amplificar. 2.- Es una técnica muy sencilla y rápida. 3.- Requiere cantidades muy pequeñas de DNA, y tampoco es necesario que la calidad del DNA sea muy buena, aunque esto último afecta a la reproducibilidad. 4.- Es un marcador molecular muy bueno, ya que el cambio en un solo nucleotido puede significar la unión o no del cebador, y por tanto la presencia o no de una banda en el producto de amplificación. Inconvenientes 1.- Presenta un gran inconveniente: su reproducibilidad no siempre es la adecuada, siendo los patrones, en muchos casos, dependientes no sólo de las condiciones de amplificación sino de las condiciones del laboratorio donde se realicen. Actualmente es muy empleada, aunque se suele utilizar junto con otras técnicas de tipado más reproducibles para comparar los resultados.

10 AMPLIFICACIÓN Y RESTRICCIÓN DEL ADN RIBOSOMAL Están presentes en todos los organismos celulares y por tanto comparten un origen evolutivo común. Las comparaciones del rdna, han demostrado su utilidad para valorar la relación tanto entre organismos alejados como entre organismos próximos. IGS NT S 5S NT S ET S 18S ITS 1 5.8S ITS 2 26S ETS IGS Esquema de los diferentes componentes que constituyen cada unidad de DNA ribosomal. IGS: intergenic spacer; NTS: non-transcribed spacer; 5S: gen del RNA ribosomal 5S; ETS: external transcribed spacer; 18S: gen del RNA ribosomal 18S; ITS1: internal transcribed spacer 1; 5.8S: gen del RNA ribosomal 5.8S; ITS2: internal transcribed spacer 2; 26S: gen del RNA ribosomal 26S. Amplificación de diferentes zonas del complejo ribosomal por PCR Restricción del producto de amplificación

11 AMPLIFICACIÓN Y RESTRICCIÓN DEL ADN RIBOSOMAL Ventajas: 1.- Técnica universal: utilidad para comparar cualquier levadura u hongo filamentoso, el nivel de resolución dependerá del grupo estudiado y de los enzimas utilizados. 2.- PCR - RFLPs rápidos, fáciles y reproducibles. Se pueden crear bases de datos de utilización general. Inconvenientes: 1.- La comparación del tamaño de los RFLPs de la región ITS-5.8S RNA con los patrones de las cepas de referencia, puede ser complicada debido a las escasas diferencias que pueden existir entre los patrones obtenidos para especies próximas (diferencias en pocos pares de bases no son apreciables en una electroforesis). A veces se necesita utilizar alguna otra técnica para confirmar la identificación.

12 ELECTROFORESIS EN CAMPO PULSANTE Caracterización del DNA cromosómico: separación de los cromosomas intactos mediante electroforesis en campo pulsante en gel de agarosa La electroforesis en campo pulsante se ideó para separar fragmentos de DNA de elevado tamaño molecular. La alternancia en la dirección del campo eléctrico producida entre pares de electrodos, hace posible que los cromosomas de levaduras y hongos filamentosos se vayan orientando según cambia la dirección del campo eléctrico, y se muevan, en función de su tamaño, a diferentes velocidades a través de los poros del gel de agarosa.

13 ELECTROFORESIS EN CAMPO PULSANTE El análisis de los cariotipos electroforéticos nos permite estimar número y tamaño de los cromosomas al compararlos con los marcadores de peso molecular. Los polimorfismos en el número y tamaño de los cromosomas son comunes en hongos filamentosos y levaduras, no solo entre distintas especies, sino entre cepas de la misma especie

14 SECUENCIACIÓN DE GENES NUCLEARES Y MITOCONDRIALES Análisis de secuencias de genes nucleares y mitocondriales Secuenciación de genes ribosomales nucleares El análisis de las secuencias de los genes ribosomales y de sus regiones intergénicas ha contribuido a descifrar las relaciones filogenéticas entre los taxones de levaduras y hongos filamentosos. Secuenciación de genes mitocondriales Los genes mitocondriales de levaduras y hongos filamentosos presentan características que los hacen interesantes para la obtención de reconstrucciones filogenéticas, y en algunos casos podrían resolver cuestiones que con la utilización de genes nucleares han quedado inconclusas.

15 SECUENCIACIÓN DE GENES NUCLEARES Y MITOCONDRIALES Secuenciación directa a partir del producto de amplificación por PCR Además de las regiones de radn se conocen otros fragmentos del ADN con interés en la identificación: gen de la Beta-tubulina gen de la Orotidina descarboxilasa gen de la Chitina sintetasa gen de la Actina gen del Factor de elongación

16 MÉTODOS BASADOS EN LA UTILIZACIÓN DE LA PCR Dermatofitos PCR y PCR-RFLP usando como blanco el gen de la Quitina Sintetasa I (CHSI)

17 PCR-fingerprinting Fusarium PCR-fingerprinting de 9 especies de Fusarium Calles: M, marcadori; 1-4 F. oxysporum; 5 F culmorum; 6 F. tricinctum; 7 F. anthophilum; 8 F. graminearum; 9 F. graminearum.

18 Taxonomía molecular El empleo de técnicas moleculares en complemento con métodos fenotípicos, es necesario para los aislamientos atípicos o dificultosos Se puede obtener otra información: relaciones filogenéticas, estudios epidemiológicos, emplearse como métodos de referencia para la identificación a nivel de especie, etc.