MANUAL DE LABORATORIO DE REPRODUCCIÓN ANIMAL PRÁCTICA 05. Recuperación, evaluación, clasificación y manipulación de embriones

Transcripción

1 PRÁCTICA 05 Recuperación, evaluación, clasificación y manipulación de embrines Objetivs. Adiestrar en el manej del prtcl de sincrnización y supervulación várica Adiestrar en la recuperación de embrines pst mrtem Determinar el desarrll y transprte embrinari en el tract reprductiv de la cneja Recncer partes del embrión de cneja y estad de desarrll Adiestrar en la evaluación y clasificación de embrines según calidad y estad de desarrll Materiales. Ls materiales necesaris para esta práctica sn: 1. 4 cnejas adultas, 1 mach; serán sincrnizadas y superestimuladas el vari cn la aplicación de 50UI de PMSG e inducidas vulación cn 0.2 ml de GnRH. 2. Fllign 1000 UI, Cnceptal (1 frasc) y aliment de cnejas 3. Bisturí (04 unid), Bandeja (01 unid), Pinzas (02 unid), aguja 18G, slución Ringer (1 lt), Placas de 100 mm (3 unid), jeringa de 10ml (2 unid) 4. Guantes quirúrgics (1 par / alumn) 5. Papel Talla (3 rll / grup) Metdlgía. Las cnejas serán superestimuladas cn ecg (Fllign ), cn el siguiente prtcl Inyec. ecg Servici (68 h) +GnRH 72 h. Recuperación de embrines V. Recuperación, evaluación, clasificación y manipulación de embrines

2 Prgrama de sincrnización y superestimulación várica de cnejas: Cneja 1 Cneja 2 Cneja 3 Cneja 4 Aplic. ecg 50 UI (i.m.) 23/04 pm 22/04 pm 01/05 pm 30/04 pm Mnta natural (2 serv) + 26/04 (am) 25/04 (am) 04/05 (am) 03/05 (am) Aplic. 0.2 ml GnRH (Cnceptal) Recuperación de 28/04 (am) 28/04 (am) 7/05 (pm) 7/05 (pm9 embrines Ls embrines serán recuperads pr lavad del viduct y úter de hembras sacrificadas cn estr sincrnizad a 72 hras pst inseminación. Se utilizará cm medi de lavad 40 ml de slución Ringer suplementada cn 5% suer bvin que será vertida pr el infundíbul cn una jeringa de 20 cc y aguja punta rma 18G de 1 ½. Una placa petri en la parte baja de la unión úter-cervix será el depósit utilizad para recuperar el clectad, siguiend al prcedimient realizad pr Adams (1982) (ver Figura 1a). Zna pelúcida Capa de muscina a) b) Blastómers Figura 1: a) Métd de lavad uterin para recuperar embrines (Adams, 1982) y b) Mrflgía de blastcist de cneja. El líquid recuperad será revisad baj un esterescpi a 20X en búsqueda de embrines y lueg evaluads mrflógicamente a 40X. Ls embrines serán clasificads de acuerd a criteris establecids pr Lindner y Wrigth (1983) quienes cnsideran. V. Recuperación, evaluación, clasificación y manipulación de embrines

3 Estad de desarrll: mórula, blastcist tempran y blastcist tardí; Calidad del embrión: excelente, buen, regular y pbre. El alumn deberá cmpletar la infrmación siguiente y entregar junt cn el cuestinari. Tabla 1: Recuperación de embrines de cnejas: Cneja 1 Cneja 2 Cneja 3 Cneja 3 Raza Edad # parts Pes viv (kg) Fecha de mnta Nr de servicis Fecha de recuperación Cuerps lútes OD y OI Flículs hemrrágics OD y OI Ovas recuperadas Estad de desarrll vas 2 células 4 células 8 células Mórula Blastcist tempran Blastcist Bastcist tardi Blastcist prtuid Calidad de embrines Excelente Buen Regular Pbre Parámetrs Tasa de recuperación Tasa de fecundación Embrines transferibles Recmendacines

4 REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA Dinámica de la nda flicular del vari Adams (1999) afirma que en 95% de las vacas presenta 2 a 3 ndas fliculares en cada cicl estral. Cicls de una sla nda sn reprtadas en vaquillas antes de la pubertad y vacas durante el primer interval entervulatri después del part. Cicl cn 4 ndas casinalmente bservads en vacas Bs indicus. La característica de una nda flicular viene dada pr tres etapas reclutamient, selección y dminancia. El reclutamient se define cm la iniciación del crecimient de flículs gnadtrfina dependientes (2 mm de diámetr) en vejas y primates, per el numer de flículs en crecimient es muy variable entre especies cm es el cas de 50 en cerdas, 5 a 10 en vacas y 1 a 4 en yeguas. Tds ls flículs que inician sn reclutads sn ptencialmente capaz de vular. La selección es un prces muy cmplej que cmprende parámetrs de tamañ y madurez. En tdas las especies la selección se da aparentemente pr el desarrll de LH receptres pr las células de la granulsa, l cual se da cuand el flícul alcanza 4, 5 a 6, 8 y 25 mm de diámetr en vejas, cerdas, vacas y yeguas respectivamente (Driancurt, 2001) Factres que afectan a la supervulación Ls factres asciads cn la administración de gnadtrfinas exógens que afectan la respuesta supervulatria sn; fuente, lte, actividad bilógica de la hrmna (Murphy et al., 1984) Según Kanitz et al., (2002) la transferencia de embrines en vacuns ha sid realizad en prgramas de reprducción en td el mund pr más de 20 añs. La eficiencia de esta tecnlgía, prgress y csts dependen en gran medida de las respuestas de tratamients supervulatris y la inseminación artificial. Indudablemente las hrmnas aplicadas y el esquema de inseminación, sn ls factres principales, pr ende se centra en ls aspects siguientes del tratamient supervulatri cn FSH: relacines de la dsis-respuesta, biactividad de la glicprteína, FSH/Cciente de la LH, tiemp de la vulación e inseminación, frecuencia de la administración del gnadtrfina y de la pblación flicular a la hra del us del gnadtrfina. V. Recuperación, evaluación, clasificación y manipulación de embrines

5 Desarrll embrinari tempran El vcit es vulad en la segunda metafase y n cmpleta la meisis hasta la interacción cn el espermatzide. En el bvin la vulación se da aprximadamente a 24 de iniciad el estr y la primera división se lleva a cab a 48 h., después del estr. Este vcit fecundad n, es una célula de µm de diámetr, incluyend la zna pelúcida ó membrana pelúcida (una capa glicprteica) que tiene un grsr de 12 a 15 µm (Lindner and Wright, 1983). Las primeras tres divisines del embrión se denmina desarrll (cleavaje), tal es así que hasta 8 células se les denmina estads de desarrll (cleavage), durante estas etapas el embrión decrece en pes (Seidel, 1991). Durante el estad de mórula, las células embrinarias cambian de frmas esféricas a plignales (este fenómen se denmina cmpactación). Durante la cmpactación, unines especializadas hacen que las células se pueden cmunicar cn tras. La cmpactación es un excelente sign de que ls embrines están desarrlland nrmalmente; la perdida de cmpactación a 6 días después del estr en vacuns indica desarrll retardad (Seidel, 1991). La mórula en desarrll, internamente frma un cavidad (blastcele) pr gast de energía al bmbera liquid entre las células, La frmación del blastcist, también es indicativ de cntinuidad de desarrll nrmal del embrión. La n frmación de blastcele a 7-8 días después del estr, significa retardad desarrll (Seidel, 1991). En el ratón y prbablemente en el hmbre la cavidad del blastcist se inicia a frmar cuand están presentes más de 20 a 30 células y el mment de la implantación se inicia cuand el blastcist cntiene más de 100 células. En cneja la frmación de blastcist se inicia cerca de tres divisines más tarde que en el ratón, mientras que el blastcist madur cntiene varis cients de células y mide 3 a 4 mm de diámetr. El mment en el que la cavidad aparece n está relacinada cn el tamañ del embrión (Austin and Shrt, 1982). Adams C. E., (1982) Mammalian egg transfer. Ed. Bca de Ratn Flrida. United States, pp 242. Adams G.P., (1999) Cmparative patterns f fllicle develpment and selectin in ruminants, J. Reprd. Fertil. Suppl. 54 (1999) Austin C.R. and Shrt R.V. (1982) Reprductin in mammals. Bk 2: Embrynic and fetal develpment. Secnd editin. University Cambridge. Driancurt M.A. (2001) Regulatin f varian fllicular dynamics in far animals implicatins fr manipulatin f reprductin. Therigenlgy 55: Kanitz W, Becker F, Schneider F, Kanitz E, Leiding C, Nhner HP, Phland R. (2002) Supervulatin in cattle: practical aspects f gnadtrpin treatment and inseminatin. Reprd Nutr Dev Nv-Dec;42(6): Lindner G.M. and Wrigth R.W. (1983) Bvine embry mrphlgy and evaluatin. Therigenlgy. 20(4): Murphy B.D., Mapletft R.J., Manns J., Humphrey W.D. (1984), Variability in gnadtrphin preparatins as a factr in the supervulatry respnse, Therigenlgy 21: Seidel G. E. Jr. (1991) Training manual fr embry transfer in cattle. FAO Animal Prductin and Heath. Paper 77.pp 164 4

6 d5,d6 d7 d8,d9 Figura 2: Embrines bvins en diferentes estads de desarrll (460X), (Lindner and Wright, 1983). Mrula, Blastcists Figura 3: Cuatr mórulas cmpactas respectivamente) (460X), (Lindner and Wright, 1983) (embrión bvin, excelente, buen, regular y mal, V. Recuperación, evaluación, clasificación y manipulación de embrines

7 Errres en la fecundación Plispermia Varis espermatzides penetran en vcit y la frmación de múltiple prnúcles masculins y un prnúcle femenin En invertebrads el exces de espermatzides es eliminad prque el centríl espermátic cntribuye para la primera división del embrinaria En mamífers, el centríl del espermatzide n es esencial y el desarrll puede cntinuar si ds espermatzides penetran, el cigt triplide puede desarrllarse hasta que curre una falla en el desarrll tempran Puede currir en ls vcits envejecids debid a la falla retard del blque a plispermia Pliginia Varis prnúcles femenins y un prnúcle masculin N curre nrmalmente en la naturaleza Se puede prducir pr supresión de la eliminación del segund crpúscul plar Andrgente La unión de ds prnúcles masculins para frmar el embrión N curre en la naturaleza, pudiera ser el resultad del intercambi prnuclear (manipulación del embrión in vitr) Gingente La unión de ds prnúcles femenins para frmar el embrión N curre en la naturaleza, per puede ser resultad de una activación artificial del vcit (partengénesis) y supresión de la eliminación del segund crpúscul plar Partengénesis Activación del vcit y el desarrll sin participación del espermatzide Estads de desarrll en bvin (Tiemp relativ del inici de estr, estr = 0 h día 0) Fecundación (30 hr) Cigt (34 hr) definid cuand el prnúcle esta presente División 2 cell (62 h, día 2) 4 cell (75 h, día 3) 8 cell (90 h, día 3) 16 cell (120 h, día 4) Mórula (día 5-7) Cuand curre la cmpactación Blastcist (día 7-10) tiene la cavidad llena de liquid, tiene la masa interna de células y el trfderm Eclsión (día 9-11) 6

8 Figura 4: Desarrll embrinari tempran del embrión de bvin y transprte en el tract reprductiv Cuestinari 1. Cmpletar el cuadr del infrme y cncluir 2. Cuál es la tería de frmación del blastcele? 3. Cuál es el tiemp del desarrll embrinari tempran en vin, cneja, marrana, human, ratón y alpaca 4. Cóm es el métd de recuperación de embrines en cabras? 5. Enumere el desarrll históric del éxit de la transferencia de embrines en mamífers? V. Recuperación, evaluación, clasificación y manipulación de embrines