INFLUENCIA DE EFECTOS ESTÉRICOS, ELECTRÓNICOS Y DE PRE-ORGANIZACIÓN MOLECULAR EN LA REACTIVIDAD DE - FENILETILAMINAS FRENTE A ALDEHIDOS NO ENOLIZABLES

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1 INFLUENCIA DE EFECTS ESTÉRICS, ELECTRÓNICS Y DE PRE-RGANIZACIÓN MLECULAR EN LA REACTIVIDAD DE - FENILETILAMINAS FRENTE A ALDEHIDS N ENLIZABLES Rodolfo Quevedo Profesor Asociado Departamento de Química Universidad Nacional de Colombia Facultad de Ciencias, Departamento de Química Bogotá D.C., Colombia 2014

2 1. INTRDUCCIÓN Las -feniletilaminas son de interés químico y biológico por ser precursores de gran variedad de compuestos de origen natural y sintético que incluyen alcaloides, neurotransmisores, alucinógenos, entre otros. Su estructura está conformada por un grupo amino unido a un anillo aromático por medio de un etileno (Figura 1). NH 2 Figura 1. -feniletilamina Alcaloides (bases nitrogenadas orgánicas) que presentan en su estructura una o más unidades de tipo hidroxifeniletilamina están relacionados con la protección de las plantas ante los actos predatorios de insectos, animales herbívoros y pueden ser tóxicos para los animales superiores. Se ha sugerido que algunos de ellos participan en el crecimiento de los vegetales por su capacidad de formar quelatos o intervenir en fenómenos de óxidoreducción. El átomo de nitrógeno de estos alcaloides es originario del aminoácido tirosina y en general la estructura carbonada del aminoácido es mantenida intacta en la estructura del alcaloide, mientras que el carbono del ácido carboxílico sufre descarboxilación. Un grupo interesante de derivados de -feniletilaminas de origen natural son los alcaloides benciltetrahidroisoquinolinicos que han mostrado un amplio rango de actividad biológica. Estas moléculas presentan uno o dos nucleos de -feniletilaminas haciendo parte de estructuras de mayor complejidad (Figura 2). 1-4 De otro lado, una reacción en química orgánica se define como un proceso que involucra la ruptura y formación de enlaces. Cuando una molécula posee dos o más sitios reactivos y ocurre una reacción preferencialmente sobre uno de estos sitios, se habla de procesos selectivos; la direccionalidad de estos procesos selectivos se da tanto por efectos electrónicos como por factores estéricos o por combinación de los dos. 2

3 Feniletilamina CH 3 H 3 C N H H 3 C N CH 3 H 3 C N CH 3 CH 3 H H CH 3 CH 3 C H 3 N CH CH 3 Figura 2. Bisbenciltetrahidroisoquinolinas con actividad larvicida Efectos electrónicos son aquellos que involucran interacciones entre cargas ya sean puntuales (aniones y cationes) o parciales (núcleos con diferencias en densidad electrónica). Factores estéricos se refiere a la forma como se organizan espacialmente las moléculas donde la naturaleza química y el tamaño de los átomos o grupos que la conforman inciden en su distribución espacial generando competencia por el espacio a ocupar; este efecto incide en la direccionalidad de una reacción química. Con el fin de obtener nuevos compuestos con actividad larvicida que incluyeran en su estructura una o más núcleos de -feniletilamina, se inició el estudio de la reacción de - feniletilaminas con aldehídos no enolizables; en este trabajo se discute la importancia de efectos electrónicos y factores estéricos en el curso de la reacción y se presenta la preorganización molecular en moléculas de tipo 4-hidroxifeniletilamina como un tercer factor determinante en el curso de la reacción y su utilización en la síntesis de un novedoso grupo de compuestos macrocíclicos derivados de tirosina. 2. REACCIÓN DE DPAMINA CN ALDEHÍDS N ENLIZABLES 2.1. Reacción entre 3,4-dihidroxifeniletilamina (dopamina) y aldehídos. Con el fin de determinar si el núcleo heterocíclico presente en los alcaloides 1 y 2 es el responsable de la actividad biológica de este tipo de compuestos, se emprendió la 3

4 síntesis de algunos alcaloides tetrahidroisoquinolínicos que permitieran establecer posibles relaciones estructura-actividad larvicida y que adicionalmente pudieran servir de plataforma para la posterior síntesis de estructuras más complejas que puedan ser utilizados en el control de insectos. La reacción de Pictet-Spengler, 5 a pesar de que se conoce desde hace más de 100 años, continúa siendo la metodología más poderosa para la síntesis de derivados tetrahidroisoquinolínicos con importancia biológica. 6-7 Compuestos de tipo tetrahidroisoquinolina se obtienen usualmente por medio de una reacción de adición de una feniletilamina 3 a un compuesto carbonílico para formar una imina. La activación de esta imina por medio de la adición de un ácido promueve la formación de las respectivas tetrahidroisoquinolinas 4 por medio de una sustitución electrofílica aromática (Esquema 1). La reacción de Pictet-Spengler tradicionalmente se realiza en un disolvente aprótico con un catalizador ácido, usualmente ácido acético o trifluoroacético y ocurre más fácilmente cuando el anillo de la feniletilamina está activado por sustituyentes electrodonores sobre el carbono 3. 8 Esta reacción es regioselectiva hacia la posición orto menos impedida; sin embargo, siempre se obtienen mezclas de los dos regioisómeros probables (Esquema 1). NH 2 RCH CH 2 Cl 2 /H + NH + H NH H H R R 3 4 Esquema 1. Reacción de Pictet-Spengler En este trabajo se realizó la reacción entre hidrobromuro de dopamina 3a con varios aldehídos aromáticos utilizando metanol como disolvente y ácido acético como catalizador; en todos los casos se obtuvo la respectiva tetrahidroisoquinolina 4a-g en la forma de hidrobromuro con altos rendimientos (Esquema 2). Como se mencionó arriba, la reacción de Pictet-Spengler usualmente conduce a la obtención de la mezcla de los dos regioisómeros posibles, siendo mayoritario en la mayoría de los casos el producto de la 4

5 ciclación sobre la posición orto menos impedida; sin embargo, el proceso realizado en el laboratorio condujo en todos los casos a la formación de un único producto. Para la reacción entre aldehídos y dopamina 3a realizada en el laboratorio se esperaba como es usual una mezcla de los dos regioisómeros posibles; sin embargo, se observó regioselectividad total en todos los casos. Fue necesario buscar que factores dirigen la reacción hacia un único producto. Una primera explicación se basa en factores electrónicos de tal forma que el hidroxilo ubicado sobre el carbono 3 del anillo aromático active la posición 6 (Esquema 2) y dirija la sustitución electrofílica hacia ese punto de la hidroxifeniletilamina de partida. H H NH 2 + Br - H RCH 4a-g R H 3a + NH 3 Br - CH 3 H/H + X H NH 2 + Br - H R NH 2 + Br - a R= H- b R= c R= d R= 50% 35% 90% N 2 78% Cl H H e R= f R= g R= CH 3 63% CH 3 52% H 38% H Esquema 2. Síntesis de tetrahidroisoquinolinas a partir de dopamina 5

6 Para obtener mayor información sobre los efectos electrónicos presentes en la reacción entre dopamina 3a y aldehídos se calculó la distribución de cargas atómicas de Mulliken para una imina intermediaria de la reacción de Pictet-Spengler usando el programa PC- GAMESS con una base de cálculo B3LYP/6-31G**. Los resultados muestran mayor densidad electrónica sobre el carbono 6 ( ) que sobre el carbono 2 ( ) (Figura 3); la distribución de cargas observada muestra que la reacción de pictet-spengler está favorecida electrónicamente hacia el carbono 6 del anillo aromático de dopamina. Cálculos realizados para iminas provenientes de diferentes aldehídos con grupos electrodonores y electro-atractores mostraron patrones similares. Figura 3. Distribución de carga atómica de Mulliken para la imina intermediaria en la reacción de Pictet-Spengler Como se mencionó arriba, tradicionalmente la reacción de Pictet-Spengler a partir de feniletilaminas es regioselectiva, pero usualmente se obtiene la mezcla de los dos regioisómeros en diferentes proporciones, este comportamiento es consistente con los efectos electrónicos observados por medio de la distribución de carga de Mulliken pues los carbonos 2 y 6 están activados, siendo el carbono 6 el de mayor activación; sin embargo, en los experimentos realizados se observó regioselectividad total, solo se formó uno de los regioisómeros. Este comportamiento no puede ser justificado solo por los efectos electrónicos presentes, en este trabajo se propone que el uso de disolventes próticos (como metanol) incrementan la regioselectividad por efectos estéricos. El disolvente prótico empleado solvata los grupos polares presentes en la feniletilamina y el 6

7 impedimento esterico generado por dicha solvatación dirige la ciclación hacia el carbono menos impedido (carbono 6) Reacción de Pictet-Spengler entre 6,7-dimetoxifeniletilamina 5 y 3- nitrobenzaldehido La metodología empleada para la reacción de dopamina con aldehídos se utilizó para la reacción de 6,7-dimetoxifeniletilamina 5 con 3-nitrobenzaldehido; esta reacción no condujo a la tetrahidroisoquinolina esperada y solo se obtuvo la respetiva imina intermediaria 6 (Esquema 3). H 3 C H 3 C H 3 C H CH NH + 3 H/AcH H 3 C 2 Reflujo 5 6 N 2 N N 2 H 3 C H 3 C + NH 2 Cl - H 3 C 7 H 3 C N HCl 37 % Reflujo X N 2 N 2 H 3 C + NH 2 Cl - CH 3 N 2 Esquema 3. Reacción de 6,7-dimetoxifeniletilamina 5 con 3-nitrobenzaldehido 7

8 Los cálculos realizados para el compuesto 6 revelaron una distribución de carga de Mulliken similar a la observada para las iminas provenientes de dopamina. Este resultado permite proponer que la reacción con 6,7-dimetoxifeniletilamina 5 no ocurre porque la energía de activación para la ciclización para iminas con grupos metoxilo sobre el anillo aromático es mayor. Para confirmar esta hipótesis, la imina 6 se sometió a reflujo en HCl 37 % para superar la barrera de energía y obtener la respectiva tetrahidroisoquinolina 7; tras un corto tiempo de reacción la respetiva tetrahidroisoquinolina precipitó en el medio de reacción (Esquema 3). 9 Este experimento demuestra que la isoquinolina 7 con grupos metoxilo sobre el anillo aromático no se obtuvo bajo las condiciones experimentales iniciales por la alta energía de activación requerida para la substitución electrofílica aromática. A pesar de esto, al igual que en los casos anteriores, la reacción transcurrió con regioselectividad total. Este resultado indica que los factores estéricos producto de la solvatación son comunes tanto para hidroxifeniletilaminas como para metoxifeniletilaminas y muestra la importancia de la solvatación en los efectos estéricos que determinan la direccionalidad de la reacción de Pictet-Spengler. 3. REACCIÓN DE DERIVADS DE TIRSINA CN ALDEHÍDS N ENLIZABLES 3.1. Reacción de L-tirosina etil ester con aldehídos La importancia de factores estéricos y electrónicos en la regioselectividad de la reacción entre dopamina y aldehídos llevo a preguntar cuál será la influencia de los hidroxilos fenólicos en el curso de la reacción? Para responder a esta pregunta, se propuso realizar la reacción entre derivados de tirosina y aldehídos bajo las condiciones previamente utilizadas para la reacción de Pictet-Spengler, esperando obtener compuestos de tipo tetrahidroisoquinolina como se plantea en el esquema 4. H H NH 2 H RCH H + NH H R Esquema 4: Reacción de Pictet-Spengler esperada para L-tirosina 8

9 En este punto del análisis es necesario recordar la reacción de Mannich, reacción que involucra la combinación de formaldehído con amoníaco o una amina primaria o secundaria y un compuesto con hidrógenos activos (Esquema 5). Cuando los compuestos con hidrógenos activos son sustratos aromáticos como los índoles o los fenoles se habla de reacción de Mannich aromática. 10 Esquema 5. Reacción de Mannich En la reacción de Mannich aromática, los dos componentes que se requieren para la reacción con el sustrato aromático son una amina y un aldehído. Solo compuestos aromáticos ricos en electrones interactúan satisfactoriamente con los electrófilos relativamente débiles que funcionan como reactivos de Mannich. Compuestos carbocíclicos muy ricos en electrones tales como los fenoles, reaccionan bajo una amplia variedad de condiciones muy suaves; sin embargo, no es posible formular un conjunto general de condiciones de reacción y reactivos. El procedimiento clásico más frecuentemente usado involucra la mezcla de los tres componentes simultáneamente. 10 Cuando la reacción de Mannich se realiza con fenoles y aminas primarias conduce al producto de aminometilación regioselectiva a la posición orto. La reacción de la amina secundaria obtenida con una segunda molécula de aldehído lleva a la formación de un derivado cíclico tipo benzoxazina. Un amplio número de fenoles forman benzoxazinas con buenos rendimientos usando metilamina y formaldehído (Esquema 6). 10 Esquema 6. Formación de una 3,4-dihidro-2H-1,3-benzoxazina a partir de p-cresol, metilamina y formaldehído 9

10 Volviendo al estudio de la reacción entre derivados de tirosina y formaldehido; considerando que la tirosina es insoluble en disolventes orgánicos, se sintetizó primero el éster etílico de L-tirosina 8 (Esquema 7). Este derivado además de mejorar las características de solubilidad de la tirosina, puede favorecer la reacción de Pictet- Spengler. 11 Teniendo el éster de partida 8, se realizó la reacción con dos aldehídos aromáticos con diferente grado de electrofilia y con formaldehido, empleando las mismas condiciones experimentales empleadas previamente para la reacción de dopamina con aldehídos. H H + /C 2 H 5 H H NH 2 H NH 2 CH 3 8 Esquema 7. Esterificación de L-tirosina Tras 48 horas de calentamiento no se observó formación de producto con ninguno de los aldehídos aromáticos estudiados y solo se observó la precipitación de un compuesto de color blanco que resulto ser acetato de amonio del éster etílico de L-tirosina, producto de la reacción ácido-base del grupo amino del derivado de L-tirosina con el catalizador acido. La reacción con formaldehido al 37 % presentó un comportamiento diferente a los aldehidos aromáticos estudiados y condujo a la formación con bajo rendimiento de una nueva molécula macrocíclica de tipo ciclofano (molécula conformada por dos anillos aromáticos unidas por espaciadores corto) 9 (Esquema 8), producto de la condensación de dos unidades del éster etílico de L-tirosina 8 (Esquema 7) con cuatro de formaldehido. El compuesto 9 (Esquema 8) siempre se presentó como único producto soluble y fue obtenido con rendimientos cercanos al 5%, adicional al compuesto 9, se obtuvieron algunas resinas insolubles y tirosina producto de la hidrólisis del éster de partida. Dada la estructura novedosa del compuesto 9 (Esquema 8), se hizo necesario modificar las condiciones experimentales para obtener mejores rendimientos. La función del catalizador ácido en la reacción de Pictet-Spengler es la de aumentar la electrofilia de la 10

11 imina intermediaria por medio de la formación de un catión iminio y favorecer la sustitución electrofílica aromática; la otra posibilidad para este tipo de condensaciones es la de aumentar la nucleofilia del anillo aromático y de igual forma favorecer la sustitución electrofílica aromática, para el caso de los fenoles, esto se puede hacer por medio de la adición de una base fuerte para formar el anión enolato. Bajo estas nuevas condiciones experimentales, empleando NaH o KH como bases y sustituyendo el metanol inicialmente empleado como disolvente por isopropanol con el fin de favorecer la precipitación del producto se obtuvieron los mejores rendimientos de reacción (63%). CH 2 CH 3 HCH CH 2 CH 3 HCH/NaH H 3 CH 2 C N N H NH H 2 8 NH CH 2 CH 3 Esquema 8. Reacción de L-tirosina etil éster 8 con formaldehido Los resultados obtenidos para la reacción del éster etílico de l-tirosina 8 (Esquema 7) con formaldehido muestran la importancia de los factores electrónicos en el curso y la direccionalidad de la reacción de tal forma que compuestos que presentan anillos con las posiciones 2 y 6 fuertemente activadas como 3-hidroxifeniletilamina 3 o dopamina 3a cuando reaccionan con aldehídos llevan a la formación de productos de la reacción de Pictet-Spengler formando las correspondientes tetrahidroisoquinolinas pero cuando la reacción se realiza con 4-hidroxifeniletilaminas como 8 en donde las posiciones de mayor activación (mayor densidad electrónica) son los carbonos 3 y 5 no transcurre la reacción de Pictet-Spengler y se obtienen productos de condensación tipo Mannich aromática formando compuestos macrocíclicos conformados por un esqueleto pentacíclico conformado por dos unidades 3,4-dihidro-2H-1,3-benzoxazina unidos por dos puentes etileno 9 (Esquema 8). El nuevo esqueleto macrocíclico 9 se aisló como un sólido amorfo soluble en CHCl 3 y en CH 3 H e insoluble en agua y de más disolventes orgánicos de uso común, P.f ºC, su EI-MS (m/z ) corresponde a la fórmula molecular C 26 H 30 N 2 6 (calc ). El espectro de RMN 1 H exhibe en la región aromática las señales características de un anillo 11

12 1,2,4-trisustituido junto a las señales alifáticas provenientes del éster de partida, los hidrógenos diasterotópicos no presentan desplazamientos diferentes en este espectro. Se observan además cuatro nuevas señales originadas por las unidades N-CH 2 -ph y N-CH 2 - (Figura 4). La simplicidad de los espectros de RMN 1 H y 13 C indican alta simetría en la molécula. Las correlaciones observadas en el espectro de HMBC (Figura 5) entre el hidrógeno sobre carbono quiral con el carbono 2 (N-CH 2 -) y el carbono 4 (N-CH 2 -ph) del núcleo oxazínico confirman la obtención de una molécula macrocíclica conformada por dos unidades de tirosina producto de una condensación tipo Mannich de 2 moléculas de tirosina con cuatro de formaldehido. 3,72(66,2) 6,89(128,3) 3,00(35,9) H (172,2) 3,87(60,7) 6,67(116,6) (130,3) CH 3 1,01(13,9) 6,78(127,6) N 4,88;4,94(80,1) H H4,04 H H 4,22(48,0) (120,9) N (153,1) H 3 C 9 Figura 4. Datos espectroscópicos de RMN 1 H ( 13 C) ppm El espectro NESY muestra acoplamientos a través del espacio entre el hidrógeno sobre carbono quiral con los hidrógenos del grupo N-CH 2 -ph, con los hidrógenos del grupo N- CH 2 - y con el hidrógeno aromático en posición 3; adicionalmente los hidrógenos del grupo N-CH 2 -ph presentan acoplamientos con el hidrogeno aromático en posición 3, los acoplamientos anteriores permiten concluir que 9 es un compuesto tipo ciclofano donde los dos núcleos benzoxazínicos se encuentran paralelos, esta conformación es corroborada por los acoplamientos entre los hidrógenos bencílicos y los grupos N-CH 2 -ph y N-CH 2 -; para que se observen los anteriores acoplamientos el hidrógeno sobre carbono quiral debe estar en posición pseudo-axial y el grupo etiloxicarbonil en poición pseudo-ecuatorial (Figura 6). 12

13 13 N N CH 3 H 3 C Figura 5. Correlaciones en el espectro HMBC (H C) Figura 6. Espectro NESY del azaciclofano 9 N N H H H R H R H H H H H H H H H Ξ

14 La estructura optimizada del compuesto 9 mediante cálculos semi-empíricos usando MPAC 2009 correlaciona completamente con la información obtenida por medio del análisis espectroscópico. 12,13 La estructura optimizada muestra además que el anillo oxazinico adopta una conformación de semi-silla con los nitrógenos ubicados fuera del plano del anillo aromático hacia la cavidad del ciclofano y los carbonos entre el oxigeno y el nitrógeno en el anillo oxazínico están ubicados fuera del plano del anillo aromático hacia afuera de la cavidad (Figura 7). Figura 7. Estructura optimizada para el heterociclofano Generalización de la obtención de azaciclofanos por medio de la reacción entre derivados de tirosina y formaldehido. Con el fin de extender la aplicación de la metodología establecida para la síntesis del ciclofano 9, se realizó la reacción de tiramina 10, L-tirosina metil éster 11 y L-tirosina isopropil éster 12 con formaldehido bajo las mismas condiciones experimentales empleadas para la síntesis de 9. Esta reacción siguió el mismo comportamiento observado para el éster etilico de L-tirosina y produjo los respectivos azaciclofanos con alto rendimiento (85, 56 y >95 % respectivamente) (Esquema 9). Estos resultados muestran que la metodología desarrollada en nuestro grupo de investigación es aplicable para la obtención de un nuevo grupo de azaciclofanos a partir de derivados de L-tirosina. 14

15 R HCH/NaH R N N R H NH 2 R= H (85 %); CCH 3 (56 %); CCH 2 -CH 3 (63 %); CCH(CH 3 ) 2 (95 %) Esquema 9. Reacción general entre derivados de L-tirosina y formaldehido 3.3. Pre-organización molecular y su participación en la síntesis de ciclofanos Los ciclofanos son moléculas de interés por su potencial utilidad en tecnologías hemergentes y en los últimos años, el diseño y síntesis de nuevos receptores moleculares útiles para el reconocimiento selectivo de especies químicas ha llamado la atención de los grupos de investigación. Este tipo de moléculas están conformadas por anillos aromáticos unidos por grupos espaciadores y poseen características estructurales que les permiten actuar como anfitriones por su capacidad de atrapar huéspedes en su cavidad, por medio de interacciones no covalentes, 14 esta capacidad se observa tanto con moléculas orgánicas como con cationes metálicos y aniones, lo cual ha permitido su uso como quimiosensores. 12,13 Los ciclofanos usualmente se sintetizan por medio de procesos complejos de macrociclación que involucran varias etapas, el empleo de grupos protectores, soluciones a alta dilución o la formación de plantillas por medio de la adición de iones metálicos que presenten interacciones específicas a través de enlaces de coordinación con las subunidades previamente sintetizadas La metodología de síntesis de ciclofanos a partir de derivados de tirosina presentada en este trabajo no involucra ninguno de estos aspectos pues ocurre en un solo paso, se emplean soluciones acuosas a alta concentración y no se requiere de la formación de plantilla con metales de transición; adicionalmente, la direccionalidad de la reacción no se puede explicar satisfactoriamente por medio del análisis de factores electrónicos y efectos estéricos pues una reacción de 15

16 Mannich entre derivados de tirosina y formaldehido debería conducir a la formación de polímeros lineales como fue reportado el siglo pasado (Figura 8). 21,22 Surge ahora una nueva pregunta: Los factores electrónicos y efectos estéricos presentes en los esteres derivados de L-tirosina y en tiramina deberían dirigir su reacción con formaldehido hacia la formación de polímeros lineales como el representado en la Figura 8; sin embargo, se forman productos macrocíclicos de tipo ciclofano con altos rendimientos, Qué factores adicionales a los electrónicos y los estéricos gobiernan la direccionalidad de dicha reacción? Figura 8. Producto de la reacción de Mannich entre L-tirosina y formaldehído en medio básico. Como una posible respuesta al comportamiento observado se propone que debido al carácter anfótero de los derivados tipo éster de L-tirosina se puede presentar una preorganización de las moléculas en solución a través de puentes de hidrógeno intermoleculares entre los grupos amino y los grupos hidroxilo fenólico de dos moléculas del respectivo derivado de L-tirosina (esquema 10). Esquema 10. Posible pre-organización por auto-ensamblaje de las moléculas de derivados de L-tirosina a través de puentes de hidrógeno intermoleculares 16

17 Para confirmar esta hipótesis, se estudió la asociación por puentes de hidrógeno entre las moléculas de derivados tipo éster de L-tirosina. En particular, L-tirosina isopropil éster 12, por medio de métodos computacionales (cálculos semiempíricos PM6-DH + ), espectrometría de masas (técnica de electrospray ESI-HRMS), métodos espectroscópicos (resonancia magnética nuclear de protones RMN 1 H y espectroscopía infrarroja FT-IR), y análisis por difracción de rayos X de monocristal (DRX) Determinación de la constante de dimerización de éster isopropílico de L- tirosina en solución por medidas de RMN 1 H Se registraron espectros RMN 1 H de éster isopropílico de L-tirosina 12 a diferentes concentraciones (18 mm 203 mm) en CDCl 3 a K. Se seleccionó CDCl 3 como disolvente deuterado para poder observar los protones intercambiables (protones sobre los átomos de xigeno y Nitrógeno). Se encontró que el desplazamiento químico de la señal a 2,72 ppm (singlete ancho) (Figura 9), correspondiente a los protones involucrados en puentes de hidrógeno intermoleculares (H y NH), es sensible a la concentración. La variación en el desplazamiento químico se analizó asumiendo la formación de un dímero Las ecuaciones son las siguientes: Dimerización: Constante de dimerización: Balance de masa: Dónde : concentración total de éster isopropílico de L-tirosina 12, : concentración de monómero, : concentración de dímero. Desplazamiento químico: 17

18 Cuando una especie química se asocia a través de interacciones intermoleculares, los protones involucrados directamente en dicha interacción experimentan diferentes ambientes dando lugar a dos desplazamientos químicos diferentes en los espectros de RMN, y ; sin embargo, para un sistema que experimenta intercambio rápido de hidrogeno (es decir, tiempos de vida de milisegundos o menos), el entorno magnético experimentado por el protón se promedia sobre los entornos de los estados libre y enlazado, y se observa un singlete ancho, a una frecuencia que es el promedio ponderado del tiempo pasado en los dos estados. Esto conduce a la siguiente ecuación para la posición del singlete de RMN en condiciones de intercambio rápido: Donde y son las fracciones de la especie total en el estado libre y en uno o más estados enlazados, respectivamente. 27 Por lo tanto, para el modelo de dimerización se tiene: Donde es el desplazamiento químico medido experimentalmente (correspondiente a los protones involucrados en puentes de hidrógeno intermoleculares). y son los desplazamientos químicos de éster isopropílico de L-tirosina en estado libre (monómero) y enlazado (dímero), respectivamente. y son las fracciones de en la forma de monómero y dímero, respectivamente: Combinando las ecuaciones anteriores se obtienen las siguientes expresiones para la concentración de libre y el desplazamiento químico calculado : 18

19 Debido a que y no se pueden medir independientemente, se realizó un análisis de regresión no lineal por mínimos cuadrados con la herramienta SLVER de Excel. 23,28 Se minimizó la suma de cuadrados de los residuales,, para obtener los mejores valores de y. Para determinar la desviación estándar de cada uno de los parámetros de la regresión, así como el coeficiente de correlación (R 2 ), se aplicó el macro SolvStat.xls. 28 G H C B F E D D A Figura 9. Espectro RMN 1 H de éster isopropílico de L-tirosina 12 en CDCl 3 En la búsqueda de información sobre la posible asociación intermolecular del ester de tirosina 12, calculando la constante de dimerización de acuerdo al planteamiento anterior, se registraron espectros de RMN 1 H a diferentes concentraciones en CDCl 3 a 298 K (Figura 10), estos espectros mostraron que la señal correspondiente a los protones del hidroxilo fenólico y del grupo amino se desplaza hacia campo bajo cuando se aumenta la concentración. Este cambio en el desplazamiento químico se debe a un efecto de 19

20 desapantallamiento de los protones causado por la formación de puentes de hidrógeno intermoleculares. 203 mm A 133 mm 105 mm 72 mm 35 mm 18 mm (ppm) Figura 11. Espectros RMN concentraciones en CDCl 3 a 298 K 1 H de éster isopropílico de L-tirosina a diferentes 20

21 Desplazamiento químico (ppm) Una vez confirmada la asociación intermolecular por puentes de hidrógeno, se hizo necesario determinar si la asociación es para formar dímeros o es la formación de cadenas lineales que involucren más de dos unidades del ester 12. Para ello, se analizaron los datos de desplazamiento químico en función de la concentración, asumiendo un modelo de dimerización (Figura 11). Debido a que en la serie de espectros de RMN 1 H (Figura 10) y no se pueden medir independientemente, los datos de desplazamiento químico en función de la concentración se analizaron mediante una regresión no lineal por mínimos cuadrados para obtener la constante de dimerización (Figura 11). El valor del coeficiente de correlación ( ) permitió establecer que la asociación entre las moléculas de éster isopropílico de L-tirosina se ajusta bien al modelo de dimerización planteado. La magnitud de la constante de dimerización ( ) indicó que la formación de un dímero se favorece en el equilibrio (~98 % de dímero en el equilibrio), demostrando así la tendencia que tiene este compuesto hacia la pre-organización por medio de la formación de dímeros en solución. 4,00 A 3,80 3,60 3,40 3,20 3,00 K dimer = 37,99 ± 5,37 M -1 δ 1 = 1,17 ± 0,13 ppm δ 2 = 4,60 ± 0,03 ppm R 2 = 0, ,80 2,60 2,40 0,000 0,050 0,100 0,150 0,200 0,250 Concentración (M) Figura 11. Desplazamiento químico de los protones involucrados en puentes de hidrógeno intermoleculares (H y NH) en función de la concentración de éster isopropílico de L-tirosina 12 en CDCl 3 a 298 K. Se muestran los resultados del análisis de regresión no lineal por mínimos cuadrados para la determinación de la constante de dimerización. 21

22 La formación de dímeros en solución del éster 12 también se hizo evidente en el espectro de masas con la técnica de electrospray en el que se dos iones, el primero, [M-H] - a m/z 222,1088 (calcd. 222,1130) y el segundo, [2M-H] - a m/z 445,2256 (calcd. 445,2338; iones correspondientes al monómero y al dímero en solución. Además, no se observaron iones de intensidad apreciable a m/z mayores, lo que permite descartar la formación de complejos con más de dos unidades de éster. El análisis de los espectros de RMN y de masas del éster isopropílico de L-tirosina 12 permiten demostrar la asociación por puentes de hidrógeno que dan estabilidad a un dímero, pero este dímero puede corresponder tanto a la plantilla propuesta (Figura 12a) como a un arreglo lineal (Figura 12b) o un dímero cíclico (N H ) (Figura 12c). Con el fin de buscar el arreglo más probable se realizaron cálculos computacionales a las estructuras propuestas (Figuras 12a-c) empleando el método semiempírico de mecánica cuántica PM6-DH+, implementado en el software MPAC2009, versión W. 27 El método PM6-DH+ incluye correcciones empíricas para interacciones de dispersión (D) y puentes de hidrógeno (H) y se seleccionó debido a sus predicciones exactas de la energía de enlace, amplio rango de aplicabilidad, eficiencia computacional, y a su utilidad como una herramienta para la optimización Primero se optimizó la geometría molecular del éster isopropílico de L-tirosina 12 en el vacío (fase gaseosa), definiendo GNRM=0.01 como criterio para la optimización geométrica. Luego se optimizó, también en el vacío, la geometría de varios complejos que contienen dos unidades de éster isopropílico de L-tirosina unidas entre sí por puentes de hidrógeno intermoleculares (Figura 12). El dímero mostrado en la Figura 12a corresponde a la plantilla planteada en el Esquema 11. Estos cálculos también se realizaron para otros ésteres de L-tirosina: L-tirosina metil éster 11 y tirosina etil éster 8. Con las geometrías de mínima energía y mediante cálculos THERM se determinaron cantidades termodinámicas (entalpía estándar de formación, y entropía, ) a 298 K en el vacío (fase gaseosa) para el proceso de formación de los respectivos dímeros. La energía de interacción intermolecular ( ) o se calculó a partir de los calores de formación ( ) a 298 K para cada sistema. 22

23 (a) (b) (c) Figura 14. Posibles dímeros de éster isopropílico de L-tirosina formados a través de puentes de hidrógeno: (a) cíclico-plantilla ( como donor de protón), (b) arreglo lineal, y (c) cíclico (N como donor de protón). Para evaluar la estabilidad en solución de los posibles dímeros formados por el éster isopropílico de L-tirosina se realizaron cálculos de optimización en isopropanol empleando 23

24 el método CSM (Conductor-like Screening Model). El método CSM es útil para determinar la estabilidad de una variedad de especies en un entorno similar al de un disolvente. 27 Se usó una constante dieléctrica de 18,23 para simular isopropanol. El número de segmentos geométricos por átomo se fijó a 162 para generar la superficie poligonal conductora alrededor del sistema. De las tres posibilidades planteadas en la Figura 12, los cálculos realizados indicaron que el arreglo más probable es el planteado en la Figura 12a, arreglo que está favorecido energéticamente en el vacío. Esta estructura, es estabilizada por dos puentes de hidrógeno entre el grupo hidroxilo fenólico de una unidad y el grupo amino de la otra unidad ( H N) (Esquema 11) presentó menor energía comparada con la energía de dos moléculas del éster separadas. También presentó la menor energía frente a los otros posibles dímeros, el arreglo lineal (Figura 12b) y el dímero cíclico (con interacciones N H ) (Figura 12c). Adicionalmente, esta estructura mantiene las moléculas del éster en una conformación adecuada para asistir geométricamente la reacción de macrociclación entre derivados tipo éster de L-tirosina y formaldehído (Esquema 11). Esquema 11. Formación del dímero de éster isopropílico de L-tirosina 12 más probable (plantilla) a través de puentes de hidrógeno en solución Los valores de energía para el arreglo lineal (Figura 12b) y el dímero cíclico (N H ) (Figura 12c) también fueron menores en comparación a la energía de dos moléculas del éster separadas, lo que indica que también son arreglos estables, sin embargo, la energía de interacción intermolecular ( ), o calor generado ( ) en el proceso de formación de dichos dímeros, fue mayor para el dímero cíclico ( H N) (-20,210 kcal/mol). Este 24

25 dímero está más favorecido que el arreglo lineal porque presenta mayor número de interacciones estabilizantes, y que el dímero cíclico (N H ) porque la energía de puente de hidrógeno es mayor (-10,105 frente a -9,551 kcal/mol). En general, las magnitudes de las energías de puente de hidrógeno calculadas están en el rango de la energía de interacción observada para puentes de hidrógeno típicos (4-15 kcal/mol). 33,34 Los cálculos realizados simulando isopropanol como disolvente, empleando el método CSM, mostraron la misma tendencia que se observó en el vacío, demostrando así que el dímero cíclico ( H N) de éster isopropílico de L-tirosina (Figura 12a) también se favorece energéticamente en solución. La pre-organización por puentes de hidrogeno en este tipo de moléculas es determinante en el curso de la reacción frente a formaldehido; en esta plantilla, las moléculas interactúan por medio de sitios de enlace complementarios (reconocimiento), se organizan en el espacio, modificando así su reactividad (organización); y se transfiere la información de la disposición espacial al producto de reacción (transferencia de información). Los resultados de los cálculos de cantidades termodinámicas, a 298 K en el vacío, revelaron que la formación de la plantilla de éster isopropílico de L-tirosina (Figura 12a) es entrópicamente desfavorable por 8,471 kcal/mol. Sin embargo, el proceso es entálpicamente favorable (-20,210 kcal/mol), dando en total una energía libre favorable (- 11,739 kcal/mol). A pesar del costo entrópico en la orientación de las moléculas de éster hacia la formación de la plantilla, la energía de los puentes de hidrógeno que se forman puede compensar esto y es en gran parte responsable de que el proceso sea espontáneo. Adicionalmente se observó que la formación del arreglo lineal no es espontánea, porque el costo entrópico para unir dos moléculas de éster en una disposición lineal (12,297 kcal/mol) es mayor que la energía de interacción de un solo puente de hidrógeno (-11,978 kcal/mol). Se realizaron cálculos similares para los ésteres metílico 11 y etílico de L-tirosina 8 ; encontrándose que, al igual que se observó para el éster isopropílico 12, la formación de la plantilla es un proceso espontáneo. Teniendo en cuenta la evidencia espectroscópica y los resultados obtenidos por medio de cálculos computacionales se estableció que la direccionalidad de la reacción entre 25

26 derivados de tirosina y formaldehido es inducida por la pre-organización molecular a través de puentes de hidrogeno entre los grupos amino y los hidroxilos fenólicos de dos unidades de derivado de L-tirosina; la pre-organización molecular entre las dos moléculas mantiene a corta distancia el grupo amino de una de las moléculas con el grupo hidroxilo fenólico de otra de las moléculas y cuando se adiciona el formaldehído, en exceso, su carbono altamente electrofílico reacciona con los dos sitios nucleofílicos más cercanos, el nitrógeno de una de las unidades del derivado de L-tirosina y el anillo aromático de otra unidad. Los experimentos realizados muestran que la plantilla formada por puentes de hidrógeno impide la condensación hacia productos lineales (oligómeros y polímeros); por tanto, el macrociclo formado es un producto cinético y la pre-organización de las moléculas genera un efecto de plantilla cinético en la reacción. Los resultados presentados hasta aquí permiten demostrar que la síntesis de azaciclofanos a partir de derivados de tirosina es inducido por la formación espontánea de un dímero, favorecido energéticamente (mínimo termodinámico), que actúa como plantilla seguido por modificación covalente posterior para fijar el macrociclo (producto cinético). Debido a que la reacción de macrociclación observada es un proceso de condensación intermolecular y la plantilla dirige la reacción hacia el producto cíclico, no se requieren condiciones de alta dilución en la síntesis Análisis en el estado sólido Con el fin de observar las interacciones intermoleculares en estadio sólido, se analizó la estructura cristalina de éster isopropílico de L-tirosina, cristalizado desde isopropanol, por difracción de rayos X de monocristal (DRX). El compuesto cristaliza en un sistema ortorrómbico con un grupo espacial P (No. 19). La estructura molecular del compuesto se muestra en la Figura 13. La molécula adopta una conformación plegada llamada conformación en forma de U o escorpión, como lo muestran los ángulos de torsión C 1 C 2 C 3 C 4 (58,2 (3)º) y 2 C 1 C 2 C 3 (-95,9 (2)º). A pesar de la adopción de esta conformación, no hay evidencia de interacciones intramoleculares C H π significativas. En términos de la conformación general, la estructura del éster isopropílico de L-tirosina se asemeja a la de los análogos n-butílico y etílico, y difiere de la del éster metílico. 35,36 26

27 Figura 13. Diagrama RTEP del éster isopropílico de L-tirosina 12 En el cristal, las moléculas están unidas por puentes de hidrógeno intermoleculares fuertes, con el hidroxilo fenólico como donor de protón y el grupo amino como aceptor de protón ( H N 1,78(4) Å; N 2,736(3) Å; H N 167(3) ), formando cadenas helicoidales a lo largo del eje b (Figura 14). Entre las cadenas se observaron puentes de hidrógeno débiles, con el grupo amino comportándose como donor de protón y el hidroxilo fenólico como aceptor de protón: N1 H1N 3 (N H 2,27(2) Å; N 3,106(2) Å; N H 157(2) ) y N1 H2N 3 (N H 2,46(3) Å; N 3,336(3) Å; N H 171(2) ). También entre el hidrógeno unido al carbono quiral y el oxígeno del carbonilo: C2 H2 1 (C H 2,37 Å; C 3,314(3) Å; C H 159 ). No se observaron interacciones de apilamiento π en esta estructura. Se realizaron cálculos de punto simple (1SCF) a partir de las coordenadas cristalográficas del éster isopropílico de L-tirosina 12 (con el método PM6-DH+), resultando en la siguiente estimación para la energía de los puentes de hidrógeno fuertes: -7,097 kcal/mol ( H N). Estos resultados muestran que los puentes de hidrógeno H N dirigen el ensamble de esta estructura hacia la formación de cadenas, que a su vez se encuentran 27

28 estabilizadas en el empaquetamiento molecular del cristal por varios puentes de hidrógeno débiles entre ellas. Figura 14. Vista del empaquetamiento cristalino del éster isopropílico de L-tirosina. Los puentes de hidrógeno H N y N H se muestran como líneas discontinuas de color verde. Al comparar el empaquetamiento del éster 12 con el observado en las estructuras cristalinas de los ésteres metílico, etílico y n-butílico de L-tirosina, previamente reportadas, se encontró que en todos los casos, las moléculas están conectadas por puentes de hidrógeno fuertes, entre el hidroxilo fenólico como donor de protón y el átomo de nitrógeno del grupo amino como aceptor de protón, formando cadenas unidimensionales infinitas en zig-zag. En estado sólido no se observó la formación de la plantilla propuesta en solución para explicar la reacción de macrociclación observada entre derivados tipo éster de L-tirosina y formaldehido; sin embargo, ya que estos ésteres presentan el mismo comportamiento en estado sólido y en la reacción con formaldehído en solución, se puede proponer que las moléculas del respectivo éster en solución se re-organizan para formar la plantilla. 28

29 Además se puede plantear que esta re-organización es un proceso espontáneo dirigido por interacciones de puente de hidrógeno fuertes ( H N) Estudio de la pre-organización molecular de tiramina en el estado sólido y en solución Los estudios computacionales y espectroscópicos realizados con el éster isopropílico de tirosina 12 permitieron demostrar la pre-organización en solución a través de puentes de hidrógeno intermoleculares entre los grupos amino y los grupos hidroxilo fenólico de dos moléculas del respectivo derivado de L-tirosina como los promotores de la macrociclación observada. La tiramina 10 es un derivado de L-tirosina que conduce a la formación del respectivo azaciclofano con buenos rendimientos y el modelo más sencillo para el estudio de la pre-organización por medio de puentes de hidrógeno. Con el fin de obtener mayor información sobre las características moleculares de esta clase de aminas y particularmente sobre la naturaleza del hidroxilo fenólico y el grupo amino, y evaluar la posible formación de plantillas que favorecen procesos de macrociclación, se realizó el estudio de la estructura cristalina de tiramina 10 como base libre, determinada por análisis de difracción de rayos X de monocristal y de la asociación por puentes de hidrógeno entre las moléculas de tiramina en solución, realizado por medio de cálculos computacionales semiempíricos y espectrometría de masas con la técnica de electrospray Análisis en solución La pre-organización de tiramina en solución a través de puentes de hidrógeno intermoleculares se evaluó primero con cálculos semiempíricos utilizando el método PM6- DH+ implementado en el software MPAC2009, que también puede dar cuenta de los posibles efectos del disolvente con el método CSM. 29 Los cálculos mostraron que la formación de plantillas en el vacío a través de puentes de hidrógeno entre el grupo hidroxilo fenólico de una unidad de tiramina y el grupo amino de la otra unidad ( H N - 8,818 kcal/mol) está favorecida energéticamente (Figura 15), revelando así la tendencia que tiene este compuesto hacia la pre-organización por medio de la formación de dímeros. Los cálculos realizados empleando agua como disolvente mostraron la misma tendencia que se observó en el vacío. Se observó un comportamiento similar cuando esta 29

30 interacción fue modelada en etanol (Figura 15). Estos resultados sugieren que el disolvente no participa en la pre-organización molecular de tiramina. (a) (b) (c) Figura 15. Estructuras optimizadas para la plantilla de tiramina en (a) el vacío, (b) agua, y (c) etanol (PM6-DH+/CSM, MPAC2009 ). El estudio de la asociación por puentes de hidrógeno entre las moléculas de tiramina en solución también se realizó por medio de espectrometría de masas, con la técnica de electrospray. El espectro ESI-HRMS de tiramina en modo positivo mostró los iones: [M+H] + (m/z 138,0916, calcd. 138,0913) y [2M+H] + (m/z 275,1744, calcd. 275,1754). El ión [2M+H] + de menor intensidad corresponde a un dímero de tiramina. Este resultado muestra que la tiramina en solución se asocia por medio de puentes de hidrógeno que dan estabilidad a la plantilla propuesta (Esquema 15b) o a un arreglo lineal (Esquema 15c). De estas posibilidades, los cálculos computacionales indicaron que la formación de la plantilla se favorece en solución Análisis en estado sólido Para confirmar los resultados obtenidos en solución se analizó la estructura cristalina de tiramina como base libre cristalizada desde etanol por difracción de rayos X de monocristal (DRX). El compuesto cristaliza en un sistema triclínico con un grupo espacial P (No. 2). En la unidad asimétrica se presentan dos moléculas de tiramina independientes; sin embargo, la conformación de las dos moléculas es prácticamente la misma. Los ángulos diedros C 8 C 7 C 4 C 3 (102,14 ), N 1 C 8 C 7 C 4 (176,39 ) y H 1N N 1 C 8 C 7 (-177,45 ) indican que la cadena lateral de etilamina de la molécula de tiramina presenta una conformación anti con respecto a la rotación alrededor del enlace C 8 C 7. La conformación anti es asimétrica de acuerdo con la rotación alrededor del 30

31 enlace N 1 C 8. Finalmente, la conformación anti asimétrica es cis por la orientación relativa de los grupos NH 2 y H (Figura 16). Figura 16. Diagrama RTEP de tiramina. Los elipsoides están dibujados al 50% de probabilidad El empaquetamiento molecular consiste en un arreglo lineal de las moléculas de tiramina conectadas cabeza - cola por puentes de hidrógeno intermoleculares fuertes a lo largo del eje b, con el hidroxilo fenólico como donor de protón y el grupo amino como aceptor de protón ( H N 1,78(2) Å; N 2,718(2) Å; H N 171(2) ) (Figura 17). Adicionalmente, los arreglos lineales se conectan entre sí formando cadenas dobles que están estabilizadas por puentes de hidrógeno cabeza - cola débiles, con el grupo amino comportándose como donor de protón y el hidroxilo fenólico como aceptor de protón (N H 2,75(2) Å; N 3,560(2) Å; N H 150(2) ) (Figura 18). Se realizaron cálculos de punto simple (1SCF) a partir de las coordenadas cristalográficas de la tiramina (con el método PM6-DH+), resultando en las siguientes estimaciones para las energías de interacción intermolecular: -7,747 kcal/mol ( H N) y -4,756 kcal/mol (N H ). Estos resultados muestran que las interacciones por puentes de hidrógeno gobiernan la preorganización de esta estructura ordenada con la formación de cadenas dobles, y la cadena doble se estabiliza a través de un arreglo cíclico de puentes de hidrógeno entre unidades de tiramina vecinas (Figura 18). Esta organización entre dos cadenas en estado sólido favorece geométricamente la formación de plantillas en solución. 31

32 Figura 17. Celda unidad y red extendida de puentes de hidrógeno en la estructura cristalina de tiramina. Los átomos de hidrógeno se han omitido para mayor claridad Figura 18. Vista de la cadena doble observada en la estructura cristalina de tiramina. Al igual que lo observado para el ester 12, para tiramina 10 las interacciones a través de puentes de hidrógeno intermoleculares son importantes para la organización molecular tanto en estado sólido como en solución. En estado sólido no se observaron las plantillas propuestas para la formación de azaciclofanos, pero la asociación en cadenas dobles por interacciones cabeza - cola puede favorecer geométricamente la formación de plantillas en solución. 4. REACCIÓN DEL L-TIRSINA Y DE SU SAL DE TETRABUTILAMNI CN FRMALDEHID. 32

33 Una vez confirmada la influencia de la pre-organización molecular en la síntesi de azaciclofanos a partir de derivados de tirosina se hizo necesario abordar el estudio de la reacción entre tirosina y formaldehido. Los primeros estudios de esta reacción se a mediados del siglo pasado y allí se estableció que L-tirosina reacciona con dos equivalentes de formaldehído en medio alcalino para formar compuestos de alto peso molecular que no fueron caracterizados. 21,22 Con el objetivo de determinar la estructura de los productos mayoritarios de la reacción de L-tirosina con formaldehído y así establecer si se obtienen compuestos macrocíclicos tipo ciclofano o se favorecen estructuras oligoméricas lineales, en este trabajo se estudió la reacción de L-tirosina y de su derivado tipo sal de tetrabutilamonio con formaldehído en medio básico acuoso a temperatura ambiente, evaluando el efecto de la concentración de L-tirosina, el número de equivalentes de base, la cantidad de formaldehído y el tiempo de reacción Reacción de L-tirosina con formaldehído La síntesis de azaciclofanos por medio de la reacción de macrociclización de tiramina y de derivados tipo éster de L-tirosina con formaldehído se realiza en medio básico, empleando pequeñas cantidades de base; para estudiar la reacción de L-tirosina con formaldehído en medio acuoso se emplearon cantidades mayores de base (1-2 equiv NaH) para solubilizar el aminoácido y desprotonar el grupo amino en la forma zwitteriónica. Primero se llevó a cabo la reacción de L-tirosina con formaldehído a temperatura ambiente empleando dos equivalentes de NaH, exceso de formaldehído y L-tirosina 0,37 M durante 3 días. El análisis del espectro RMN 1 H en D 2 muestra varios grupos de señales que permitieron proponer la estructura 13 (esquema 12). Las señales en 6,87 6,32 ppm (m, 2H) son asignables a los protones aromáticos en posición meta al hidroxilo fenólico. En la región de 4,46 4,20 ppm (m, 2H) aparecen las señales correspondientes a los hidrógenos CH 2 de grupos hidroximetilo unidos a los anillos en posición orto al hidroxilo fenólico. Las señales de los protones del metileno enlazado al nitrógeno de una molécula de L-tirosina y al anillo aromático de otra molécula aparecen en 3,94 3,51 ppm (m, 2H). Las señales entre 3,30 3,12 ppm (m, 1H) confirmaron la presencia del protón unido al carbono quiral. Los protones diastereotópicos aparecieron en 2,78 2,21 ppm (m, 2H). En el espectro se observan señales anchas como multipletes, originadas 33

34 probablemente por una mezcla de productos de carácter polimérico con fórmula general (C 11 H 13 N 4 ) n, propuesta con base en el análisis elemental. La estructura 13 coincide con la reportada previamente por Brown, 21 quien realizó el experimento con dos equivalentes de formaldehído, permitiendo concluir que el exceso de formaldehído no incide en el curso de la reacción. Cuando se disminuyó la cantidad añadida de NaH hasta un equivalente y trabajando con dos equivalentes de formaldehído y L-tirosina 0,49 M durante 6 días, el espectro de RMN 1 H muestra señales que permiten proponer como producto mayoritario el compuesto 14. Adicional a las señales correspondientes al oligómero 14, se observan otras de menor intensidad entre 4,61 4,56 ppm (m) que son asignables a metilenos benzoxazínicos presentes en el oligómero 15, y señales entre 4,51 4,42 ppm (m) atribuibles a hidrógenos CH 2 de grupos metilol presentes en el oligómero 13. Estos resultados demuestran que el producto formado corresponde a una mezcla de oligómeros de 13, 14 y 15; además explican las diferencias de los porcentajes de C, H y N obtenidos por análisis elemental, con respecto a los calculados para el producto mayoritario 14. Al comparar la estructura del producto 14 (obtenido en la reacción de L-tirosina con formaldehído y un equivalente de NaH) con la del producto 13 (obtenido en la reacción usando dos equivalentes de NaH) se puede ver que el equivalente de base adicional mejora el carácter nucleofílico del fenol y favorece otra sustitución en posición orto al hidroxilo fenólico. Cuando se llevó a cabo la reacción bajo las mismas condiciones del experimento anterior pero disminuyendo la concentración de L-tirosina también se obtuvo el producto 14 como mayoritario y 13 y 15 como productos minoritarios. Adicional a los experimentos anteriores, se realizó la reacción empleando exceso de formaldehído, concentraciones diferentes de L-tirosina (0,39 M y 0,056 M) y manteniendo las demás condiciones de las reacciones anteriores. Los productos aislados en estos ensayos presentaron un comportamiento similar a los obtenidos en las reacciones que emplearon dos equivalentes de formaldehído y concentraciones de 0,49 M y 0,058 M de L-tirosina. La caracterización por espectroscopia infrarroja y análisis elemental permitieron proponer que en ambos ensayos la reacción conduce a una mezcla de oligómeros de 13, 14 y 15, con 14 como producto mayoritario. 34

35 Esquema 12. Reacción de L-tirosina con formaldehído en medio básico 9 Los resultados del estudio de la reacción de L-tirosina con formaldehído, empleando un equivalente de NaH y un tiempo de reacción de 6 días, mostraron que el curso de la reacción no se altera considerablemente al utilizar un exceso de formaldehído o concentraciones menores de L-tirosina; en todos los casos se obtuvo una mezcla de oligómeros con estructuras 13, 14 y 15 (esquema 12). De acuerdo a lo observado en el seguimiento hecho a las reacciones anteriores por CCD, se realizó la reacción durante 24 horas empleando dos equivalentes de formaldehído, un equivalente de NaH y L-tirosina 0,040 M. Pasado este tiempo, se observó L-tirosina de partida, un producto más retenido y no se observó formación considerable de la mezcla de oligómeros 13, 14 y 15 en el punto de siembra. La mezcla de reacción se filtró para retirar la L-tirosina en exceso y el filtrado se llevó a ph ~7 mediante la adición de HCl 0,2 M; observándose la formación de un precipitado. El precipitado se filtró, se lavó y se secó 35

36 a 50 C. Así, se aisló el compuesto 16 (esquema 12) como un sólido ligeramente amarillo y con un rendimiento del 20%. El compuesto 16 está conformado por tres unidades de L-tirosina unidas por dos grupos metileno. La estructura de este compuesto permite afirmar que la mezcla de compuestos observada a los dos días en las reacciones llevadas a cabo en condiciones diluidas corresponde a oligómeros de pocas unidades de L-tirosina (por ejemplo dos, tres o cuatro), y a mayores tiempos de reacción se van uniendo más unidades de L-tirosina entre sí hasta formar productos de varias unidades, con fórmula general (C 10 H 11 N 3 ) n (correspondiente a 14) y que quedan retenidos en el punto de siembra de las cromatoplacas de sílica gel. Todos los ensayos de la reacción de L-tirosina con formaldehído en medio básico acuoso a temperatura ambiente condujeron a la obtención de oligómeros lineales de estructura 13, 14, 15 y 16 y en ningún caso se observó la formación del azaciclofano 9 (esquema 12). Los intentos no llevaron a la macrociclización presumiblemente por la imposibilidad que tienen las moléculas de L-tirosina de pre-organizarse a través de puentes de hidrógeno en medio básico acuoso (esquema 13). Debido a la baja solubilidad de la tirosina, fue necesario adicionar uno o dos equivalentes de NaH al medio de reacción, tras la adición de base, la tirosina queda con carga neta negativa, y esto probablemente ocasiona que los aniones formados, en medio acuoso, prefieran estar solvatados por moléculas de agua y separados entre sí. Según esto, la plantilla propuesta para explicar la reacción de macrociclización observada entre derivados tipo éster de L-tirosina y formaldehído no se favorece en medio básico acuoso para L-tirosina Reacción de L-tirosinato de tetrabutilamonio con formaldehído Considerando que las sales de amonio cuaternario de aminoácidos son solubles en disolventes orgánicos (en especial las sales de tetra-n-butilamonio) y tienen el grupo amino libre, se sintetizó L-tirosinato de tetrabutilamonio 17, una sal de amonio cuaternario de L-tirosina, para estudiar la reacción de ésta con formaldehído en un disolvente orgánico. 36

37 L-tirosinato de tetrabutilamonio 17 se obtuvo con buen rendimiento (98%) como un sólido higroscópico de color crema. El compuesto funde con descomposición en el rango C, y es soluble en acetonitrilo y DMS. El espectro ESI-MS en CH 3 CN mostró en modo positivo el ión [C 16 H 36 N] + a m/z 242,10 (calcd. 242,28). En modo negativo se encontró el ión [C 9 H 10 N 3 ] - a m/z 179,75 (calcd. 180,07), la estructura de 17 se confirmó por análisis elemental, presentando una estructura de monohidrato (Figura 19). Esquema 3. Comportamiento propuesto de L-tirosina en medio básico acuoso 17 Figura 19. Estructura de la sal de tetrabutilamonio de L-tirosina 17 La reacción de 17 con formaldehido se realizó en acetonitrilo a temperatura ambiente, empleando dos equivalentes de formaldehído y concentración de 0,17 M de 17 durante 24 horas. El producto obtenido fue un sólido ligeramente amarillo que funde en el rango C. El espectro de masas ESI-MS de este producto en modo negativo mostró 37

38 principalmente el ión [C 19 H 22 N 2 6 -H] - a m/z 373,00 (calcd. 373,14) correspondiente al compuesto 18 (esquema 14). Además se observó el ión [C 29 H 33 N 3 9 -H] - a m/z 566,30 (calcd. 566,21), como un pico de menor intensidad, correspondiente al compuesto 16. Estos resultados muestran que la reacción de la sal de tetrabutilamonio de L-tirosina 17 con formaldehído por 24 horas, conduce a una mezcla de oligómeros de dos y tres unidades de L-tirosina unidas entre sí por grupos metileno (compuestos 18 y 16 respectivamente) (esquema 14). Las intensidades de los picos observados en el espectro de masas (ESI-MS) muestran que en esta reacción se favorece la formación de un dímero de L-tirosina 18 a diferencia de lo observado en la reacción realizada con L-tirosina en medio básico acuoso en la que el producto mayoritario es el trímero 16. La reacción de 17 con formaldehido a mayores concentraciones presentó el mismo comportamiento y en todos los casos se obtuvo 18 como producto mayoritario. Este comportamiento se debe probablemente a que 17 existe como un par iónico en disolución y el catión voluminoso de tetrabutilamonio genera un impedimento estérico haciendo más lenta la reacción de las unidades de L-tirosina con formaldehído Esquema 14. Reacción de L-tirosinato de tetrabutilamonio 17 con formaldehído 38

39 La reacción de 17 con una concentración de 0,12 M, tiempo de reacción de 3 días y manteniendo las demás condiciones de la reacción anterior condujo al producto 14 como mayoritario y a 15 como producto minoritario (esquema 14). A diferencia de la reacción realizada con L-tirosina en medio básico acuoso, no se observaron señales asignables a 13 ya que en la reacción de 17 con formaldehído no se adiciona una base que mejore el carácter nucleofílico del fenol y favorezca otra sustitución en posición orto al hidroxilo fenólico. Los resultados del estudio de la reacción de L-tirosinato de tetrabutilamonio con dos equivalentes de formaldehído en acetonitrilo, al igual que los resultados obtenidos en la reacción de L-tirosina con formaldehído en medio básico acuoso, mostraron que la formación de oligómeros lineales de estructura general 14 está favorecida y en ningún caso se observó la formación del azaciclofano 9 (esquema 14). Este comportamiento se puede explicar en términos de la pre-organización de las moléculas en disolución. El espectro ESI-MS de 17 en CH 3 CN mostró en modo negativo el ión [C 34 H 56 N 3 6 ] - a m/z 602,35 (calcd. 602,42) asignable a la estructura 19 mostrada en la figura Figura 20. Estructura del ión [C 34 H 56 N 3 6 ] - La estructura 19 muestra que se forman pares iónicos que se asocian entre sí formando arreglos lineales, estabilizados por interacciones electrostáticas, minimizando de esta forma repulsiones estéricas (esquema 15). La formación de arreglos lineales entre las moléculas de 17 favorece la condensación hacia productos lineales y no es posible obtener el producto de macrociclización esperado. 5. FACTRES ELECTRÓNICS Y DE PRE-RGANIZACIÓN EN AZACICLFANS DERIVADS DE L-TIRSINA 39

40 A lo largo de este trabajo se ha mostrado la importancia de los factores electrónicos y los efectos estéricos en la reacción de compuestos de tipo hidroxifeniletilamina con aldehídos de tal forma que cuando se trabaja con dopamina (3,4-dihidroxifeniletilamina) 3a los factores electrónicos conducen regioselectivamente a la formación de tetrahidroisoquinolinas via reacción de Pictet-Spengler pero cuando se trabaja con disolventes polares se introducen efectos estéricos por solvatación que contribuyen con la direccionalidad de la reacción permitiendo obtener las respectivas tetrahidroisoquinolinas con regioselectividad total. Esquema 15. Comportamiento propuesto de L-tirosinato de tetrabutilamonio 7 en acetonitrilo Cuando se trabaja con derivados de tirosina de tipo 4-hidroxifeniletilamina los factores electrónicos dirigen la reacción hacia una condensación tipo Mannich aromática y no se detectan productos de la reacción de Pictet-Spengler; en esta reacción se observa una pre-organización por medio de puentes de hidrógeno que determina el curso de la reacción favoreciendo un proceso de macrociclización que conduce a la obtención de un nuevo grupo de macrociclos de tipo azaciclofano estereoquímicamente puros. Cuando no es posible la pre-organización molecular como en el caso de L-tirosina y de su sal de 40

41 tetrabutilamonio, se obtienen mezclas complejas de oligómeros lineales producto de una reacción tipo Mannich aromática. Los resultados presentados hasta ahora muestran que la dopamina (3,4- dihidroxifeniletilamina) presenta el mismo comportamiento tanto con formaldehido como con aldehídos aromáticos que son menos electrofilicos, a diferencia de la dopamina, los derivados tipo ester de tirosina no reaccionan con aldehídos aromáticos y en general se recupera el ester de partida y tirosina como producto de hidrolisis del ester de partida. Con el fin de obtener mayor conocimiento sobre los efectos electrónicos causados por la presencia de grupos hidroxilo sobre el anillo aromático en el curso de la reacción de β- feniletilaminas con aldehídos no enolizables, se realizó el estudio de tiramina (anillo 4- hidroxilado) 10 y de feniletilamina (anillo sin hidroxilos) 20 con el fin de compararlos con los resultados previamente presentados para dopamina. Inicialmente se hicieron cálculos computacionales de optimización de geometría en el programa Firefly versión 8.0,5 basado parcialmente en el código de GAMESS (US), 38 al nivel de teoría DFT-B3LYP/6-31G(d,p); la combinación de este método ab initio y dicha base es apropiada para la predicción de estructura en moléculas similares. 39 El análisis de orbitales moleculares frontera en el anillo aromático para las tres aminas modelo mostró diferencias notables (figura 21): en 20 el anillo contribuye poco al orbital HM, en 3a y 10 (aminas hidroxiladas) los anillos aromáticos presentan alta participación en sus respectivos orbitales HM; adicionalmente, los HM de 3a y 10 permiten observar que en 10 las posiciones más activadas son las orto- al grupo hidroxilo (posiciones C-3 y C-5) mientras que para 3a la posición más activada es C-6. Las diferencias electrónicas observadas por medio del análisis de los orbitales moleculares (figura 21) para los compuestos 3a, 10 y 20 correlacionan completamente con lo observado experimentalmente para la reacción con formaldehido. El orbital HM de la feniletilamina 20 muestra como sitio de mayor nucleofilia el grupo amino, cuando esta se hizo reaccionar con formaldehido se obtuvo el aminal cíclico 1,3,5- trifenilhexahidro-1,3,5-triazina 21 producto la reacción de tres moles de feniletilamina con tres moles de formaldehido. 40 El orbital HM de la feniletilamina 10 muestra como sitios de mayor nucleofilia los carbonos orto al hidroxilo fenólico (C-3 y C-5), la reacción con 41

42 formaldehido sobre uno de estos carbonos por medio de una condensación tipo Mannich aromatica conduce a la obtención de sitemas macrocíclicos de tipo azaciclofano 9. El orbital HM de la feniletilamina 3a muestra como la posición de mayor activación al carbono 6 y frente a formaldehido produce la respectiva tetrahidroisoquinolina 4 por medio de una reacción de Pictet-Spengler (esquema 16). Figura 21. HM de (a) fenetilamina 20, (b) tiramina 10 y (c) dopamina 3a (DFT- B3LYP/6-31G(d,p), isovalor = 0.05). Considerando las grandes diferencias observadas para la reacción de las feniletilaminas 3a, 10 y 20 con formaldehido, se hizo necesario explorar su reactividad frente a otros aldehídos no enolizables; para este estudio se seleccionaron: Benzaldehido 22a, un aldehído con sustituyentes electroatractores (3-nitrobenzaldehido 22b), un aldehído con sustituyentes electrodonores (vainillina 22c), un dialdehido (tereftaldehido 22d) y un aldehído α,β-insaturado (trans-cinamaldehído 22e). 42

43 Esquema 16. Reacción de feniletilaminas con fromaldehido Como se mencionó arriba, dopamina 3a reacciona con aldehídos aromáticos para producir tetrahidroisoquinolinas por medio de una reacción de Pictet-Spengler, tal como ocurrió con formaldehido. No ocurre lo mismo cuando se realiza la reacción con transcinamaldehído 22e, en este caso solo fue posible obtener la correspondiente imina intermediaria 23e con buenos rendimientos. Incluso cuando se trabajó bajo condiciones experimentales fuertes (reflujo en HCl 37 %) no fue posible obtener la tetrahidroisoquinolina respectiva (Esquema 17). La formación de la tetrahidroisoquinolina no se ve favorecida en este caso probablemente por la conjugación de 23e que disminuye la electrofilia del carbono e impide la reacción de adición nucleofilica. La reacción de las feniletilaminas 10 y 20 con los aldehídos en estudio presentaron el mismo comportamiento y en todos los casos solo fue posible obtener las correspondientes iminas (24a-e y 25a-e) (esquema 17, tabla 1). Este comportamiento permite concluir que la nucleofilia de los anillos aromáticos en estas dos feniletilaminas es baja y no favorecen la sustitución electrofilica aromática necesaria para la formación de tetrahidroisoquinolinas. De igual forma, la electrofilia de las iminas (24a-e y 25a-e) es baja para generar amínales o azaciclofanos benzoxazínicos por medio de reacciones de adición nucleofilica, como sí ocurrió en las reacciones con formaldehído. 43

44 Como se observa en la tabla 1, en general los rendimientos no se ven afectados por la presencia de grupos electroatractores o electrodonores en el aldehído; sin embargo, los rendimientos obtenidos para 20 son en general mucho mayores que los obtenidos para 10 y 3a. El análisis de los orbitales HM de las tres aminas estudiadas mostró grandes diferencias en la contribución del átomo de nitrógeno (figura 21). En 20, el átomo de nitrógeno contribuye mayoritariamente al HM; los correspondientes orbitales en las aminas hidroxiladas (10-3a) no presentan contribución del nitrógeno. La disminución en la contribución del átomo de nitrógeno al orbital HM a medida que aumenta el grado de hidroxilación del anillo puede estar relacionado con menor carácter nucleofílico de la amina y explica la disminución en los rendimientos de reacción en 10 y 3a frente a la reacción con 20. R 2 R 1 NH R 4a-d: R 1 = H R 2 = H R'-CH 22a-e R 2 R 1 20: R 1 = H R 2 = H 10: R 1 = H R 2 = H 3a: R 1 = H R 2 = H NH 2 R'-CH 7a-e R 23e: R 1 = H R 2 = H 24a-e: R 1 = H R 2 = H 25a-e: R 1 = H R 2 = H N R' 4a: R = Ph-; 4b: R = 3-N 2 -Ph-; 4c: R = 4-H-3-Me-Ph-; 4d: R = -Ph-; 4e: R = Ph-CH=CH- Esquema 17. Reacción β-feniletilaminas con aldehídos (22a-e). Tabla 1. Reacción de β-feniletilaminas con aldehídos (22a-e) (productos y rendimientos). R-CH Feniletilamina (rend. %) Tiramina (rend. %) Dopamina (rend. %) Ph- (22a) 24a (54 %) 25a (62 %) 3-N 2 -Ph- (22b) 24b (98 %) 25b (60 %) 4b (90 %) 3-Me-4-H-Ph- 24c (91 %) 25c (80 %) 4c (38 %) (22c) (1,4)-C 6 H 4 - (22d) 24d (100 %) 25d (94 %) 4d (35 %) (E)-Ph-CH=CH- (22e) 24e (90 %) 25e (46 %) 23e (83 %) 44

45 En un intento por obtener las tetrahidroisoquinolinas correspondientes, las iminas 24b y 23e se sometieron a reflujo por largos tiempos en metanol empleando ácido acético como catalizador, simulando las condiciones experimentales previamente utilizadas con dopamina. En ninguno de los casos se observó transformación alguna y siempre se recuperaron las iminas de partida. En la imina 23b la pobre activación del anillo de feniletilamina desfavorece la sustitución electrofilica aromática necesaria para la ciclación y en la imina 23e la conjugación de la imina α,β-insaturada impone barreras energéticas altas para la adición nucleofilica, aún con la alta activación del anillo de dopamina. En un intento por forzar la ciclización de una imina de tiramina hacia la tetrahidroisoquinolina, se trató la imina 25a con HCl concentrado (37%) a reflujo; incluso bajo condiciones experimentales fuertes como en este caso, no fue posible lograr que la ciclación de Pictet- Spengler. Estos resultados demuestran que para que la ciclación de Pictet-spengler ocurra es necesario que el carbono 3 del anillo de feniletilamina este fuertemente activado. Las diferencias en la reactividad de las β-feniletilaminas (fenetilamina, tiramina y dopamina) frente a formaldehído generan un aminal cíclico, un azaciclofano y una tetrahidroisoquinolina, respectivamente; estas diferencias en reactividad son generadas por diferentes grados de activación del anillo aromático y diferente nucleofilia sobre el nitrógeno. La reacción con otros aldehídos no enolizables menos reactivos solo ocurre con la amina que presenta el anillo con mayor activación (dopamina) generando las respectivas tetrahidroisoquinolinas; la reacción con las -feniletilaminas con anillos menos activados solo conducen a las respectivas bases de Schiff. Los cálculos computacionales muestran que a mayor grado de hidroxilación sobre el anillo, menor nucleofilia del nitrógeno gracias a efectos inductivos; sin embargo, si los hidroxilos fenólicos se protegen, el efecto inductivo disminuye y la nucleofilia del nitrógeno aumenta. 6. SÍNTESIS DE BENCILAZACICLFANS Los resultados obtenidos en nuestro grupo de investigación muestran claramente la influencia de efectos electrónicos, factores estéricos y la pre-organización molecular en el curso de la reacción entre -feniletilaminas y aldehídos. El número y posición de 45

46 hidroxilos sobre el anillo aromático juegan un papel importante en el curso de la reacción pues inciden directamente sobre el grado y posición de activación del anillo y adicionalmente alteran la nucleofilia del nitrógeno. Surge ahora la pregunta, Cuál será la influencia de sustituyentes sobre el nitrógeno? Se afectará la direccionalidad de la reacción de -feniletilaminas con aldehídos? Para responder a estas preguntas se seleccionó como experimento modelo la reacción de N-benciltiraminas con formaldehído. Primero se evaluó la formación de plantillas por medio de cálculos computacionales semiempíricos (PM6-DH+/CSM) analizando las asociaciones intermoleculares de N-benciltiramina 26 por puentes de hidrógeno H N para determinar la posibilidad de formación de dímeros cíclicos que dirijan la reacción hacia el proceso de macrociclización. Con este fin se calculó la energía de asociación (ΔE) de la siguiente forma: ΔE = ΔHf(dímero) 2ΔHf(monómero) Se encontró que para N-benciltiramina 26 se favorece energéticamente la formación de dímeros cíclicos frente a la asociación en forma de dímeros lineales, tanto en vacío como en etanol y en agua como disolventes. Adicionalmente se estableció que los medios próticos (agua y etanol) favorecen la formación de plantillas incrementando el carácter iónico de los puentes de hidrógeno (mayor longitud de enlace H y menor distancia H N). Una vez confirmado por cálculos computacionales que la formación de plantillas en solución esta favorecida energéticamente. Se sintetizó N.benciltiramina 26 por medio de una reacción de aminación reductiva entre tiramina 10 y benzaldehído. Paso segudi, se realizó la reacción entre 26 y formaldehido bajo las condiciones previamente establecidas para la síntesis del azaciclofano 9. El análisis espectroscópico (RMN 1D y 2D) y de espectrometría de masas (ESI-HRMS y EI-MS) permitió establecer que el producto mayoritario corresponde a un nuevo macrociclo de tipo azaciclofano conformado por dos unidades de N-benciltiramina unidas por dos grupos metileno 27 (esquema 18). El espectro de RMN 1 H muestra señales anchas en las regiones esperadas para los hidrógenos bencílicos, etilenicos y aromáticos, este comportamiento puede ser causa del 46

47 alto número de hidrógenos similares magnéticamente y a la posible presencia de isómeros conformacionales. El espectro de RMN 13 C solo muestra 4 señales en la región alifática, dos señales correspondientes a los carbonos etilenicos provenientes de la tiramina y dos correspondientes a los carbonos bencílicos, uno proveniente de la bencilamina de partida y el otro que corresponde al nuevo metileno formado por la reacción con formaldehido, adicional a estas señales, en la región aromática se observan las señales esperadas para los dos sistemas aromáticos. Esquema 18. Secuencia sintética de N-bencilciclofano 27 desde tiramina El bajo número de señales observado en los espectros de RMN muestra simetría en la molécula, cálculos de optimización de geometría (B3LYP/6-31G(d,p)) mostraron simetría C2 por la presencia de un eje de a través de los anillos aromáticos, haciendo que los grupos N-bencilo, con libre rotación, se fijen en la misma conformación simplificando el número de señales obtenidas en RMN. La estructura optimizada también muestra que los anillos aromáticos del macrociclo están cara-a-cara, generando una cavidad de 3.6 Å con los átomos de nitrógeno con sus pares electrónicos libres dirigidos hacia la parte interna de la cavidad formando puentes de hidrógeno con los grupos hidroxilo fenólicos (figura 27). Dichos puentes de hidrógeno intramoleculares en 27 se evidencian en su espectro infrarrojo, observándose una absorción ancha en cm-1. La síntesis de 27 muestra que un bencil-sustituyente no influye ni en la reactividad ni en la pre-organización de -feniletilaminas 4-hidroxiladas y se obtuvo un nuevo azaciclofano de tipo N-bencilazaciclofano. Para confirmar esta hipótesis se sintetizaron dos nuevas N- benciltiraminas, una con un sustituyente electrodonor (N-(4-metoxibencil)tiramina) 28 y 47

48 otra con un sustituyente electroatractor (N-(3-nitrobencil)tiramina) 29, y se hicieron reaccionar con formaldehído. La reacción con la amina 28 condujo a la formación del respectivo N-bencilazaciclofano 30 con buen rendimiento (esquema 18). La reacción con la amina 29 presentó un comportamiento diferente, necesito de mayores tiempos de reacción y produjo una mezcla compleja de la que se pudieron aislar con bajos rendimientos, dos compuestos lineales N-metilados, el primero de ellos corresponde a la bencilamina 29 N-metilada (31) y el segundo a un dimero producto de la reacción de dos unidades de bencilamina 29 con una de formaldehido, sobre uno de los nitrógenos del dímero también ocurrió metilación (32) (esquema 19), la formación de los productos N- metilados probablemente siguió el mecanismo propuesto para la reacción de Eschweiler- Clarke que involucra la participación de ácido fórmico como agente reductor formado in situ por la oxidación del formaldehido. 41 a b Figura 1. Estructura optimizada del N-bencilazaciclofano fenólico 27 ((a) vista frontal, (b) vista superior). 48