DESARROLLO DE NUEVAS ESTRATEGIAS PARA LA GENERACIÓN DE CÉLULAS PRODUCTORAS DE INSULINA A PARTIR DE CÉLULAS SOMÁTICAS Y PLURIPOTENTES INDUCIDAS

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1 DESARROLLO DE NUEVAS ESTRATEGIAS PARA LA GENERACIÓN DE CÉLULAS PRODUCTORAS DE INSULINA A PARTIR DE CÉLULAS SOMÁTICAS Y PLURIPOTENTES INDUCIDAS Rosa Gasa Arnaldich Institut d'investigació Biomèdica August Pi i Sunyer Sylvia Bedford CMRB Centre Medicina Regenerativa de Barcelona

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3 1. Resumen del proyecto La pérdida de células β pancreáticas causa la diabetes tipo 1 (DT1). La terapia celular es una alternativa prometedora a las inyecciones diarias de insulina para el tratamiento de esta enfermedad. En la actualidad la única fuente de células β son los islotes pancreáticos procedentes de donantes, pero su disponibilidad es limitada. El desarrollo de terapias basadas en el uso de células madre, embrionarias e inducidas (o ipsc) ha abierto la esperanza a una cura para la diabetes, pero los protocolos de diferenciación dirigida no son lo suficientemente eficientes y las células β generadas son inmaduras desde el punto de vista funcional. Los mecanismos epigenéticos son claves en la determinación del linaje celular. Entre estos, la metilación de las histonas altera la estructura de la cromatina y regula los cambios de perfiles transcripcionales asociados a los programas de diferenciación. Propusimos que la modulación de estas modificaciones epigenéticas podría ser una estrategia para promover el destino β en protocolos de diferenciación dirigida a partir de células madre. Por otra parte, la utilización de células pluripotentes como fuente de células β para el trasplante conlleva el riesgo de tumorogénesis asociado a estados de pluripotencia. Por esta razón, en el marco de este proyecto también hemos investigado la posibilidad de convertir fibroblastos del piel humanos en células productoras de insulina mediante el proceso de reprogramación o transdiferenciación directa (sin pasar por un estado intermedio de pluripotencia) combinando factores de transcripción promotores de linaje β con moduladores de la cromatina. 2. Resultados El factor epigenético Jarid2 participa en la diferenciación terminal de las células β durante el desarrollo embrionario. Hemos observado que los progenitores endocrinos pancreáticos embrionarios están enriquecidos en el factor epigenético Jarid2 y que la expresión génica de este factor está modulada positivamente por el factor proendocrino Neurogenina3 in vitro. La eliminación de Jarid2 en progenitores pancreáticos murinos resulta en una disminución de la masa celular β al nacer y en intolerancia a la glucosa en la edad adulta. Mediante el estudio de perfiles transcripcionales globales en el páncreas de embriones control y 3

4 embriones deficientes en Jarid2, hemos concluido que este factor es necesario para la activación adecuada de genes que codifican proteínas involucradas en la función β pero no para la de genes involucrados en la activación inicial del programa de diferenciación endocrino-pancreático. Este papel es independiente de cambios en la marca de histonas represiva H3K27m3 y se asocia a una disminución de la deposición de la RNA polimerasa fosforilada en Ser5 en la región promotora de los genes afectados. Los reguladores de la marca represiva H3K27me3 participan en la actividad transcripcional del factor proendocrino Neurogenina3. La actividad proendocrina del factor de transcripción Neurogenina3 se asocia a la pérdida de la marca represiva H3K27me3 en las regiones promotoras de sus genes diana. Investigamos la relevancia de este cambio en la cromatina sobre la actividad transactivadora de este factor. La inhibición de las demetilasas Jmjd3/Utx bloquea la actividad transcripcional de Neurogenina3 en células en cultivo. Al contrario, la inhibición de la metiltransferasa EZH2 permite un mayor grado de activación de los genes diana de Neurogenina3. Generación de células ipsc de dos pacientes con DT1. A partir de biopsias dermales de dos pacientes con DT1 se obtuvieron clones de células ipsc (uno por paciente) mediante tecnología de reprogramación retroviral clásica. Para mejorar el potencial traslacional de estas células se hicieron nuevas reprogramaciones con métodos no-integrativos, primero con virus tipo Sendai y luego mediante electroporación con vectores episomales. Una vez caracterizados, todos estos clones se han registrado en el Banco Nacional de Células. Protocolo de diferenciación dirigida a célula β a partir de células pluripotentes. Hemos establecido un protocolo de diferenciación dirigida hacia células β a partir de células pluripotentes que sigue cinco estadios secuenciales con una duración total de 21 días. El protocolo incluye modificaciones puntuales a protocolos publicados que mejoran la eficiencia de formación de células β. Este protocolo funciona con células madre embrionarias, células ipsc controles y células ipsc de DT1 (generadas en el marco de este proyecto). La adición de inhibidores de la metiltransferasa EZH2 en el estadio previo al estadio de formación de progenitores pancreáticos (estadio 3) aumenta el número de células β al final del protocolo. 4

5 Establecimiento de un protocolo de transdiferenciación de fibroblastos humanos hacia células productoras de insulina. Hemos establecido un protocolo de transdiferenciación de fibroblastos hacia células productoras de insulina basado en la introducción de cinco factores de transcripción que son importantes para la diferenciación y funcionalidad de las células β. En un plazo de 10 días tras la introducción de los primeros factores, se alcanzan niveles de expresión del gen de la insulina del orden de 10 6 veces sobre el control y unas 100 veces menor que la expresión en islotes humanos aislados. No solo se activa el gen de la insulina sino que también se induce la expresión de genes de diferenciación y de genes marcadores de células β diferenciadas. Estas activaciones génicas van acompañadas de la represión de genes característicos de fibroblastos, confirmando así el cambio de linaje celular. Junto a estas líneas se muestran imágenes de inmunofluorescencia con anticuerpos específicos para insulina y péptido C (derivado del procesamiento de la proinsulina). Puede observarse la tinción citoplasmática (en rojo) para estos dos marcadores en fibroblastos reprogramados y no en fibroblastos controles. En azul se muestran los núcleos celulares. Los resultados derivados de este proyecto se han presentado en los siguientes congresos: EASD Islet Study Group: Beta-cell Regeneration and Genome Regulation. Sitges, 2013 Cervantes S, Fontcuberta Pi-Sunyer M, Tutusaus A, Sánchez L, Lee Y and Gasa R. Exploring the potential role of Jarid2 in pancreatic endocrine cell formation Congreso Anual de la Sociedad Española de Diabetes. Valencia, 2015 Fontcuberta Pi-Sunyer M, Cervantes S, García A, Sánchez L, Gomis R and Gasa R. Uso the inhibidores epigenéticos para la mejora de la diferenciación endocrina in vitro Annual Meeting of the European Association for the Study of Diabetes, Stockholm

6 Fontcuberta Pi-Sunyer M, Cervantes S, García A, Sánchez L, Gomis R and Gasa R. Use of epigenetic inhibitors to modulate endocrine differentiation Congreso Anual de la Sociedad Española de Diabetes. Barcelona, 2017 Fontcuberta Pi-Sunyer M, Cervantes S, Sánchez L, Soler A, Montserrat N, Novials A, Gomis R and Gasa R. Generación de celulas productoras de insulina a partir de cèlulas de la piel. 3. Relevancia y posibles implicaciones Conseguir un control glucémico adecuado es un hito terapéutico básico en el tratamiento de la diabetes. En este sentido, la terapia celular sustitutiva dirigida a restituir la masa β perdida con nuevas células β sustitutas es una de las estrategias más prometedoras que puede conducir a la curación definitiva de esta enfermedad. Idealmente, las células sustitutas deberían poderse derivar a partir de fuentes celulares de fácil obtención y renovables como podrían ser las células madre embrionarias o células pluripotentes inducidas (ipsc) generadas a partir de fibroblastos. Aunque en los últimos años se han producido grandes avances en el diseño de protocolos de diferenciación dirigida a partir de células pluripotentes, los actuales protocolos son aún ineficientes y las células β obtenidas son funcionalmente inmaduras. Nuestros resultados sobre el uso de inhibidores de la metiltransferasa EZH2 y la función del regulador epigenético Jarid2 abren la posibilidad de mejorar los protocolos aplicando estos nuevos conocimientos. Por otra parte, el uso de células ipsc generadas a partir de fibroblastos de piel del propio paciente como fuente de células β para el trasplante abre la puerta a la posibilidad de realizar autotrasplantes (el paciente recibe sus propias células), evitándose así el riesgo de rechazo del injerto. A pesar de ello, emplear células que han pasado por un estadio de pluripotencia lleva asociado el riesgo de tumorogénesis. En este sentido, nuestro protocolo de reprogramación directa de fibroblastos de piel con factores de transcripción endocrinos supondría una mejora, pues se evitaría tanto el rechazo (trasplante autólogo) como el riesgo de tumores. Creemos que este descubrimiento abre la puerta a investigar y optimizar protocolos de reprogramación 6

7 directa como estrategia alternativa para generar células β sustitutas para la curación de la diabetes. 7