03/05/2011. Depto. Biofísica Facultad de Medicina CONTROL DEL CICLO CELULAR Y

Transcripción

1 CONTROL DEL CICLO CELULAR: CONTROL DEL CICLO CELULAR Y REPARACIÓN DEL ADN La transición de una fase del ciclo a la siguiente requiere que se completen una serie de eventos: bioquímicos morfológicos y genéticos Depto. Biofísica Facultad de Medicina Son genes que controlan la inducción y activación de complejos ciclina-cdk. ESFUNO ESCUELAS, UTI BCyT 2011 A través de la citometría de flujo se puede estudiar la respuesta a diversos agentes en poblaciones celulares normales y mutantes. Las células tumorales descienden de un ancestro común por el inicio indebido de un programa de división celular. La transformación maligna de una célula acontece por acumulación de mutaciones en genes específicos agrupados en 2 familias: Protooncogenes: dirigen la producción de proteínas como ciclinas y factores de crecimiento, que estimulan la proliferación celular. Cuando mutan se transforman en oncogenes, orquestando la multiplicación anárquica de las células. 1

2 Supresores tumorales: que en el organismo sano controlan la proliferación celular. Cuando no están presentes o se encuentran inactivos por mutaciones, las células dejan de crecer normalmente y adquieren propiedades proliferativas anormales. Los supresores tumorales frenan la progresión del ciclo en forma reversible o irreversible, a través de la inhibición directa o indirecta de los complejos ciclina-cdk. Gen p53 (control G1/S): desempeña un papel importante en apoptosis y control del ciclo celular. Su mutante luego de irradiada no detiene su progresión en el ciclo (mutación, amplificación génica y transformación maligna). Una vez activado p53: o bien podrá inducir un paro en el cc para permitir la reparación o inducirá apoptosis para eliminar i el daño en la célula. Síndrome de Li-Fraumeni: los individuos con este síndrome tienen un mayor riesgo para desarrollar cánceres primarios múltiples, donde un 50% de los pacientes muestran una mutación del gentp53. Las lesiones producidas en el ADN por distintos agentes pueden repararse con cierta probabilidad, dependiendo de factores: genéticos metabólicos ambientales Involucran sistemas enzimáticos y se encuentran presentes desde virus hasta mamíferos, incluso células tumorales. Importancia de la reparación: estabilidad del genoma mutagénesis biodiversidad envejecimiento (acumulación de errores) transformación maligna muerte celular REPARACIÓN DEL ADN: Mecanismos simples de reparación (reversión directa del daño). Dentro de este se encuentra: a.reparación por fotoreactivación b.reparación de bases alquiladas c.replicación del ADN glicosilado Mecanismos complejos de reparación: a.reparación escisional (de nucleótido, de base o de base mal apareadas) b.reparación de bases mal apareadas (mismatch) c.reparación recombinacional d.reparación post-replicativa 2

3 Reparación por fotoreactivación: Repara dímeros de bases producidos por UV, a través de la absorción de luz visible para romper los enlaces covalentes. Las enzimas asociadas son fotoliasas que reconocen la lesión. Conservada en la escala biológica desde virus a mamíferos, pero no es universal, los humanos carecemos de este mecanismo. Reparación de bases alquiladas: La metilación de la guanina, cuyo producto O 6 - metilguanina, forma pares de bases complementarias con la timina, en lugar de citosina. La reparación se lleva a cabo por una enzima suicida. Reparación del ADN glicosilado: La ADN glicosilasa separa la base dañada y se forma un sitio apirimidínico o apurínico (sitio AP) en el ADN. La AP endonucleasa retira el azúcar y fosfato del nucleótido, la ADN polimerasa I rellena la brecha, y la ADN ligasa sella la cadena principal. Reparación Escisional: Repara lesiones producidas por radiación UV, roturas simples y de doble cadena. Implica: Reconocimiento y demarcación de la lesión Separación del segmento marcado Corte del segmento Síntesis de nueva porción por polimerasas Unión a la cadena por ligasas 3

4 En humanos, el trastorno conocido como Xeroderma pigmentosum se caracteriza por la incapacidad de reparar los dímeros de timina producto de la exposición a UV. Mutación autosómica recesiva. Se caracteriza por: Reparación de bases mal apareadas (mismatch): El reconocimiento de los desapareamientos se basa en la distorsión de la doble hélice. Se reconoce la hebra recién sintetizada y se elimina la base mal apareada. Hipersensibilidad a radiaciones UV Alta incidencia de cáncer de piel Atrofia retiniana Baja estatura Trastornos neurológicos Otras patologías asociadas a alteraciones en la reparación escisional: Síndrome de PIBIDS: Síndrome de Cockayne: fotosensibilidad ictiosis, pelo quebradizo retardo mental esterilidad fotosensibilidad retardo de crecimiento retardo mental envejecimiento prematuro no asociado al cáncer El Síndrome de Cockayne puede servir como elemento de conexión entre dos modelos actuales que explican el envejecimiento: deficiencia en la reparación (con baja probabilidad de error) y acumulación de lesiones por radicales libres (principalmente en genoma e interfases: membranas mitocondrial y nuclear). 4

5 Tanto la mutagénesis como la oncogénesis son procesos estocásticos, su probabilidad de ocurrencia aumenta linealmente con la dosis. Reparación Recombinacional: Involucrada en la reparación de roturas dobles de cadena (DSBs) en el ADN producidas por radiaciones ionizantes y radiomiméticos. El modelo actual implica el reconocimiento de las DSBs por complejo enzimático ATP-dependiente, catalizando el intercambio entre secuencias homólogas. En las células eucariotas es necesaria la presencia de las proteínas Ku que permiten el intercambio con secuencias no homólogas (lo que llevaría a la mutación). Replicación postreplicativa: Reconoce errores en la hebra de ADN recientemente sintetizada y sin metilar. En procariotas este tipo de reparación se llama respuesta SOS yseponeenmarchapararesolverun daño tan grave que la muerte celular es la única alternativa. 5

6 MÉTODOS DE ESTUDIO DE LA REPARACIÓN: Entre los más importantes a nivel poblacional: Análisis de sobrevida y rendimiento mutagénico en función de la dosis Distintos tipos de lesiones pueden detectarse con electroforesis de distintos tipos y cromatografía EPR: reparación con error, EFR: reparación sin error. Los signos (-) indican deficiencias de reparación (mutantes). La comparación de cepas salvajes con mutantes sensibles a nivel de sobrevida y mutagénesis permite sacar conclusiones sobre: los sistemas de reparación involucrados y su magnitud así como de las relaciones entre vías de reparación La técnica de electroforesis por campos pulsados transversales y alternados (TAFE) permite detectar dobles roturas de cadena en el ADN. se hace migrar el ADN de células tratadas y no tratadas sobre una matriz en respuesta a un campo eléctrico el número de DSBs dependerá de la relación entre los picos (tratados vs controles) asumiendo la distribución de Poisson). 6

7 Preguntas control (wt, mutantes) wt +[BLM] = 0.5 µg/ml chk1/chk1 +[BLM] = 0.5 µg/ml rad17/rad17 +[BLM] = 0.5 µg/ml 1. Cuáles es la función de los supresores tumorales? 2. Cómo incide la mutación de p53 en la cinética celular luego de la exposición a radiaciones? 3. Qué deficiencias presentan los pacientes portadores de Xeroderma pigmentosum?? 4. Describa brevemente que sistemas de reparación del ADN conoce. 5. Qué métodos de estudio utilizaría para evaluar los mecanismos de reparación? Densitogramas de ADN y corrida correspondiente, t = 0h. 7