EL ENSAYO INMUNOSORBENTE ENZIMA-CONJUGADA (ELISA) EN EL DIAGNOSTICO DE ROTAVIRUS. Dr. Alberto Simhon, y Dr. Leonardo Mata INTRODUCCION CUADRO 1

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1 Rev. Med. Hosp. Na!. Nll"\os 12(2): 73 78,1977 EL ENSAYO INMUNOSORBENTE ENZIMA-CONJUGADA (ELISA) EN EL DIAGNOSTICO DE ROTAVIRUS Dr. Salvador Amato*, Dr. Robert H. Yolken** Dr. Alberto Simhon*, y Dr. Leonardo Mata* INTRODUCCION La creciente importancia que los rotaviru'& tienen en: las llamadas diarreas ines~ pecíficas (3,6) ha llevado al desarrollo de diversas técnicas de laboratorio para es~ tudiar el papel de esos vírus en la etiología de la diarrea. El método clásico para el diagn6stico de rotavirus era la microscopía electrónica (7). Luego se implementaron desde la fijación del complemento hasta el radioinmunoensayo (9,2,4,14,11,12, 17,8), (Cuadro 1), A excepción del radioinmunoensayo, todas las técnicas mues~ tran una menor sensibilidad que la microscopía el~ctrónica en la detección de rota virus en muestras de heces. El radioinmunoensayo ofrece dificultades de otra índole tales como 'a necesidad de un contador de centelleo t el empleo de radioisótopos y la limitada duración del reactivo marcado. CUADRO 1 TECNICAS PARA EL ESTUDIO DE ROTAVIRUS Técnica Referencia 1) Microscopía electrónica 2) Fijación de complemento 3) Inmunofluorescencia en cultivo de tejidos 4) Inmunofluorescencia en mucosa duodenal 5) Inmunoelectroosmoforesis 6) Contrainmunoelectroosmoforesis 7) Precipitación del virus.fluorescente 8) Inmunofluorescencia en heces 9) Radioinmunoensayo 10) ELlSA Flewett et al., 1974 (7) Kapikian et al., 1975 (9) Banatvala et al., 1975 (2) Davidson etal., 1975 (4) Tufvesson y Johnsson, 1976 (14) Middleton et al., 1976 (11) Peterson el at (12) Yolken et al., 1977 (17) Kalica et al., 1977 (8) Yolken et al., 1977 (18) * Instituto de Investigaciones en Salud (INISAl, Universidad de Costa Rica, Costa Rica y Ministerio de Salud, Costa Rica. ** Instituto Nacional de Alergia y Enfermedades Infecciosas, Instituto Nacional de Salud, Bethesda, Marvland, E.E.U.U. 73

2 14 REY ISTA MEDiCA DEL HOSPITAL NACIONAL DE NIKlOS DR. CARLOS SAENZ HERRERA El ensayo inmunosorbente enzima-eonjugada (5) ha sido recientemente adapta do por Yolken et al. (16) al estudio de los rotavlrus. El propósito de este informe es describir el fundamento y la técnica del ELISA y su importencia en el diagnósti ca de rotavirus. Fundamanto del ELISA Las proteínas, en condiciones apropiadas de ph, se adhieren a ia superficie de polivinilo de bandejas Microtiter. Sobre la proteína adsorbida {en este caso un anticuerpo) se lleva a cabo una reacción antígeno-anticuerpo y a este complejo se agrega un conjugado de inmunoglobulina-fosfatasa alcalina. Luego se agrega un sustrato adecuado y la hidrólisis de éste por la fosfatasa alcalina produce un color amarillo fácilmente apreciable. El conjugado inmunoglobulina fosfatasa alcalina tiene suma importancia. La reacción de con.densación se lleva a cabo sobre los grupos epsilon-amino de la Ii.ina y los grupos alfa-amino terminales de las proteínas reaetantes, a través de la formación de una base de Schiff; al glutaraldehido actúa como agente condensante (1). Dado que el conjugado debe poseer una alta actividad enzimática y una alta afinidad del anticuerpo por su antígeno, el cociente molar debe favorecer a la enzima en proporción de 3:1 Ó 4:1. Procedimiento La secuencia de pasos en la técnica aparece esquematizada en la Figura 1. Los materiales y reactivos requeridos se encuentran resumidos en el Apéndice. Para la realización del ensayo se emplean bandejas Microtitier (Cooke) con pocillos en "U", de polivinilo flexible y descartables. En cada bandeja se pueden estudiar 33 muestras por duplicado, un testigo positivo, un testigo negativo, y un testigo.ali no. La técnica empleada consiste en un "doble sandwich". Primera reacción antígeno-anticuerpo. En cada uno de los pocillos de las bandejas se colocan 100 ul de suero de cabra anti rotavirus dilu ido 1; en solución amortiguadora de carbonato a ph 9,6 (Figura 1, paso 1). La incubación de las ban dejas de 4 0 C durante toda la noche produce la adsorción del anticuerpo a la superficie de polivinilo. Después de este paso y de cada uno de los que siguen se lavan las bandejas tres veces con solución amortiguadora de fosfatos a ph 7.4, adicionada de Tween 20 al /0 (PBS-Tweenl. Seguidamente se agregan a cada pocillo 50 ~I de PBS-Tween adicionado de suero normal de cabra y suero fetal bovino, ambos al l%. Luego se añaden por duplicado 50 ~j de las suspensiones de heces al 200/0 en caldo infusión cerebro y corazón adicionado de albúmina sérica bovina al 0,50 /0 (Figura 1, paso 2). Otra incubación a 4 0 C durante toda la noche completa la prime ra reacción antígeno anticuerpo. Segunda reacci6n antígeno-anticuerpo. Se agregan 100}J1 de suero de cobayo antirotavirus diluído 1:800 en PBS Tween adicionado de suero normal de cabra al 0,5 0 /0 y suero fetal bovino al 10/0 (Figura 1, paso 3). Las bandejas se incuban a 37 C durante una hora completándose la segunda reacción andgeno-anticuerpo. Así se obtiene el "primer sandwich". esto es, el rotavirus entre dos capas de anti cuerpos. Si la muestra a analizar es rotavirus-negativa no se produce el sandwich y los pasos siguientes no se completan.

3 AMATO, S. et. al.: ELl5A EN EL DIAGNOSTICO DE ROTAVIRU$ 75 Tercera reaccián antígeno-anticuerpo. Se adicionan 100 JlI de suero de cabra anticobayo conjugado a la fosfatasa alcalina. El conjugado se diluye 1:400 en PBS Tween adicionado de suero normal de cabra al 0,5 % y suero fetal bovino al,%. Una nueva incubación de una hora a 37 0 C completa la tercera reacción antígeno-anticuerpo y queda constituído así el "doble sandwich" (Figura 1, paso 4), La formación del doble sandwich es una variante introducida por Yolken et al. (18) para amplificar el color resultante. El último paso consiste en añadir 100.&JI de sustrato p-nitrofenil fosfato en solución amortiguadora de dietanolamina a ph 9,8 (Figura 1, paso 5), Su hidrólisis por la fosfatasa alcalina al cabo de una incubación de 30 mino a 37 0 C genera un 1 suero cobro antirrotavirus l' horas 4 C 4 conjugada 1'400 I hora 37 C 2 muestra con rotav; rus 15 horas 4 C 5 sustrato ph min. 37 C 3 6 suero desarrollo cobayo de antirrotavirus 1,800 color J hora 37 C Figura 1 Diagrama esquemático de la secuencia de pasos del ELISA.

4 76 REVISTA MEDICA DEL HOSPITAL NACIONAL DE NIK.lOS DR. CARLOS SAENZ HERRERA color amarillo fácilmente detectable alojo desnudo -(Figura 1, paso 6t Si no aparece color amarillo la sucesión de pasos descritos no ha tenido lugar y se concluye que la muestra 'es rotavirus-negativa. Una muestra se define como positiva si al final del ensayo desarrolla un color de intensidad igualo mayor que el testigo positivo. A las muestras que aparecen dudosa~ (aquellas que desarrollan un color inter medio entre los testigos positivo y negativo) se les practica una prueba de bloqueo del antígeno, cuyo fundamento es el siguiente. Una muestra rotavirus-positiva es neutralizada por IC$ anticuerpos esl'er.íficos del suero convaleciente de ternero in fectado experi nentalmente con rotavirus humanos. Así, los rotavírus de la muestra de heces han sido bloqueados y no hay desarrollo de color. Paralelamente, si la misma muestra no es bloqueada por suero fetal bovino, el cual carece de anticuerpos anti-rotavirus, el antígeno se une al primer anticuerpo, y al completarse el ensayo, la muestra desarrolla color. Consecuentemente, una muestra dudosa se considera positiva si desarrolla color con el suero fetal bovino y a la vet es bloqueada po: el suero convaleciente. Comentario El ELlSA ha abierto grandes posibilidades en el campo de la virología. En el caso particular de las diarreas debidas a rotavirus se cuenta ahora con un ElISA sencillo, práctico y sensible. Su realización no requiere de aparatos costosos ni de tecnología complicada. Las muestras a analizar no necesitan de ninguna manipula ción e!'p'.!r:ial. Su costo es sumamente bajo ya que cada muestra cuesta aproximadamente dos colones con sesenta céntimos (US$O.331. El ELlSA presenta además la posibilidad de estudiar un gran número de muestras con gran econom ía de tiempo. En una!emana se pueden procesar mil muestras utilizando los servicios de un asistente de laboratorio y la supervisión de un profesional univ6:rsitario. Sin embargo: la mayor ventaja de la técnica reside en su sensibilidad, la cual es similar a la del radioinmunoensayo. En el INISA se ha realizado un estudio de pacientes diarréicos del Hospital Nacional de Niños "Dr. Carlos Sáenz Herrera" (10), admitidos en el periodo com prendido entre enero de 1976 y marzo de Como derivado de ese estudio se ha hecho la comparación entre la microscopía electrónica y el ELlSA en el diagnóstico de los rotavirus. El ELlSA permitió descubrir rotavirus en las heces de 5,70/0 niños que previamente habían resultado negativos por microscopía electrónica, siendo la diferencia estadísticamente significativa. La mayor eficiencia del ELISA en una comparación ciega con la microscopía electrónica, fue demostrada a lo largo de un año y medio de observación prospectiva (13).

5 AMATO. S. et. al,: EL.ISA EN El. DIAGNOSTICO DE ROTAVIRUS 71 Apéndice. Conjugado inmunoglobulina-fosfatasa alcalina, sueros y testigos. a. Conjugado inmunoglobulina fosfatasa alcalina. Su preparación se basó esencial~ mente en el método de Voller at al. (15). b. Suero de cabra antí rotavirus y suero de cobayo anti-rotavirus: preparado por R.H. Yolkan, NIA/O, NIH, Bethesda, Maryland, E.E.U.U. c. Testigo positivo: "Pool" de 15 extractos fecales positivos por rotavirus por microscopía electrónica y ELISA. Se determinó una dilución de trabajo aprapia~ da diluyendo al 20 /0 en caldo infusión cerebro y corazón adicionado de albúmina bovina al 0,5 0 /0. ch. Testigo negativo: "pool" de 15 extractos fecales negativos por rotavirus por mi eroscopia electrónica y ELISA. Se diluyó de igual forma que el testigo positivo. d. Otro, reactivo" según Voller et. al, (15). BIBLIOGRAFIA 1. Avrameas, S. Coupling of enzymes to proteins with glutaraldehyde: use of conjugat.,s for deteetion of antigens and antibodie,. Immunoehemi'try, 6:43, Banatvala, J.E., B. Totterdell, I.L. Chry'tie & G.N. Woode In-vitro detection of human rotaviruses. Lancet, ii: 821, Bi,hop, R.F., G.P. Oavid,on,I.H. Holmes & B.J. Ruek Viru, partiele, in epithelial eell, of duodenal mucosa from ehildren with acute non bacterial gastroenteritis. Lancet, ii: 1281, Oavidson, G.P., 1. Goller, R.F. Bi,hop, R.R.W. Townley, I.H. Holme" & B.J. Ruek Immunofluorescence in duodenal mucosa of children with acute enteritis due lo a new virus. J. CI/n. Pathol., 28: 263, Engvall, E. & P. Perlmann Enzyme~jnked immuno,orbent a,say (ELISAI Quantilalion of,oeei fic antibodies by enzyme-labeled anti immunoglcbijlin in antigen~oated tubos. J. Immunol., 109: 129, Flewett, T.H., A.S. Ílryden & H. Oavies Virus partic!es in gastroenteritis. Lancet, ii: 1497, Flewett, T.H., A.S. Bryden & H. Oavie, Diagnostic electron microscopy of faeees. l. The viral flora of the faeces as seen by electron microscopy. J. CI/n. Pathol., 27: 603, Kalica, A.R., R.H. Puroell, M.M. Sereno, R.G. Wyatt, H.W. Kim, R.M. Chanock & A.Z. Kapikian A microtiter salid-phase ra:dioimmunoassay for deteetion of the human reoviru,~ike agent in stools. J. Immunol., 118: 1275,1977.

6 78 REVISTA MEDICA DEL HOSPITAL NACiONAL DE NIr\iOS DR. CARLOSSAENZ HERRERA 9. Kapíkian, AZ., W.L. Cline. C.A. Mebus, R.G. Wyatt, A.R. Kalica, H.D. James, D. VanKirk, R.M. Chanock & H.W. Kim New complement fixation -"test for the human reovirus-iike agem of infantile gastroenteritis. Lancet, i: 1056, Mata. L.. C. Lizano. F. Hernández, e. Mohs, L. Herrero, M.E. Peñaranda, F. Gamboa & J. León Agentes infecciosos en la diarrea del niño hospitalizado en Costa Rica. Bol. Méd. Hosp. lnf. (Méx.l, 34: 955, Middleton, P.J. M. Petric, C.M. Hewitt, M.T. Szymanskí & J. S. Tam Counter-immunoelectro-osmophoresis for the detection af lnfantite gastroenteritis virus (orbi-grup) antigen and antibody. J. Clin. Pathol., 29: 191, Peterson, M.W., R.S. Spendlove & R.A. Smart Deteetion af naonatal calf diarrhoea virus, infant reovirus-iike diarrhoea virus, and a coronavirus using the fluorescent virus precipitin test. J. Clin. Microbiol.. 3: 376, Simhon, A. s.a. Amato, F. Hernández, R.H. Yolken, & L. Mata. Diagnóstico de rotavirus por microscopía electrónica y el ensayo inmunosorbente enzima-conjugada (EL ISA). Enviado a Bol. 01. San. Pan., Tufvesson, B & T. Johnsson Immunoelectraosmophoresis for detection of reo-like virus: methodology and comparison with electron microscopy. Acta Pathol. Microbio!. Scand. Sect. B, 84: 225, Voller. A.. D. Bidwell & A. Bartlett Mícroplate enzyme immunoassays for the immunodiagnosis of virus iofeetions. En: Manual 01 Clinical Microbiology. Ro.e, N. y H. Friedman (editores). American Societv lar Microbiology, Washington, D.C., p. 506, Yolken. R.H.. H.W. Kim. T. Clem, R.G. Wyatt, A.R. Kalica, R.M. Chanock & A. Z. Kapikian Enzyme-linked immuno.orbent a.say (ELISAI lar detection of human reovirus like agent 01 infantile gastroenteritis. Lancet, ii: Yolken, R.H., R.G. Wyatt, A.R. Kalica. H.W. Kim. C.D. Brandt, R.H. Parrott, A.Z. Kapikian & R.M. Chanock Use af free viral immunofluorescence assay to deteet human reovirus-iike agent in human stools. Infeetion Immunitv, 16: 467, Yolken R.H., R.G. Wyat& A.Z.'Kapikían. ELISA for rotaviru. Lancet, ii: