EL LIMÓN MEXICANO. (Citrus aurantifolia)

Transcripción

1 EL LIMÓN MEXICANO (Citrus aurantifolia) Mario Orozco-Santos, Marciano Manuel Robles-González, José Joaquín Velázquez- Monreal, Miguel Ángel Manzanilla-Ramírez, Manuel de Jesús Bermúdez-Guzmán, Silvia Heréndira Carrillo-Medrano, Víctor Manuel Medina-Urrutia, Luis Martín Hernández- Fuentes, Rafael Gómez-Jaimes, Gilberto Manzo-Sánchez, Javier Farías-Larios, Daniel Nieto-Ángel, Edgar Mijangos-Hernández, Julio Alejandro Sánchez-de la Torre y Sóstenes Varela-Fuentes Centro de Investigación Regional Pacífico Centro Campo Experimental Tecomán Tecomán, Colima, México. Noviembre de 2014 Libro Técnico Num. 1, ISBN:

2 SECRETARÍA DE AGRICULTURA, GANADERÍA, DESARROLLO RURAL, PESCA Y ALIMENTACIÓN Lic. Enrique Martínez y Martínez Secretario Lic. Jesús Aguilar Padilla Subsecretario de Agricultura Prof. Arturo Osornio Sánchez Subsecretario de Desarrollo Rural Lic. Ricardo Aguilar Castillo Subsecretario de Alimentación y Competitividad T.A. Carlos Salazar Preciado Delegado de la SAGARPA en Colima INSTITUTO NACIONAL DE INVESTIGACIONES FORESTALES, AGRÍCOLAS Y PECUARIAS Dr. Luis Fernando Flores Lui Director General Dr. Manuel Rafael Villa Issa Coordinador de Investigación, Innovación y Vinculación Dra. Bertha Patricia Zamora Morales Encargada del despacho de los asuntos de la Coordinación de Planeación y Desarrollo Mtro. Eduardo Francisco Berterame Barquín Coordinador de Administración y Sistemas Lic. Elisa Concepción Elguezabel Dávila Titular de la Unidad Jurídica CENTRO DE INVESTIGACIÓN REGIONAL PACÍFICO CENTRO Dr. José Antonio Rentería Flores Director Regional del CIRPAC Dr. Gerardo Salazar Gutiérrez Director de Investigación del CIRPAC MC. Primitivo Díaz Mederos Director de Planeación y Desarrollo Lic. Miguel Méndez González Director de Administración MC. Isaac Vizcaíno Vargas Director de Coordinación y Vinculación en Colima

3 EL LIMÓN MEXICANO (Citrus aurantifolia) EDITORES Mario Orozco-Santos Marciano Manuel Robles-González José Joaquín Velázquez-Monreal Miguel Ángel Manzanilla-Ramírez Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agrícolas y Pecuarias Centro de Investigación Regional Pacífico Centro Campo Experimental Tecomán Tecomán, Colima, México Noviembre del 2014

4 EL LIMÓN MEXICANO (Citrus aurantifolia) No está permitida la reproducción total o parcial de esta publicación, ni la transmisión de ninguna forma o por cualquier medio, ya sea electrónico, mecánico, por fotocopia, por registro u otros métodos, sin el permiso previo y por escrito de la institución. Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agrícolas y Pecuarias Progreso No. 5. Barrio de Santa Catarina. Delegación Coyoacán México, D.F. CP Teléfono: (55) conmutador Correo-e: contactenos@inifap.gob.mx Primera Edición: Noviembre de 2014 Impreso en México. Printed in México ISBN: Libro Técnico Núm.1 Noviembre de 2014 CAMPO EXPERIMENTAL TECOMAN Km. 35 carretera Colima-Manzanillo. Apartado postal 88 Tecomán, Colima, México. C.P Tel. y Fax: (313) y La presente publicación se terminó de imprimir en el mes de noviembre de 2014 en los Talleres Gráficos de Prometeo Editores, S.A. de C.V. Libertad 1457, Col. Americana, Guadalajara, Jalisco, C.P Tel. 01 (33) Su tiraje consta de 2000 ejemplares. La cita correcta de esta obra es: Orozco-Santos, M., Robles-González, M.M., Velázquez-Monreal, J.J., Manzanilla-Ramírez, M.A., Bermúdez-Guzmán, M.J., Carrillo-Medrano, S.H., Medina-Urrutia, V.M., Hernández- Fuentes, L.M., Gómez-Jaimes, R., Manzo-Sánchez, G., Farías-Larios, J., Nieto-Ángel, D., Mijangos-Hernández, E., Sánchez-de la Torre, J.A. y Varela-Fuentes, S El limón mexicano (Citrus aurantifolia). Libro Técnico Núm. 1. SAGARPA, INIFAP, CIRPAC, Campo Experimental Tecomán. Tecomán, Colima, México. 477 p.

5 AUTORES MC Manuel de Jesús Bermúdez-Guzmán Biotecnología INIFAP, Campo Experimental Tecomán Tecomán, Colima, México Dr. Javier Farías-Larios Manejo Agronómico Universidad de Colima, FCBA Tecomán, Colima, México MC Miguel Ángel Manzanilla-Ramírez Manejo Agronómico INIFAP, Campo Experimental Tecomán Tecomán, Colima, México Dr. Víctor Manuel Medina-Urrutia Fisiología Universidad de Guadalajara, CUCBA Zapopán, Jalisco, México Dr. Mario Orozco-Santos Fitopatología INIFAP, Campo Experimental Tecomán Tecomán, Colima, México MI Julio Alejandro Sánchez de la Torre Biotecnología Colaborador invitado Tecomán, Colima, México Dr. José Joaquín Velázquez-Monreal Fitopatología INIFAP, Campo Experimental Tecomán Tecomán, Colima, México Ing. Silvia Heréndira Carrillo-Medrano Biotecnología INIFAP, Campo Experimental Tecomán Tecomán, Colima, México Dr. Luis Martín Hernández-Fuentes Entomología INIFAP, Campo Experimental Santiago Ixcuintla Santiago Ixcuintla, Nayarit, México Gilberto Manzo-Sánchez Biotecnología Universidad de Colima, FCBA Tecomán, Colima, México Daniel Nieto-Ángel Enfermedades en postcosecha Colegio de Postgraduados Campus Montecillo Montecillo, Texcoco, edo. de México Dr. Marciano Manuel Robles-González Biotecnología INIFAP, Campo Experimental Tecomán Tecomán, Colima, México Dr. Sóstenes Varela-Fuentes Entomología Universidad Autónoma de Tamaulipas Cd. Victoria, Tamaulipas, México Ing. Edgar Mijangos-Hernández Manejo agronómico Colaborador invitado Tecomán, Colima, México Dr. Rafel Gómez-Jaimes Fitopatología INIFAP, Campo Experimental Santiago Ixcuintla Santiago Ixcuintla, Nayarit, México

6 PRÓLOGO Las cadenas productivas del sector agropecuario día con día están enfrentan nuevos retos para la incrementar la productividad y calidad de los cultivos en un escenario de apertura comercial y globalización de los mercados. El compromiso del Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agrícolas y Pecuarias (INIFAP) es generar conocimiento y desarrollar la tecnología necesaria para aumentar la productividad y calidad de los productos y con ello mejorar la competitividad de las cadenas de valor y los ingresos de los productores, sin olvidar el cuidado del ambiente y los recursos naturales. En la región costera del Pacífico de México se cultivan 83,317 ha con limón mexicano, [Citrus aurantifolia (Christm) Swingle. Los antecedentes de este cultivo en México demuestran que periódicamente se han enfrentado amenazas para su permanencia como actividad agrícola importante para Colima Michoacán, Guerrero y Oaxaca. Hasta 1970, la mayoría de las plantaciones de este cítrico en el país se establecían con árboles de pie franco y por lo tanto se vieron afectadas por la gomosis o pudrición de raíz, causado por Phytophthora parasítica (Dastur). Esta enfermedad provocaba la muerte de ramas y finalmente del árbol completo causando pérdidas de hasta el 30 % en el rendimiento en las plantaciones. En 1981 los árboles se vieron afectados por la bacteriosis la cual en su momento generó incertidumbre entre los productores y cierre de la frontera de Estados Unidos para la fruta cítrica proveniente de nuestro país, afectando así a todos los productores de cítricos mexicanos. En 1995 arribó y se estableció el minador de la hoja (Phyllocnistis citrella Stainton) que en los primeros años causó fuertes daños físicos a las hojas del limón mexicano y con ello una fuerte preocupación entre los productores. El virus de la tristeza de los cítricos se ha mantenido como amenaza latente para los cítricos en México, especialmente para el limón mexicano, que es altamente sensible a esta enfermedad viral. Se han detectado rasas suaves del virus y recientemente la presencia del pulgón café de los cítricos (Toxoptera citricida Kir.) vector del virus en varios estados productores de cítricos del país. El reto más reciente y tal vez el más complejo es la llegada a la región de la enfermedad del huanglongbing o HLB y que ha generado gran incertidumbre entre los productores y que aunque no ha sido tan devastadora como se pronosticó si está teniendo graves consecuencias para el cultivo y sido necesario modificar el manejo de las plantaciones principalmente lo relacionado con la nutrición de los árboles con el propósito de convivir con esta enfermedad y mantener la producción de limones. La investigación sobre limón mexicano en Colima se inicio en la década de los años 70s, lo cual ha permitido generar la tecnología necesaria para superar los problemas antes mencionados y generar un paquete tecnológico que sumado a la buena disposición de los productores, quienes lo han aceptado, ha ayudado a incrementar los rendimientos y la calidad de la fruta. Con la tecnología generada, el promedio estatal de rendimiento pasó de 10 Toneladas por hectárea que se obtenían en los años 70 s, a 23.9 toneladas por hectárea registradas en el En el presente libro El Limón mexicano (Citrus aurantifolia) se plasman los resultados de más 40 años de investigación, con la finalidad de aportar información para que los técnicos y los productores tengan elementos para

7 hacer un manejo sustentable del cultivo de limón mexicano. Se espera que sirva de guía lograr el manejo eficiente del cultivo y particularmente del HLB con el propósito de mantener la productividad de las plantaciones y mitigar los efectos de esta enfermedad. Con esta obra se espera contribuir con una parte importante de nuestra misión que es la de poner a disposición de productores, técnicos y tomadores de decisión los productos de la investigación. Atentamente Dr. Antonio Rentería Flores Director del CIRPAC

8 Capítulo 13 INTRODUCCIÓN Diagnóstico de Enfermedades Manuel de Jesús Bermúdez-Guzmán Mario Orozco-Santos Joaquín Velázquez-Monreal Miguel Ángel Manzanilla-Ramírez Marciano Manuel Robles González La mayor parte de las enfermedades en las plantas son ocasionadas por microorganismos infecciosos como hongos, bacterias, nematodos, protozoarios, fitoplasmas, virus y viroides. Los cítricos son los frutales que probablemente albergan la mayor cantidad de enfermedades, principalmente de origen viral, ya que estas pueden atacar ocasionar daños al cultivo desde vivero hasta la fase productiva. Los órganos o tejidos afectados son la raíz, tronco, ramas, hojas, flores y frutos. Actualmente en México la principal enfermedad de mayor importancia económica que afecta a los cítricos es el Huanglongbing (HLB) (Guzmán-Piedrahita et al., 2009; Muhammad et al., 2012). El diagnóstico de enfermedades implica la integración de conocimientos teóricos y prácticos sobre el hospedero, patógeno y condiciones ambientales en que se desarrolla la interacción, dando como resultado la expresión de la enfermedad (Barnes, 1994; Bergamin-Filho et al., 1995). Sin embargo, en ocasiones las enfermedades no son detectadas por la manifestación de síntomas en las plantas, por lo que se requiere utilizar otros procedimientos para realizar su diagnóstico. También factores abióticos, como el clima, toxicidad por plaguicidas y deficiencias nutricionales pueden ocasionar desordenes en las plantas (Guzmán-Piedrahita et al., 2009). Un diagnóstico oportuno que detecte el agente causal de un evento patológico es fundamental para el manejo del problema, y ello contribuye a generar medidas de control efectivas, ya que permite la optimización de los recursos, la reducción de los efectos negativos en el medio ambiente y a la vez origina información respecto a la interacción patógeno-hospedero (Barnes, 1994). Hasta hace aproximadamente tres décadas, la detección de fitopatógenos dependía de métodos convencionales que requerían de mucha experiencia, habilidad y conocimiento de la taxonomía de los microorganismos por parte del fitopatólogo. Además, aun con toda esta vasta experiencia se podían cometer errores debido a que los síntomas pueden ser muy parecidos entre enfermedades. En la actualidad, existen varios procedimientos para determinar la etiología de las enfermedades en las 345

9 plantas: la observación al microscopio compuesto, técnicas serológicas, bioquímicas, moleculares y microscopía electrónica. El método a utilizar dependerá de los objetivos que se quieran alcanzar, el número de muestras que se desea analizar, infraestructura con que se cuenta, entre otros. Las técnicas serológicas y moleculares han permitido diagnosticar de forma rápida y eficiente diversos virus, viroides, bacterias y fitoplasmas que producen enfermedades de importancia económica en los cítricos a nivel mundial (Roistacher, 1991; Pupiro et al., 2003). Debido a la importancia y al papel que desempeña en la fitoprotección un diagnóstico oportuno, el objetivo de este capítulo es ofrecer información general sobre los métodos de diagnóstico de enfermedades más utilizados en cítricos para que puedan ser ampliados y utilizados para el manejo preventivo de enfermedades y programas de certificación; esta última actividad de vital importancia para garantizar que el material de propagación que se lleve a campo esté sano. Además se da una breve explicación del principio teórico de la metodología y se citan algunos ejemplos de enfermedades detectadas en cítricos, por lo general HLB y virus de la tristeza de los cítricos (VTC), ya que son las más estudiadas y de las que mayor información hay disponible. Adicionalmente, y de acuerdo a normas internacionales se anexa una tabla de la Organización Norteamericana de Protección a las Plantas (NAPPO, por sus siglas en inglés North American Plant Protection Organization ), donde se hace un resumen de todas las enfermedades que afectan a los cítricos así como las pruebas de diagnóstico validadas. Diagnóstico visual de enfermedades comunes de cítricos en campo El diagnóstico visual nos da una primera aproximación del problema. En campo se lleva a cabo lo que se conoce como diagnóstico macroscópico, el cual se basa en la observación de síntomas. Resulta de vital importancia la experiencia del técnico fitopatólogo y del conocimiento de las variables que inciden en la enfermedad. Se deben de tener en cuenta los siguientes aspectos: 1. Examinar el campo y los alrededores. 2. Identificación de la especie o variedad enferma. 3. Patrones de anormalidad, distribución geográfica de la enfermedad en el campo y comparación de plantas. 4. Examinar plantas individuales, posición de síntomas y signos. 5. Prácticas agrícolas del cultivo: fertilización, riego y control químico. Bajo condiciones de campo y con experiencia, es factible identificar en cítricos enfermedades como antracnosis, fumagina, mancha gracienta, muerte de ramas, gomosis, entre otras. 346

10 En limón mexicano con la experiencia que se tiene del HLB es posible realizar un diagnóstico preliminar o presuntivo para detectar la enfermedad del HLB basado en sus síntomas típicos. En árboles de cítricos con estados avanzados de la enfermedad se puede perder follaje, sufrir engrosamiento y aclaración de las nervaduras, asimetría y difusión de colores en las nervaduras y foliolos, así como hojas pequeñas y rectas. En lo que respecta a los frutos, su desarrollo se detiene y pueden presentar deformaciones, tienen una coloración atípica y pueden sufrir aborto de semilla. En limón mexicano no se han observado los daños mencionados anteriormente, el síntoma mas común en éste es el moteado irregular que aparece en las hojas maduras de 40 a 60 días de edad. Sin embargo, las deficiencias nutricionales de micro y macroelementos genera patrones cloróticos similares a los causados por la bacteria Candidatus liberibacter asiaticus. Debido a lo anterior, puede resultar muy fácil confundirse, por lo que se recomienda realizar un diagnóstico más preciso si no se cuenta con la experiencia suficiente para detectar la enfermedad en campo (Figura 106). A B C D E F Figura 106. Síntomas de HLB: A) y B). Deficiencias nutricionales en hojas de limón mexicano: C) Manganeso (Mn); D) Zinc (Zn); E) Hierro (Fe) y F) Magnesio (Mg). Si este fuera el caso, se deben de llevar algunas muestras al laboratorio para ser analizadas con más detalle, estas deben examinarse para descartar otro tipo de problemas como pueden ser daño por animales, factores nutricionales o ambientales. 347

11 La muestra colectada debe presentar el daño o síntomas más distintivos del problema observado. Plantas indicadoras o indexado biológico Las plantas indicadoras son aquellas que presentan una reacción rápida y característica a un cierto patógeno que puede no ofrecer síntomas en la planta del cultivo que se desea diagnosticar. Una planta indicadora debe reaccionar a la posterior inoculación del agente infeccioso mediante la formación de lesiones locales. La selección de una planta indicadora adecuada para un patógeno determinado en ocasiones no está relacionada botánicamente con la planta de cultivo afectada. Por lo anterior la experiencia del técnico fitopatólogo es escencial para determinar que planta indicadora utilizar basado en la suceptibilidad de ser infectada (Barnes, 1994; Martínez-Espinoza et al., 1997; Guzmán-Piedrahita et al., 2009). En cítricos el diagnóstico mediante indexado biológico ha sido el método más utilizado para detectar la presencia de patógenos transmisibles por injerto, entre los que se encuentran bacterias, fitoplasmas, virus y viroides. Esta técnica clásica está basada en la utilización de plantas indicadoras de especies de cítricos injertadas con muestras que se desea diagnosticar o estudiar (Roistacher, 1991; Roistacher, 1998; NAPPO, 2013 a). Cada muestra se inocula en dos o tres plantas y se conservan otras sin inocular como testigo. Debido a la baja tasa de transmisión de la bacteria asociada al HLB por injerto, la tasa de éxito del indexaje biológico para HLB es variable. Las plantas indicadoras idóneas son naranjo dulce o tangelo Orlando para la raza africana y naranjo dulce o mandarina Ponkan para la raza asiática. Mediante esta técnica la presencia del VTC puede interferir en la expresión de síntomas del HLB; en estos casos, la toronja puede utilizarse como indicadora. La técnica más utilizada de inoculación es el injerto lateral y como alternativo, injertos de hoja. Las plántulas indicadoras conservan un solo tallo principal y se mantienen a 25-32ºC. Los síntomas normalmente se presentan entre 8 a 12 semanas después de la inoculación (Roistacher, 1991; Roistacher, 1998; NAPPO, 2012; Muhammad et al., 2012). Otras enfermedades diagnosticadas mediante plantas indicadoras son tristeza de los cítricos, hoja rugosa, enanismo de la mandarina satsuma, achaparramiento del citrange, manchado foliar, mosaico amarillo, exocortis, cancrosis, escoba de bruja, enanismo clorótico, muerte regresiva australiana, corteza gomosa, entre otras (Roistacher, 1991; Roistacher, 1998; NAPPO, 2012; NAPPO, 2013 a; NAPPO, 2013 b). Actualmente existe un importante grupo de enfermedades poco caracterizadas cuyo diagnóstico está limitado al uso de plantas indicadoras (ver anexo) (NAPPO, 2013 a). Las metodologías basadas en el indexado biológico tienen el inconveniente de ser laboriosas y costosas, debido al requerimiento de instalaciones con temperatura controlada, período prolongado para la manifestación de síntomas y la necesidad de utilizar plantas indicadoras específicas para cada enfermedad. Se ha observado, además, que algunos patógenos pueden interferir en la expresión de los 348

12 síntomas cuando el material que se va a diagnosticar posee infecciones mixtas (Barnes, 1994; Martínez-Espinoza et al., 1997; Valenzuela-Herrera et al., 2003; Guzmán-Piedrahita et al., 2009). Diagnóstico serológico Las pruebas serológicas de ELISA (acrónimo del inglés Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay, Ensayo por Inmunoabsorción Ligado a Enzimas) están basadas en el uso de antígenos o anticuerpos marcados con una enzima, de tal manera que los conjugados resultantes tengan actividad tanto inmunológica como enzimática. Al estar uno de los componentes (antígeno o anticuerpo) marcado con una enzima e insolubilizado sobre un soporte (inmunoabsorbente), la reacción antígeno-anticuerpo quedará inmovilizada y, por tanto, será fácilmente revelada mediante la adición de un sustrato específico que al momento de actuar la enzima produzca un color observable a simple vista o cuantificable mediante el uso de un lector de placas de ELISA (Figura 107 A y C) (Barnes, 1994; Martínez-Espinoza et al., 1997; Guzmán-Piedrahita et al., 2009). A B C Figura 107. Ensayo serológico para la detección de fitopatógenos. A) Placa de ELISA; B) Kit para ELISA (AGDIA); C) Lector de placas de ELISA. 349

13 Existen kits comerciales como los distribuidos por la casa comercial AGDIA ( los cuales son específicos para una gran cantidad de microorganismos patógenos en diversos cultivos, incluido limón; estos kits contienen un control positivo del patógeno para realizar la comparación de las muestras analizadas (Figura 107 B). Sin embargo, la principal limitante en la práctica con estas metodologías es que en ocasiones pueden arrojar falsos negativos cuando las muestras no alcanzan la concentración mínima para que reaccione el complejo antígeno-anticuerpo. Esta reportado que esta técnica no detecta virus en plantas si su concentración es menor de 0.1 ng de virus/ml, mientras que el grado óptimo de sensibilidad de la técnica serológica es de 1-10 ng de virus/ml (Bermúdez-Guzmán et al., 2011). Teniendo en cuenta la disponibilidad actual de anticuerpos específicos, algunos patógenos detectados en cítricos mediante esta metodología son Ca. Liberibacter asiaticus (NAPPO 2012; NAPPO 2013 a), el VTC (Matthews et al., 1997; Cambra et al., 2000; NAPPO 2013 b), el virus de la psorosis de los cítricos (Martín et al., 2002; Martín et al., 2004), el virus variegado de los cítricos (Djelouah et al., 2004), Xanthomonas citri subsp. citri (Haelteman et al., 2004), Xylella fastidiosa (Janse y Obradovic, 2010), entre otros. La limitación más importante para la detección de VTC por ELISA convencional es la necesidad de preparar extractos de las plantas a diagnosticar. Por ello, se han desarrollado variantes como la inmunoimpresión-elisa, que es una técnica que utiliza membranas de captura que no requieren la trituración y homogenización de las muestras, permitiendo el análisis de miles de muestras de forma sencilla y rápida (Cambra et al. 2000). El proceso consta de cuatro etapas básicas y secuenciales: 1. Recolección e impresión de muestras de membrana. 2. Bloqueo de la membrana impresa y reacción. 3. Lavado 4. Revelado y lectura de resultados. Las ventajas mencionadas anteriormente han propiciado la gran aceptación del método de inmunoimpresión para la detección de VTC en los programas de vigilancia y las prospecciones masivas del virus de la tristeza de los cítricos en varios países. Por otra parte, resulta un procedimiento adecuado en investigaciones epidemiológicas o aquellas dirigidas al estudio de la distribución y localización de patógenos en los tejidos del hospedero. Diagnóstico por microscopía óptica y electrónica Consiste en observar estructuras del microorganismo fitopatógeno directamente al microscopio de luz, para el caso de las bacterias, hongos, nemátodos o al microscopio electrónico para identificar a los virus. Éste último tiene la desventaja de ser muy costoso, por lo que su uso en programas de diagnóstico masivo ha sido muy limitado (Barnes, 1994; Guzmán-Piedrahita et al., 2009). 350

14 Para el diagnóstico de los hongos se necesita la formación de estructuras reproductivas, como esporas o conidios, las cuales son generadas en cámara húmeda. Cuando se trata de las bacterias, el proceso de identificación debe complementarse con pruebas bioquímicas, para lo cual el primer paso consiste en el aislamiento del microorganismo. Comúnmente es necesario aplicar los postulados de Koch, para determinar con exactitud la naturaleza del problema (Martínez-Espinoza, et al, 1997). Postulados de Koch: 1. El microorganismo debe estar presente en todos los individuos enfermos. 2. El microorganismo debe poder aislarse del hospedante y crecer en cultivo puro. 3. La inoculación del microorganismo crecido en cultivo puro debe provocar la aparición de síntomas específicos de la enfermedad en cuestión. 4. El microorganismo debe ser reaislado del hospedante infectado de forma experimental. Estos principios de patología vegetal sobre los que se apoyan gran parte de las investigaciones no pueden ser aplicados para los virus debido a su reducido tamaño y su condición de parásitos endocelulares obligados (no pueden ser aislados en medios de cultivo artificial). En el caso de la bacteria Ca. Liberibacter asiaticus, agente causal del HLB, hasta el momento aún no se ha podido aislar en medios de cultivo artificiales, aunque está publicado el procedimiento para hacerlo (Sechler et al., 2009). Para la detección de VTC, el procedimiento de microscopía óptica de mayor aplicación es la observación de inclusiones virales que aparecen como grandes agregados en forma de bandas, localizados en el tejido del floema (Grimaldi y Catara, 1988). También es posible la detección de Xylella fastidiosa, Spiroplasma citri, Phytoplasma auratifolia, Ca. Liberibacter sp., virus de la psorosis de los cítricos (CPsV) y virus de la leprosis de los cítricos (CiLV), entre otros patógenos (Martín et al., 2002; Martín et al., 2004; Janse y Obradovic, 2010; NAPPO, 2013 a) Diagnóstico molecular El diagnóstico basado en la detección de ácidos nucleicos (AN), ya sea ácido desoxirribonucleico (ADN) o ácido ribonucleico (ARN), presenta numerosas ventajas sobre los métodos descritos con anterioridad. El uso de las metodologías basadas en Biología molecular para la identificación de los microorganismos constituye hoy en día la forma más precisa y confiable de determinar los agentes causales prácticamente de cualquier enfermedad de origen biótico: hongos, bacterias, virus, fitoplasmas. Lo anterior se debe a la elevada sensibilidad y especificidad que tienen los AN, característica conferida por la comlementariedad de sus bases nitrogenedas. La 351

15 mayoría de estas técnicas están basadas en la hibridación de los AN y principalmente en la PCR. Ambos métodos presentan numerosas variantes que se emplean para la detección de fitopatógenos, pero tienen el inconveniente de ser costosos. (Figura 108). Figura 108. Manipulación de muestras en laboratorio para diagnóstico de enfermedades por PCR. Hibridación de los ácidos nucleicos La hibridación de los AN es una técnica basada en el principio de complementariedad de las bases nitrogenadas que forman los nucleótidos de las moléculas de ADN. Interacciones moleculares conocidas como puentes de hidrógeno mantienen unidas las bases nitrogenadas en pares que siempre son T-A (Timina-Adenina) y C-G (Citosina-Guanina). Esta metodología básicamente permite la unión del AN genómico del patógeno, previamente fijado a un soporte sólido (membrana de nitrocelulosa o nylon), con AN complementarios denominados sondas. La sensibilidad del método depende de la concentración y distribución del patógeno, del método de extracción de ADN de la muestra y de la calidad de la sonda empleada. Las variantes más empleadas del método son Southern-blot, para ADN, y Northern-blot, para ARN (Barnes, 1994; Martínez-Espinoza et al., 1997; Guzmán-Piedrahita et al., 2009). Estos métodos muestran altos porcentajes de eficacia y se utilizan para detectar viroides y 352

16 virus de ARN, son muy útiles para detectar patógenos presentes en bajas concentraciones y limitados al floema y virus en su insecto vector. La hibridación de los AN se ha utilizado para la detección del VTC, virus de la psorosis de los cítricos (Martín et al., 2004), virus del mosaico amarillo de los cítricos (Gopi et al., 2010) y algunos viroides. Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) La Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR), por sus siglas en inglés Polymerase Chain Reaction es la técnica molecular más utilizada para la detección de patógenos. Permite amplificar millones de veces un fragmento de interés correspondiente al genoma del microorganismo. Esta técnica trabaja bajo el principio de la complementariedad de las bases de los AN y la capacidad de síntesis del ADN por la enzima ADN polimerasa. Para la amplificación del fragmento de ADN de interés, se utilizan oligonucleótidos que se unen a ambos lados de la cadena de nucleótidos. Este proceso se realiza mediante ciclos sucesivos de desnaturalización térmica del ADN, unión de los oligonucleótidos a las secuencias complementarias y extensión de los oligonucleótidos mediante la enzima ADN polimerasa (Barnes, 1994; Martínez-Espinoza et al., 1997; Guzmán-Piedrahita et al., 2009). A nivel mundial el diagnóstico de patógenos no cultivables in vitro como fitoplasmas y algunas bacterias confinadas a los haces vasculares de las plantas, se realizan fundamentalmente mediante esta técnica debido a su elevada especificidad. Por medio de la variante convencional de PCR se han diagnosticado los patógenos de cítricos Xylella fastidiosa (Janse y Obradovic, 2010), Spiroplasma citri (Yokomi et al., 2008), Phytoplasma aurantifolia, Ca. Liberibacter sp. (Wang et al., 2006; Li et al., 2007), Guignardia citricarpa (Peres et al., 2007), Xanthomonas citri subsp. citri (Lertsuchatavanich et al., 2007), virus del mosaico amarillo de los citricos (Gopi et al., 2010), Candidatus Phytoplasma (Ghosh et al., 2013), entre otros. En la figura 109 se muestra un gel típico obtenido a partir de los productos de la técnica de PCR para detectar el agente causal del HLB, la bacteria Ca. Liberibacter asiaticus. El diagnóstico del patógeno se realiza con base a la presencia o ausencia de un patrón de bandas que se generan. Estas bandas son comparadas con otras, llamadas marcador de peso molecular (MPM), cuyo peso es conocido (el ADN se mide en pares de bases (pb)). Las bandas resultantes deben tener un determinado peso; en este caso la literatura indica que la banda debe pesar 703 pb. Si coinciden los pesos entonces se puede interpretar la presencia de la banda en las muestras analizadas como positivas a Ca. Liberibacter asiaticus, por lo que el diagnóstico para la enfermedad del HLB es positivo para las muestras 3-9 de limón mexicano (Figura 109). Para este tipo de pruebas es recomendable utilizar un control positivo (carril 1), el cual corresponde a una muestra de la cual se tiene la seguridad que está infectada con la bacteria y un control negativo, correspondiente a una muestra sana de limón mexicano (carril 2). La 353

17 banda generada en el control positivo debe coincidir con el patrón de bandas generado en las muestras analizadas. Figura 109. Patrón de bandas obtenido de la PCR para diagnosticar Ca. Liberibacter asiaticus, agente causal del HLB. MPM: Marcador de peso molecular. pb: pares de bases. Transcripción Inversa - Reacción en Cadena de la Polimerasa (RT-PCR) La mayoría de los virus de las plantas y todos los viroides tienen un genoma de ARN, lo cual imposibilita utilizar la metodología de la PCR para su detección, ya que esta necesita como punto de partida ADN. Debido a lo anterior antes de llevar a cabo la PCR se realiza una reacción de transcripción inversa (RT, por sus siglas en inglés, Reverse Transcription ), en la cual el ARN es convertido a ADNc (ADN complementario), por medio de la enzima reverso transcriptasa (Barnes, 1994; Martínez-Espinoza et al., 1997; Guzmán-Piedrahita et al., 2009). Luego de sintetizado el ADNc, se procede a su amplificación mediante el procedimiento clásico de PCR descrito anteriormente. La RT-PCR se ha aplicado en cítricos para el diagnósticco de las enfermedades del VTC (Matthews et al., 1997; Roy et al., 2005), enanismo de la mandarina Satsuma (Shimizu et al., 2011), psorosis (Martín et al., 2004; Roy et al., 2005), exocortis (Ito et al., 2002; Madhurababu-Kunta y Skaria, 2007), Cachexia (Madhurababu-Kunta y Skaria, 2007), achaparraiento del citrange (Hailstones et al., 2000; Ito et al., 2002; Roy et al., 2005), hoja rugosa (Bennani et al., 2002; Roy et al., 354

18 2005), mosaico amarillo (Roy et al., 2005), entre otras. También se ha empleado para detectar los patógenos causantes de varias anormalidades de crecimiento y sintomatologías relacionadas con viroides de los cítricos (Ito et al., 2002; Cao et al., 2009; NAPPO, 2013 a). PCR en tiempo real Esta técnica novedosa permite adicionalmente a la detección del patógeno, la cuantificación del ADN del mismo. Otra de sus ventajas es que permite el análisis de un mayor número de muestras en menor tiempo ya que no es necesario realizar la electroforesis en gel de agarosa, procedimiento que consume mucho tiempo, sin embargo, el principal inconveniente son los elevados costos de los insumos. La PCR en tiempo real se ha aplicado exitosamente en la detección cuantitativa de numerosos patógenos, entre ellos el VTC (Bertolini et al., 2007) y las bacterias causantes del HLB (Wang et al., 2006). Otros patógenos que han sido identificados con esta metodología son el virus de la psorosis de los cítricos (Barragan et al., 2008), Xylella fastidiosa (Janse y Obradovic, 2010), virus de la mancha de hoja de los cítricos (Ruiz- Ruiz et al., 2009), entre otros. LITERATURA CITADA Barnes, L.W The role of plant clinics in disease diagnosis and education. A North American Perspective. Annual Review of Phytopathology 32: Barragán-Valencia, G., Morales-Loredo, A., Álvarez-Ojeda, M.G., Peña-del Río, M.A. y Quintero-Zapata, I Detección cuantitativa del virus psorosis de cítricos mediante RT-PCR tiempo real. Agrociencia 42: Bennani, B., Mendes, C., Zemzami, M., Azeddoug, H. and Nolasco, G Citrus variegation virus: molecular variability of a portion of the RNA 3 containing the coat protein gene and design of primers for RT-PCR detection. European Journal of Plant Pathology 108: Bergamin Filho, A., Kimati, H. y Amorin, L Manual de fitopatología. 3ª ed. Sao Paulo, Editora Agronómica Ceres, V pp. Bermúdez-Guzmán, M. J., López-Muraira y Gómez-Leyva Detección serológica y molecular del virus de la mancha anular del papayo (PRSV) en maleza de Carica papaya en Colima. Tesis de Maestría en Agrobiotecnología, Instituto Tecnológico de Tlajomulco, Jalisco, 122 pp. Bertolini, E., Moreno, A., Vidal, E., Martínez, M. C., Capote, N., Olmos, A., Gorris M. T. and Cambra M Quantitative detection of citrus tristeza virus by direct 355

19 tissueprint and squash Real-Time RT-PCR procedures. p. 48. Proceedings of the 17 th Conference of the International Organization Citrus Virologist. Adana, Turquía. Cambra, M., Gorris, M.T., Román, M.P., Terrada, Garnsey, S.M., Camarasa, E., Olmos, A. and Colomer, M Routine detection of Citrus tristeza virus by Direct Immunoprinting-ELISA Method Using Specific Monoclonal and Recombinant Antibodies. In: J.V. da Graca, R.F. Lee, and R.K. Yokomi (eds.). Proceedings of the 14 th Conference of the International Organization of Citrus Virologists. p Riverside, California. Cao, M.J., Atta, S., Liu, Q., Wang, X.F., Zhou, C.Y. and Iftikhar, Y First report of Citrus bent leaf viroid and Citrus dwarfing viroid from Citrus in Punjab, Pakistan. Plant Disease 93: Djelouah, K., Daccache, G., Frasheri, D., Milano, R. and Onghia, D Setting up and validation of DTBIA for the assessment of Citrus Variegation Virus. In: M. E. Hilf, N. Duran-Villa, and M.A. Rocha-Peña (eds.). Proceedings of the 16 th Conference of the International Organization of Citrus Virologists. p Riverside, California. Ghosh, D., Bhose, S., Manimekalai, R. and Gowda, S Molecular detection of Candidatus Phytoplasma spp. Causing witches broom disease of acid lime (Citrus aurantifolia) in India. Journal of Plant Biochemistry 22: Gopi, V., Gopal, K., Sankar, T. G. and Palanivel, S Detection of Citrus yellow mosaic virus by PCR and nucleic acid spot hybridisation using non-radioactive probes in commercial citrus species. Archives of Phytopathology and Plant Protection 43: Grimaldi, V. and Catara, A Detection of citrus tristeza and greening in Pakistan through electron microscopy. Journal of Phytopathology 126: Guzmán-Piedrahita, O.A., Castaño-Zapata, J. y Villegas-Estrada, B Diagnóstico de enfermedades de plantas de origen biótico. Agronomía 17:7-24. Haelteman, R.M., Canteros, B.I., Nome, S.F. and Duchase, N. A Citrus Canker Diagnosis by tissue printing. Program and abstracts of the International Society of Citriculture. Agadir, Morocco. p. 92. Hailstones, D.L., Bryant, K.L., Broadbent, P. and Zhou, C Detection of Citrus tatter leaf virus with reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR). Australasian Plant Pathology 29:

20 Ito, T., Ieki, H. and Ozaki, K Simultaneous detection of six citrus viroids and Apple stem grooving virus citrus plants by multiplex reverse transcription polymerase chain reaction. Journal of Virological Methods 106: Janse, J.D. and Obradovic, A Xylella fastidiosa: its Biology, diagnosis, control and risks. Journal of Plant Pathology 92: Lertsuchatavanich, U., Paradornuwat, A., Chunwonge, J., Schaad, N.W. and Thaveechai, N Novel PCR primers for specific detection of Xanthomonas citri subsp. citri the causal agent of bacterial citrus canker. Kasetstart Journal 41: Li, W., Hartung, J. S. and Levy, L Evaluation of DNA amplification methods for improved detection of Candidatus Liberibacter species associated with citrus huanglongbing. Plant Disease 91: Madhurababu-Kunta, J. V. and Skaria, S Molecular detection and prevalence of citrus viroids in Texas. HortScience 42: Martín, S., Alioto, D., Milne, R.G., Garnsey, S.M., García, M.L., Grau, O., Guerri, J. and Moreno, P Detection of Citrus psorosis virus by ELISA, molecular hybridization, RT-PCR and immunosorbent electron microscopy and its association with citrus psorosis disease. European Journal of Plant Pathology 110: Martín, S., Alioto, D., Milne, R.G., Guerri J. and Moreno P Detection of Citrus psorosis virus in field trees by direct tissue blot immunoassay in comparison with ELISA, symptomatology, biological indexing and cross-protection test. Plant Pathology, 51: Martínez-Espinoza, A., Flores-Olivas, A. y Martínez-Soriano, J. P Uso de nuevas tecnologías en la detección y el análisis genético de fitopatógenos. Fitopatología, 32: Matthews, D.M., Riley, K. and Dodds, J.A Comparison of detection methods for Citrus tristeza virus in field during months of nonoptimal titer. Plant Disease 81: Muhammad, F.R., Iqrar, A.K., Muhammad, J.J. and Shaza, M.A. B Graft transmission and biological indexing of Huanglongbing on local citrus germplasm. Science International 24: NAPPO (North American Plant Protection Organization) Protocolos de diagnóstico de la NAPPO. Huanglongbing de los cítricos. Consultado: 11 de junio de

21 NAPPO (North American Plant Protection Organization) a. Normas Regionales de la NAPPO sobre Medidas Fitosanitarias (NRMF). Medidas integradas para la movilización de material propagativo de cítricos. Consultado: 11 de junio de NAPPO (North American Plant Protection Organization). 2013b. Protocolos de diagnóstico de la NAPPO. Virus tristeza de los cítricos (Citrus Tristeza Virus - CTV). Consultado: 11 de junio de Peres, N.A., Harakava, R., Carroll, G.C., Adaskaveg, J.E. and Timmer, L.W Comparison of molecular procedures for detection of Guignardia citricarpa and G. mangiferae. Plant Disease 91: Pupiro, M.L. and Malagón, R.L Técnicas del diagnóstico de las enfermedades en las plantas. Trabajo de patología vegetal. Universidad Agraria de la Habana. La Habana, Cuba. Roistacher, C.N Graft-Transmissible Diseases Of Citrus. Handbook for detection and diagnosis. Rome: FAO. 286 pp. Roistacher, C.N Indexing for viruses in citrus. In: A. Hadidi, R. K. Khetarpal, and H. Koganezawa (eds.). Plant Virus Disease Control. p APS Press. St Paul, Minnesota. Roy, A., Fayad, A., Barthe, G. ad Brlansky, R.H A multiplex polymerase chain reaction method for reliable, sensitive and simultaneous detection of multiple viruses in citrus trees. Journal of Virological Methods 129: Ruiz-Ruiz, S., Ambrós, S., Vives, M.C., Navarro, L., Moreno, P. and Guerri, J Detection and quantitation of Citrus leaf blotch virus by TaqMan real-time RT-PCR. Journal of Virological Methods 160: Sechler, A., Schuenzel, E. L., Cooke, P., Donnua, S., Thaveechai, N., Postnikova, E., Stone, A. L., Schneider, W. L., Damsteegt, V. D. y Schaad, N. W Cultivation of Candidatus Liberibacter asiaticus, Ca. L. africanus y Ca. L. americanus associated with Huanglongbing. Bacteriology 99: Shimizu, S., Ito, T., Miyoshi, T., Tachibana Y. and Ito, T A broad spectrum, one-step RT-PCR to detect Satsuma dwarf virus variants using universal primers targeting both segmented RNAs 1 and 2. Journal of General Plant Pathology 77: Valenzuela-Herrera, V., Redondo-Juárez, E. and Bujanos-Muñiz, R Detección de virus por serología y plantas indicadoras en el tubérculo-semilla y plantas de 358

22 cultivo de meristemos en papa (Solanum tuberosum L.) var. Alfa. Revista Mexicana de Fitopatología 21: Wang, Z., Yin, Y., Hu, H., Yuan, Q., Peng, G. and Xia, Y Development and application of molecular-based diagnosis for 'Candidatus Liberibacter asiaticus', the causal pathogen of citrus huanglongbing. Plant Pathology 55: Yokomi, R.K., Mello, A.F.S., Saponari, M. and Fletcher, J Polymerase chain reaction-based detection of Spiroplasma citri associated with citrus stubborn disease. Plant Disease 92: ANEXOS Anexo 1. Patógenos causantes de enfermedades en cítricos y sus métodos de diagnóstico y clasificación alfanumérica de los países miembros de la NAPPO (NAPPO, 2013). VIRUS Enfermedad Patógeno Presencia/ausencia Prueba de USA MEXICO diagnóstico Tristeza de los cítricos Psorosis A y B Citrus tristeza virus (CTV) Citrus psorosis virus (CPsV-A, CPsV-B) P4 y P9 (CA) P4 y P9 Indexado en lima mexicana ELISA P4 P4 Indexado en plántulas de naranjo dulce Variegado infeccioso Hoja rugosa Hoja arrugada Leprosis Enanismo del Satsuma Hoja distorsionada/ achaparramiento del citrange Citrus Variegation Virus (CVV) Citrus Leaf Rugose Virus (CLRV) Citrus Crinkly Leaf Virus (CCLV) Citrus Leprosis Virus Tipo nuclear (CiLV-N) o Tipo citoplasmático (CiLV-C) Satsuma Dwarf Virus (SDV) Apple Stem Grooving Virus (ASGV) Syn. Citrus Tatter Leaf Virus (CTLV) P5 (FL) Ab1 Indexado en plántulas de limón (eureka), naranja agria y cidro Ab3 y Ab7 (FL) P5, P9 (CHIS, QRO, TAB, VER) Nuclear: Microscopía de Transmisión Electrónica Citoplasmática: RT-PCR Ab1 Ab1 Indexado en mandarina Satsuma, cidra Tangor Dweet, Sésamo blanco ELISA P5 (CA, AZ, TX, FL) Ab1 Indexado en citrange Rusk, Citrus excels 359

23 Manchado foliar y moteado del Dweet Mosaico amarillo Citrus Leaf Blotch Virus (CLBV) y Dweet Mottle Virus (DMV) Citrus Yellow Mosaic Virus (CYMV) P5 (FL) Ab1 Indexado en Dweet tangor RT-PCR Ab1 Ab1 Indexado en plántulas de naranja dulce o pomelo ELISA VIROIDES Enfermedad Patógeno Presencia/ausencia Prueba de USA MEXICO diagnóstico Exocortis Citrus Exocortis Viroid (CEVd) P4 P4 Indexado en cidro Etrog Arizona 861-S1 Cachexia Xyloporosis Hop Stunt Viroid (HSVd) Variantes de cítricos de HSVd: Citrus Viroid IIb (CVd-IIb) Citrus Viroid IIc (CVd-IIc) P4 P4 Etrog cidra Arizona 861- S1 para producción de tejido utilizado en RT- PCR, hibridación sobre improntas o indexado en parson s special injertado en limón rugoso Varias anormalidades de crecimiento y sintomatologías relacionadas con viroides de los cítricos Citrus Bent Leaf Viroid (CBLVd) Citrus Dwarfing Viroid (CDVd) Citrus Bark Cracking Viroid (CBCVd) Citrus Viroid-IIa (Variante de HSVd) Citrus Viroid V (CVd-V) Citrus Viroid VI (CVd-VI) P4 P4 P4 P4 P4 Ab1 Ab1 Ab1 Ab1 Ab1 Ab1 Ab1 Indexado en Etrog cidra Arizona 861-S1 y producción de tejido utilizado en RT-PCR o hibridación sobre improntas para la variante HSVd-Citrus: CVd-IIa BACTERIAS Enfermedad Patógeno Presencia/ausencia Prueba de USA MEXICO diagnóstico Cancro de los cítricos Xanthomonas citri subsp. citri P5, P9 (FL, LA) Ab1 Indexado en hojas de lima mexicana o pomelo Cultivo ELISA PCR Huanglongbing Candidatus Liberibacter asiaticus, Ca. L. africanus Ca. L. americanus P5 Y P9 (Ca. L. asiaticus en CA, P5 (Ca. L. asiaticus en YUC, QROO, Indexado en plántulas de naranjo dulce q PCR 360

24 FL, LA, SC, GA, PR, TX, USVI) NAY, JAL, COL, SIN, MICH, CHIS, CAMP, BCS, HGO) PCR Hibridación Clorosis variegada de los cítricos (CVC) Xylella fastidiosa subsp. pauca Ab1 Ab1 PCR + secuenciación Cultivo MOLLICUTES Enfermedad Patógeno Presencia/ausencia Prueba de USA MEXICO diagnóstico Stubborn Spiroplasma citri P5 (CA, AZ) Ab1 Cultivo Escoba de bruja Candidatus Phytoplasma aurantifolia Ab1 Ab1 Indexado en lima mexicana PCR HONGOS Enfermedad Patógeno Presencia/ausencia Prueba de USA MEXICO diagnóstico Mancha negra Guignardia citricarpa P5 y P9 (FL) Ab1 PCR Cultivo Roña de la naranja dulce Elsinoë australis P5 y P9 (TX, AZ, MS,LA, FL) P5 (SON, VER, BCS, NL, JAL, NAY, SLP, PUE, MOR, QROO, QRO, GRO, BCN) PCR NO CARACTERIZADOS - DESCONOCIDOS Enfermedad Patógeno Presencia/ausencia Prueba de USA MEXICO diagnóstico Enanismo clorótico Aún no caracterizado, probablemente virus (Citrus Chlorotic Dwarf Virus) Ab1 Ab1 Indexado en limón rugoso Muerte repentina Desconocido, probablemente Tymovirus (Muerte repentina de los cítricos virus Ab1 Ab1 Ningún método de diagnóstico aceptado Para detectar la presencia de 361

25 Muerte regresiva australiana Punteado entre nervadura, agallas de la madera relacionados) Aún no caracterizado, probablemente fitoplasma Desconocido, probablemente Luteovirus Tymovirus: PCR Ab1 Ab1 Indexado en naranjo dulce o pomelo PCR P5 (CA) P5 (CA) Indexado en lima mexicana, naranja agria Corteza gomosa Desconocido, probablemente la variante CVd_IIc Ab1 Ab1 Indexado en naranjo dulce Blight Desconocido P5 (FL) P5 (FL) Ningún método de diagnóstico aceptado Concavidad gomosa Desconocido, similar a virus P5 (CA) P5 (CA) Indexado en plántulas de naranjo dulce Cristacortis Impietratura Wood pocket Desconocido, similar a virus Desconocido, similar a virus Probable desorden genético en lima persa Ab1 Ab1 Indexado en naranjo u Orlando tangelo Ab1 Ab1 Indexado en naranjo dulce P11 (CA, P11 Síntomas en campo FL) (CA, FL) 362

26 En el proceso editorial de la presente publicación participó el siguiente personal: EDICIÓN Y COORDINACIÓN DE LA PUBLICACIÓN Dr. Gerardo Salazar-Gutiérrez Dr. Mario Orozco-Santos Dr. Marciano Manuel Robles-González Dr. José Joaquín Velázquez-Monreal MC Miguel Ángel Manzanilla-Ramírez MC Manuel de Jesús Bermúdez-Guzmán REVISIÓN TÉCNICA MC Sergio Alberto Curti-Díaz Dr. Mario Alberto Miranda-Salcedo SUPERVISIÓN Dr. José Antonio Rentería Flores Dr. Gerardo Salazar-Gutiérrez MC Isaac Vizcaíno-Vargas Dr. Mario Orozco-Santos FOTOGRAFÍA Dr. Mario Orozco-Santos Dr. Marciano Manuel Robles-González Dr. José Joaquín Velázquez-Monreal MC Miguel Ángel Manzanilla-Ramírez MC Manuel de Jesús Bermúdez-Guzmán CORRECCIÓN DE ESTILO Veronica Ochoa Chavez

27 Para mayor información escriba, llame o acuda al: CENTRO DE INVESTIGACIÓN REGIONAL DEL PACÍFICO CENTRO INIFAP Interior del Parque Los Colomos S/N Colonia Providencia Guadalajara, Jalisco, México CP Teléfono: (33) , , Fax: (33) CAMPO EXPERIMENTAL TECOMÁN. CIRPAC. INIFAP Kilómetro 35 Carretera Colima-Manzanillo Apartado postal 88 Tecomán, Colima, México C.P Teléfono: (313) , , Fax: (313)

28 El Limón Mexicano (Citrus aurantifolia) Mario Orozco-Santos Marciano Manuel Robles-González José Joaquín Velázquez-Monreal Miguel Ángel Manzanilla-Ramírez Manuel de Jesús Bermúdez-Guzmán Silvia Heréndira Carrillo-Medrano Víctor Manuel Medina-Urrutia Luis Martín Hernández-Fuentes Rafael Gómez-Jaimes Gilberto Manzo-Sánchez Javier Farías-Larios Daniel Nieto-Ángel Edgar Mijangos-Hernández Julio Alejandro Sánchez-de la Torre Sóstenes Varela-Fuentes Esta obra se terminó de imprimir en los talleres gráficos de la imprenta: Libertad No. 1457, Col. Americana, Guadalajara, Jalisco, México CP Tel. (33) y Tiraje de 2,000 ejemplares Noviembre del 2014 Impreso en México Printed in Mexico

29 AGRADECIMIENTOS Al Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agrícolas y Pecuarias, institución donde se ha generado el mayor conocimiento científico-tecnológico de limón mexicano en el mundo. Agradecimiento especial por el apoyo económico para la impresión de este libro. A la Fundación Produce Colima A.C. por el financiamiento de los proyectos de investigación orientados a la búsqueda de estrategias de manejo del huanglongbing y su vector el psílido asiático, las cuales son plasmadas en este documento. Al Fondo Institucional de Fomento Regional para el Desarrollo Científico, Tecnológico y de Innovación (FORDECyT) del CONACYT por el financiamiento del proyecto No : Desarrollo y evaluación de tecnología para el manejo sustentable del huanglongbing (Candidatus Liberibacter) y su vector (Diaphorina citri) en los cítricos ácidos del Pacífico de México. Parte de la información descrita en este libro es producto de investigaciones del citado proyecto. Al Consejo Estatal de Productores de Limón de Colima (COEPLIM) por su apoyo incondicional e interés en la generación de tecnología en limón mexicano. Esta obra está dedicada a los limoneros mexicanos, esperando que la información contenida les sea útil para implementar un manenjo eficiente y sustentable del cultivo de limón mexicano y con ello coadyuve a mejorar sus ingresoso. Agradecimiento especial a las diferentes empresas líderes de productos agrícolas para el campo mexicano por su apoyo económico. En especial a Total México, Bayer de México, Syngenta, Dow AgroSciences, ADAMA y Yara.

30 INSTITUCIONES PARTICIPANTES Y PATROCINADORES FORDECyT ADAMA

31 El INIFAP a través del campo Experimental Tecomán ha generado tecnología de producción del cultivo de limón mexicano durante más de cuatro décadas y que ha sido adoptada por productores de este cítrico en toda la costa del Pacífico Mexicano, desde el estado de Colima hasta Oaxaca. Este 40 aniversario, lo celebramos con la presentación y entrega a los limoneros de México del libro EL LIMÓN MEXICANO (Citrus aurantifolia)", el cual contiene información de su origen y ubicación taxonómica, así como de los principales componentes del manejo agronómico del cultivo, desde la producción de la planta, hasta la cosecha del fruto. Esperamos que los técnicos y productores encuentren en esta obra información útil que les ayude a realizar un manejo eficiente y sustentable que mejore los rendimientos y la calidad de fruta, para que al final se traduzca en mejores ingresos para las familias limoneras.