DIVERSIDAD GENÉTICA EN ESPECIES FORESTALES DE LA PENÍNSULA IBÉRICA.

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1 DIVERSIDAD GENÉTICA EN ESPECIES FORESTALES DE LA PENÍNSULA IBÉRICA. P. JIMÉNEZ (1,2); D. AGÚNDEZ (2); N. ALBA (2); S. GONZÁLEZ MARTÍNEZ (1,2); A. GÓMEZ (2); M. COGOLLUDO (1,2); C. COLLADA (3); S. IGLESIAS (4); R. ALÍA (2); L. GIL (1). 1.- Unidad de Anatomía, Fisiología y Genética. ETSI Montes, UPM. Ciudad Universitaria, s/n Madrid. 2.- Dpto. de Mejora y Biotecnología. CIFOR-INIA. Apdo Madrid. 3.- Dpto. de Biotecnología. ETSI Montes, UPM. Ciudad Universitaria, s/n Madrid. 4.- Servicio de Material Genético. DGCN. Gran Vía de San Francisco, Madrid. RESUMEN Se realiza una revisión de los conocimientos existentes sobre la variabilidad de las principales especies forestales españolas. Se ofrecen los resultados de diversos estudios con marcadores moleculares llevados a cabo sobre especies de los géneros Pinus, Quercus, Populus y Ulmus. Con el fin de responder a distintos problemas propios de cada especie, se han utilizado distintos marcadores: isoenzimas, microsatélites de cloroplasto, ADN citoplasmático. Se muestran los niveles de diversidad intra e interpoblacional de cada especie, la estructuración geográfica y las relaciones entre poblaciones y las áreas de máxima y mínima diversidad. Dependiendo de la especie, es posible también establecer las probables áreas refugio y las rutas migratorias postglaciales, o resolver problemas específicos como la identificación de híbridos (Ulmus) o la detección de introgresiones genéticas (Quercus). Con el conjunto de datos, es posible determinar algunas características comunes a las especies forestales, y qué rasgos son propios de cada especie o género al estar determinados por factores históricos o características vitales. P.C.: marcadores moleculares, diversidad genética, especies forestales. SUMMARY A review of the actual knowledge on variability of the main forest trees in Spain is done. Results of different studies with molecular markers on species of genus Pinus, Quercus, Populus and Ulmus are offered. To answer specific problems of each species, different technics have been used: isozymes, chloroplast microsatellites, cytoplasmic DNA. Intra- and interpopulation diversity leveles of each species were estimated, as well as the geographic structuration, the relationships between populations and the areas with maxima or minima diversity. According to the species, it is possible to assess probable refuges and postglacial recolonization pathways, or to solve specific questions as hybrid identification (Ulmus) or detection of genetic introgressions (Quercus). On the basis of the whole information, it is possible to determine common characteristics of forest tree species, and which traits are determined by historic factors or life history and, thus, are distinctive of each taxon. K.W.: molecular markers, genetic diversity, forest species. INTRODUCCIÓN: El conocimiento de la diversidad genética de las especies es uno de los objetivos contemplados por la Red de Mejora y Conservación de los Recursos Genéticos, creada a partir del desarrollo de la Estrategia Forestal Española (DGCN, 2000). Los estudios con marcadores moleculares son el método comúnmente usado para establecer la variación genética neutral, y la rapidez con que pueden ofrecer resultados hace que en los últimos años se haya acumulado una cantidad de información sobre diversas especies forestales españolas. Los datos que ofrecen los estudios moleculares revelan el modo en que los procesos no selectivos (migración, deriva) han configurado la estructura genética de cada especie, y por tanto son útiles para inferir aspectos históricos, de sistema reproductor, flujo genético, etc, no relacionados con acciones selectivas del ambiente (MORITZ, 1999). La disponibilidad de distintos tipos de marcadores permite responder a distintas preguntas, según la especie. Así, puede interesarnos conocer el modo en que está estructurada geográficamente la diversidad genética en todo el área de la especie, o como se estructura dentro de una población en concreto; la distribución jerárquica de la variabilidad, las rutas migratorias seguidas por la especie, qué zonas fueron refugio y por tanto tienen un potencial para volver a serlo, o casos concretos como el modo en que la hibridación con otras especies influye en la diversidad de la especie objeto. En la presente ponencia se exponen los resultados de los estudios más relevantes sobre

2 diversidad genética de especies forestales, entre los llevados a cabo en el Departamento de Mejora y Biotecnología del CIFOR y la ETSIM (UPM). MÉTODOS EMPLEADOS: Las técnicas utilizadas han sido varias, de acuerdo a los objetivos planteados en cada estudio concreto. El material de estudio ha sido en la mayoría de los casos poblaciones naturales de cada especie, excepto en el caso de Ulmus en que se han utilizado las colecciones existentes de U. minor y U. pumila, además de individuos ornamentales. En la tabla 1 se detalla el material para cada especie y las técnicas de estudio empleadas. En particular, se han empleado marcadores de dos tipos: isoenzimas y ADN. Los estudios isoenzimáticos se han llevado a cabo mediante electroforesis en gel de almidón. Los protocolos se describen en las referencias relativas a cada especie. Igualmente, los sistemas enzimáticos estudiados varían de acuerdo a la resolución, actividad y polimorfismo mostrados por cada taxon. Entre los marcadores de ADN, se han empleado las siguientes técnicas: RAPDs (Random Amplified Phragment Polymorphism), microsatélites de cloroplastos (cpssr), PCR-RFLP de ADN de cloroplastos (ADNcp). Los detalles se encuentran igualmente en las referencias de cada trabajo. Los datos fueron analizados con programas estadísticos adecuados a cada estudio que proporcionaron los parámetros de diversidad y diferenciación. De la información obtenida en cada estudio, se ha seleccionado una serie de parámetros que permita la comparación entre especies. Como estimador de la diversidad genética, se emplean diversos parámetros según los trabajos: heterozigosidad esperada (He) o diversidad genética total de Nei (H T ) para los estudios enzimáticos y RAPDs, diversidad genética (H) para microsatélites de cloroplastos. Como medida de la diferenciación entre poblaciones se da el valor de F ST o G ST, según el descrito por cada autor. Tabla 1.- Marcadores y material utilizados en los estudios considerados en la presente comunicación. Especie Marcador Material Referencias Pinus pinaster Isoenzimas Poblaciones naturales SALVADOR et al., 1997, 2000 GONZÁLEZ MARTINEZ et al., 2000 Pinus halepensis Isoenzimas Poblaciones naturales AGÚNDEZ et al., 1997, 1999 RAPDs GÓMEZ, CpSSR Pinus pinea Isoenzimas Poblaciones naturales GÓMEZ et al., 2000 CpSSR Datos sin publicar Quercus suber Isoenzimas Poblaciones naturales JIMÉNEZ, ADNcp JIMÉNEZ et al., 1999 COLLADA et al., 2001 Quercus ilex ADNcp Poblaciones naturales JIMÉNEZ, 2000 COLLADA et al., 2001 Tabla 1.- (cont.) Populus alba Isoenzimas Poblaciones naturales ALBA, 2000 (familias en rodales) ALBA et al., 1997 Ulmus minor Isoenzimas Poblaciones naturales COGOLLUDO, 1999 Colección Áreas urbanas y ornamentales Ulmus pumila Isoenzimas Colección COGOLLUDO, 1999 Áreas urbanas U. minor x pumila Isoenzimas Áreas urbanas COGOLLUDO, 1999 RESULTADOS PARA CADA ESPECIE: En la tabla 2 se muestra un resumen de resultados de los trabajos publicados hasta el momento. En primer lugar, hay que señalar las diferencias obtenidas según el marcador utilizado, por lo que a la hora de establecer comparaciones debe realizarse sobre unas bases comunes. La utilización

3 de diversos marcadores en una misma especie permite obtener una visión más completa de su estructura genética. En la mayoría de los casos el número de loci analizados es suficiente para realizar una estimación adecuada de la diversidad, de acuerdo a BERG & HAMRICK (1997) que consideran necesario un número entre 10 y 20 loci. En el caso del estudio de P. halepensis en el que se analizan 5 loci, hay que tener en cuenta que se parte de un estudio anterior en el que a partir de 15 loci se determinó el polimorfismo de esos 5. Uno de los rasgos comunes a todas estas especies es la forma en que se estructura la diversidad. La mayor parte de la variabilidad, para marcadores nucleares, se encuentra dentro de las poblaciones (entre el 76 y el 97%). Las diferencias entre poblaciones, por tanto, son escasas. Esta es una característica propia de las especies alógamas, de amplia distribución y principalmente anemófilas, como son los árboles forestales (HAMRICK et al., 1992). Los marcadores maternales (ADN de cloroplastos en frondosas) siguen un patrón opuesto, debido a sus características (genoma haploide sin recombinación, dispersión limitada, baja velocidad de mutación). La alta variabilidad dentro de las poblaciones se relaciona con el modo de reproducción. Las bajas tasas de autofecundación, en general, de estas especies, hace que en las progenies se genere una alta variabilidad. En el género Quercus, en concreto, la variación entre árboles y años en los periodos de fructificación es el responsable de una gran variabilidad genotípica de las poblaciones. Las especies en las que la reproducción vegetativa es importante presentan una menor variación que otros representantes de su género con reproducción sexual (U. minor frente a U. pumila). Otra consecuencia de esta capacidad de generar y mantener una alta variabilidad intrapoblacional es el hecho observado en varios trabajos acerca de poblaciones marginales de la especie (aquellas aisladas y/o de pequeño tamaño, generalmente en la periferia de la distribución). En muchas ocasiones no se observa una reducción significativa de la diversidad respecto a las poblaciones principales, y si existe es atribuible a fenómenos históricos, como el hecho de estar situadas al final de las rutas migratorias, en lugar de a sus características demográficas. Tabla 2.- Valores de los principales parámetros de diversidad para cada especie y estudio. Nº pobl: número de poblaciones muestreado; Nº loci: número de loci analizados; % Pl: porcentaje de loci polimórficos; Na/Ne: número medio de alelos por locus/número efectivo; ν T : diversidad genotípica; D: diversidad genética; Ho: Heterozigosidad observada; F IS : índice de fijación de Wright; F ST /G ST : coeficiente de diferenciación interpoblacional. Especie Marcador Nº Nº % Pl Na/Ne ν D Ho T pobl loci F IS F ST /G ST P. pinaster isoenzimas / P. halepensis isoenzimas / P. halepensis isoenzimas P. halepensis RAPDs / P. halepensis cpssr / P. pinea cpssr / Q. suber isoenzimas / Q. suber cpdna Q. ilex cpdna U. minor isoenzimas / U. pumila isoenzimas / U. minor x isoenzimas / pumila Populus alba isoenzimas / A continuación se ofrecen las conclusiones más significativas para cada especie: Pinus halepensis: Muestra unos niveles de variabilidad inferiores a otros pinos, aunque la

4 diferenciación ente poblaciones es de las más elevadas. La variación sigue una estructura clinal con dirección Norte-Sur, con menor diversidad en poblaciones de las Baleares y el interior peninsular. Esto se atribuye a la existencia de refugios glaciares en la Península, al menos en Cataluña y Andalucía, con migraciones posteriores a lo largo de la costa mediterránea con penetraciones hacia el interior y la colonización de las islas (AGÚNDEZ et al., 1999; GÓMEZ, 1998). P. pinaster: Especie con alta diversidad y riqueza genética, especialmente las localizaciones del Sur y Este peninsular. Las poblaciones orientales muestran una alta estructuración geográfica, mientras que las del Noroeste presentan una gran homogeneidad. Las poblaciones marginales mantienen, por lo general, unos niveles de diversidad elevados. En este caso, se postula que la especie mantuvo refugios en el Sistema Ibérico, desde donde se habría iniciado la recolonización del resto del territorio. Otra zona refugio habrían sido las sierras béticas, cuyas poblaciones aparecen claramente divergentes del resto (SALVADOR et al., 2000). P. pinea: Niveles muy bajos de diversidad. En 22 sistemas enzimáticos analizados, únicamente se reveló un loci polimórfico (datos no publicados). El análisis con microsatélites nucleares también muestra un número de haplotipos y una diversidad inferior al hallado en P. halepensis con la misma técnica (GÓMEZ et al., 2000). Q. suber: Niveles de diversidad inferiores a otras especies del género con mayor área de distribución. La estructuración geográfica, aunque débil, indica la probable existencia de varias zonas refugio, más probable en el Sur peninsular, además de en el Suroeste y en el Noroeste. Las poblaciones marginales no presentan una pérdida de diversidad, y cuando existe es debida principalmente a factores históricos. Los marcadores maternos (ADNcp) muestran asímismo una gran homogeneidad de la especie, y la existencia de introgresión genética con Q. ilex. Este último hecho parece ser debido a hibridaciones bastante antiguas, seguidas de retrocruzamientos con alcornoque (JIMÉNEZ, 2000; JIMÉNEZ et al., 1999). El estudio de ADNcp en Q. ilex revela una diversidad mucho más alta que en Q. suber, consecuencia probablemente de su mayor plasticidad que permitió, también, una menor reducción durante las glaciaciones. La variabilidad de la encina es mayor que la de otras especies de robles presentes en la Península (JIMÉNEZ, 2000; COLLADA et al., 2001). Ulmus spp.: El estudio se ha centrado en la caracterización de U. minor y U. pumila y la identificación de sus híbridos. U. pumila presenta niveles mayores de diversidad, lo que se relaciona con la predominancia de reproducción sexual frente a la importancia de la reproducción vegetativa en U. minor. Los híbridos presentan mayor variabilidad que las especies parentales, al incorporar alelos de ambos. La hibridación se produce de manera asimétrica, siendo los híbridos más parecidos al olmo siberiano; de este modo, los olmos españoles no muestran incorporación de alelos de la especie introducida (COGOLLUDO, 1999; ). Populus alba: Niveles de diversidad similares a otras Salicáceas. Se ha realizado un estudio jerárquico (regiones, rodales, familias), que ha indicado cómo la mayor parte de la variación se encuentra entre familias, seguida de la variabilidad entre regiones. El estado de conservación del rodal influye en sus niveles de diversidad, disminuyendo cuando existen amenazas (ALBA, 2000). AGRADECIMIENTOS Los estudios presentados han sido financiados con cargo a los siguientes proyectos y convenios: proyecto FAIR CT ; proyecto UE RESGEN CT 96-78; convenios DGCN-INIA CC , CC85-99 y CC00-35; proyecto MAPA RF94020; proyectos INIA SC97-118; convenios DGCN-UPM Conservación de recursos genéticos de alcornoque en España, Conservación de recursos genéticos de los Quercus esclerófilos en España, Conservación y mejora de los recursos genéticos de los olmos ibéricos ; y por diversas becas del programa de formación de personal investigador del Ministerio de Educación y Cultura. BIBLIOGRAFÍA AGÚNDEZ, D.; DEGEN, B.; VON WUELISCH, G. & ALÍA, R. (1997). Genetic variation of Aleppo pine (Pinus halepensis Miller) in Spain. Forest Genetics 4: AGÚNDEZ, D.; DEGEN, B.; VON WUELISCH, G. & ALÍA, R. (1999). Multilocus analysis of

5 Pinus halepensis Miller from Spain: genetic diversity and clinal variation. Silvae Genetica 48: ALBA, N. (2000). Variabilidad genética en Populus alba L. en caracteres isoenzimáticos y cuantitativos: Aplicación a la selección y la conservación de recursos genéticos. Tesis doctoral. ETSI Montes, UPM. ALBA, N.; AGÚNDEZ, D. & ALÍA, R. (1997). Estudio de la diversidad genética de Populus alba mediante el uso de isoenzimas. Actas del I Congreso Hispano-Luso, II Congreso Forestal Español. Tomo II: BERG, E.E. & HAMRICK, J.L. (1997). Quantification of genetic diversity at allozyme loci. Can. J. For. Res. 27: COGOLLUDO, M.A. (1999). Caracterización genética y morfológica de Ulmus minor Mill. y Ulmus pumila L. Aplicación a la conservación de recursos genéticos. Proyecto Fin de Carrera. ETSI Montes, UPM. 166 pp. COGOLLUDO, M.A.; AGÚNDEZ, D. & GIL, L. (2000). Identification of native and hybrid elms in Spain using isozyme gene markers. Heredity 85: COLLADA, C., JIMÉNEZ, P. & GIL, L. (2001). Análisis de la variabilidad de ADN de cloroplastos en Quercus suber L., Q. ilex L. y Q. coccifera L. (este volumen). DGCN. (2000). Estrategia Forestal Española. Dirección General de Conservación de la Naturaleza, Ministerio de Medio Ambiente. 240 pp. GÓMEZ, A. (1998). Análisis de la variabilidad genética mediante marcadores de ADN en poblaciones españolas de Pinus halepensis Mill. Tesis Doctoral. ETSI Agrónomos, UPM. 162 pp. GÓMEZ, A.; AGUIRIANO, E.; BUENO, M.A. & ALÍA, R. (2000). Microsatélites del cloroplasto en P. pinea L. I Simposio del Pino Piñonero. Actas Tomo II, GONZÁLEZ MARTÍNEZ, S.C.; AGÚNDEZ, D.; ALÍA, R.; SALVADOR, L. & GIL, L. (2000). Geographical variation of gene diversity of Pinus pinaster Ait. in the Iberian Peninsula. En: Genetic response of forest systems to changing environmental conditions. Müller-Starck, G. (ed.). Kluwer Academic Press, Dordrecht, (en prensa). HAMRICK, J.L.; GODT, M.J.W. & SHERMAN-BROYLES, S.L. (1992). Factors influencing levels of genetic diversity in woody plant species. New Forests 6: JIMÉNEZ, M.P. (2000). Análisis de la variabilidad genética de Quercus suber L. mediante marcadores moleculares y su aplicación a la conservación de recursos genéticos. Tesis doctoral. ETSI Montes, UPM. 158 pp. JIMÉNEZ, M.P.; AGÚNDEZ, D.; ALÍA, R. & GIL, L. (1999). Genetic variation in central and marginal populations of Quercus suber L. Silvae Genetica 48: MORITZ, C. (1999). Conservation units and translocations: strategies for conserving evolutionary processes. Hereditas 130: SALVADOR, L.; SEISDEDOS, M.T.; ALÍA, R. & GIL, L. (1997). Estudio de la variabilidad genética en doce poblaciones naturales de Pinus pinaster con marcadores isoenzimáticos. Cuadernos de la SECF 5: SALVADOR, L.; ALÍA, R.; AGÚNDEZ, D. & GIL, L. (2000). Genetic variation and migration pathways of maritime pine (Pinus pinaster Ait.) in the Iberian Peninsula. Theor. Appl. Genet. 100: