REPARTIDO DE PRÁCTICO DE ACTIVIDAD ENZIMATICA

Transcripción

1 REPARTIDO DE PRÁCTICO DE ACTIVIDAD EZIMATICA Las enzimas son macromoléculas biológicas que aceleran la velocidad de una reacción hasta lograr el equilibrio. La enorme mayoría de las enzimas conocidas son proteínas; sin embargo, desde hace unos 30 años se conocen moléculas de AR con actividad enzimática, en general del tipo ribonucleasas. La cinética enzimática es la rama de la bioquímica que describe este proceso, estudiando como las variables experimentales afectan la velocidad de reacción hasta el equilibrio. Estas variables son la concentración de la enzima, sustratos o reactivos, productos, inhibidores, activadores, así como el ph, temperatura y fuerza iónica. El estudio completo de la cinética de una enzima incluye el estudio de la especificidad y afinidad del sitio activo por el sustrato; el orden en que los sustratos se unen y los productos se liberan; las especies intermedias que se generan durante el proceso enzimático; los valores de las constantes de velocidad; la identificación de los residuos de aminoácidos importantes en el sitio activo; el modo de acción de los inhibidores; y el análisis de cómo la enzima está regulada in vivo. Para la mayoría de las enzimas, la velocidad de reacción o catálisis (V, variación de la concentración (c) de producto formado o sustrato consumido por unidad de tiempo (t): V=dc/dt) varía con la concentración de sustrato ([S]) según se muestra en la siguiente figura. El estudio del efecto de la concentración de sustrato sobre la velocidad de reacción se difícil porque la [S] varía durante el curso de la reacción, pues este sustrato se va consumiendo mientras se convierte en producto. La forma más simple de solucionar este problema es medir la velocidad inicial de reacción (Vo), cuando

2 la [S] es mucho mayor que la concentración de enzima. En general, en una reacción de catálisis, la enzima se encuentra en concentraciones del orden nanomolar, mientras que el sustrato se encuentra en un orden de 5 a 10 veces mayor. Por lo tanto, al inicio de la reacción los cambios de [S] son mínimos, sólo una pequeña proporción del total, y se puede considerar constante. La relación entre la concentración de sustrato y la velocidad de reacción se puede expresar en forma algebraica a través de la ecuación de Michaelis-Menten: Los parámetros cinéticos Vmax y K M se utilizan para comparar actividades enzimáticas. Cabe recordar que Vmax es la velocidad máxima de reacción y K M es la constante de Michaelis-Menten (concentración de sustrato a la cual la velocidad de reacción es la mitad de la Vmax). La K M puede variar en forma apreciable de enzima a enzima, así como para diferentes sustratos de una misma enzima. El valor de K M es también una medida de la afinidad de la enzima por un sustrato (a mayor K M, menor afinidad). El número de intercambio de una enzima o "turnover" es el número de moléculas de sustrato convertidas en producto por una molécula de enzima, en la unidad de tiempo, cuando la enzima está totalmente saturada de sustrato. El valor de Vmax nos permite calcular el número de intercambio de una enzima si se conoce la concentración de sitios activos E T, ya que su valor es igual a la constante cinética K 2. Vmax = K 2 [E T ] Los valores de K M y Vmax se pueden calcular determinando la velocidad inicial de reacción a diferentes concentraciones de sustrato. El gráfico de dobles recíprocos o gráfico de Lineweaver-Burk nos permite calcular estos valores, según se muestra en la siguiente figura.

3 Recordemos que las enzimas alostéricas no obedecen las leyes de Michaelis- Menten y muestran una dependencia sigmoidal de la velocidad de reacción versus la concentración de sustrato. Las enzimas en general, son cuantificadas en términos de actividad biológica. El estudio de las enzimas en el laboratorio se basa en la demostración in vitro de la actividad catalítica. La actividad enzimática puede determinarse midiendo la velocidad de: La aparición de algún producto La desaparición del sustrato La variación de un cofactor En general, estas determinaciones se realizan en forma espectrofotométrica. Por lo tanto, necesitamos seguir la evolución de alguno de los elementos que participan en la reacción y que deben absorber luz a una longitud de onda específica. La actividad de la enzima se expresa mediante la determinación de la cantidad de sustrato consumido o del producto formado, por unidad de tiempo, en condiciones estrictamente definidas y controladas (ph, temperatura, fuerza iónica, etc.). La forma más común y útil de determinar actividad enzimática es en términos de unidades. Las unidades de enzima en general se definen como: La cantidad de enzima necesaria para producir determinada cantidad de producto (milimoles, micromoles, etc) por unidad de tiempo (minutos, segundos, etc) bajo determinadas condiciones de temperatura, ph, fuerza iónica y concentración de sustrato (condiciones de reacción).

4 Se dan tres fases durante una reacción enzimática: 1. Fase de retardo, que tiene lugar inmediatamente despues de mezclar los reactivos con la muestra biológica, y que implica el encuentro de sustrato y enzima. 2. Fase lineal, donde hay una formación constante de producto, siendo la concentración de enzima el único factor limitante. 3. Fase de agotamiento de sustrato, donde el sustrato u otro reactivo se van agotando y la velocidad de reacción disminuye hasta anularse. Para que una determinación enzimática sea válida es necesario realizarla en la fase lineal donde el único factor limitante es la concentración de la propia enzima y las condiciones de reacción son óptimas, por ejemplo, exceso de sustrato, ph y temperatura apropiados. Es así que en un ensayo enzimático siempre se trabaja con una concentración de sustrato 10 veces superior a la K M. Existen dos métodos analíticos para determinar la actividad enzimática: Método a punto final Método de velocidades iniciales (tiempo real)

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6 Laboratorio de Actividad Enzimática Objetivo: Determinación de la actividad específica de un preparado de la enzima xantina oxidasa Introducción La velocidad de una reacción se mide a través de la aparición de producto o la desaparición de sustrato. Es importante realizarlo en condiciones de velocidad inicial. De esta forma se evitan ciertos inconvenientes; por ejemplo, que se consuma el sustrato, que la enzima se inactive, que ocurra la reacción inversa, etc. Para medir la velocidad inicial, se determina la primera parte de la curva de progreso de la reacción, se grafica la concentración de producto o sustrato en función del tiempo y se dibuja la tangente inicial, que equivale a la pendiente inicial en el caso de obtenerse gráficos lineales. La xantina oxidasa (EC ) es una proteína que contiene grupos prostéticos flavina y varios centros metálicos y que participa en las fases finales del catabolismo de las purinas en mamíferos. La enzima cataliza la oxidación de la hipoxantina y la xantina a ácido úrico al mismo tiempo que la reducción de oxígeno. Para medir la actividad de la xantino oxidasa, puede medirse la aparición de su producto, el ácido úrico. Pero éste absorbe en la región ultravioleta del espectro. Si no se cuenta con espectrofotómetros que midan en esta región, puede utilizarse H OH OH + Cl O Cl Xantina oxidasa OH H O + H O Cl OH H Cl O O Xantina DCFIF (oxidado) Ácido úrico DCFIF (reducido) AZUL ICOLORO entonces diclorofenolindofenol (DCFIF) como oxidante en lugar del oxígeno. El DCFIF es de color azul y absorbe en el espectro visible y tiene un máximo a 600 nm. Al reducirse en la reacción catalizada por la xantina oxidasa pasa a una forma incolora, observándose entonces un descenso en la absorbancia a 600 nm.

7 Medida de la actividad enzimática por el método de velocidad inicial Se medirá la velocidad inicial de la reacción catalizada por la xantina oxidasa. El procedimiento se realizará por duplicado. Se determinará la actividad por ml de preparado y la actividad específica. Reactivos Amortiguador fosfato 0.1 M, ph 7.5 DCFIF 0.4 mm Xantina 3 mm Xantina oxidasa (dilución adecuada) MATEER SIEMPRE E HIELO Procedimiento 1. umerar 9 tubos de ensayo. Las medidas se realizan por triplicado. 2. Colocar buffer, DCFIF y xantina, según la tabla. La Xantina Oxidasa de agrega inmediatamente antes de medir. Buffer (ml) DCFIF (ml) Xantina (ml) Xantina Oxidasa (μl) Ajustar el espectrofotómetro a absorbancia cero con un blanco a 600 nm. Qué disolución usarías como blanco? 4. Agregar el volumen indicado en la tabla una dilución adecuada de xantina oxidasa, mezclar bien y transferir rápidamente a una cubeta de espectrofotómetro. Tomar el tiempo de mezcla como t = Medir la absorbancia a 600 nm cada 15 segundos durante dos a tres minutos, anotando estos valores en una tabla de tiempo y absorbancia.

8 Procesamiento de datos Para cada tubo graficar la absorbancia a 600 nm en función del tiempo en minutos y obtener la pendiente inicial. Promediar los valores de pendiente obtenidos para cada volumen de xantina oxidasa utilizado. Calcular la velocidad a partir de la pendiente y sabiendo que el coeficiente de absortividad del DCFIF es ε = M-1 cm-1. Calcular la actividad enzimática en el tubo de reacción como micromoles de DCFIF consumidos por minuto. Calcular la actividad enzimática por ml de ΔAbsorbancia pendiente = Δt Δ v = Act (U) = preparado de xantina oxidasa. [ ] [ DCFIF] Δt μmol DCFIF t(min) Act Enzima = = ml Calcular la actividad específica empleando la Enzima concentración de proteínas totales del preparado de Act esp = = xantina oxidasa. proteína U ml U mg [ ] [ ] prot.