Unidad III DNA, Genomas y Cromatina

Transcripción

1 Unidad III DNA, Genomas y Cromatina Adenina Purinas Guanina Pentosa Pirimidinas Timina Citosina Uracilo Las unidades monoméricas de los ácidos nucleicos son los nucleótidos trifosfato Base Enlace N- glicosídico 1630 Genética y Biología Molecular/ Grupo 4 Ribosa RNA 2 -Desoxiribosa DNA Nucleósido Nucleótido Bases Purinas Bases Pirimidinas Timina Citosina Uracilo Adenina Guanina pka (N1) pka (N3)

2 Pentosa La unión entre una base y una pentosa forma un Nucleósido Base Ribosa RNA 2 -Desoxiribosa DNA Enlace N- glicosídico Para purinas, es la unión entre el N9 con el C1 de la pentosa. Para pirmidinas, es la unión entre el N1 con el c1 de la pentosa. La unión de un nucleósido con trifosfato forma un Nucleótido Adenina Purinas Guanina Pentosa Pirimidinas Timina Citosina Uracilo Las unidades monoméricas de los ácidos nucleicos son los nucleótidos trifosfato Base Enlace N- glicosídico El fosfato se une en la posición 5 de la pentosa Ribosa RNA 2 -Desoxiribosa DNA Nucleósido Nucleótido 2

3 Nomenclatura de nucleósidos y nucleótidos Base Nucleósido Nucleótido Adenina d-adenosina d-amp, d-adp, d-atp Guanina d-guanosina d-gmp, d-gdp, d-gtp Citosina d-citidina d-cmp, d-cdp, d-ctp Timina d-timidina d-tmp, d-tdp, d- TTP Propiedades espectroscópicas de los nucleótidos trifosfato Nucleótido P.M. C.E.M. λ (nm) datp , dctp 467 9, dgtp , dttp 482 9, CEM => Coeficiente de extinción molar Los nucleótidos se unen covalentemente por enlaces fosfodiéster Watson y Crick predijeron la estructura de la doble hélice de DNA a partir de datos de cristalografía de rayos X El enlace fosfodiéster se dan entre las posiciones 3 y 5 de la pentosa Rosalind Franklin obtuvo los datos cristalográficos 3

4 Las dos cadenas de nucleótidos se estabilizan por puentes de hidrógeno que se forman entre una purina y una pirimidina Una guanina se aparea con una citosina Una adenina se aparea con una timina El par G = C es estabilizado por 3 puentes de H El hecho de que las bases se encuentren en el mismo plano, estabiliza los puentes de H Para el DNA de doble cadena, [G] = [C] y [A] = [T] La doble hélice de DNA es: Antiparalela Complementaria El par A = T es estabilizado por 2 puentes de H DIMENSIONES DE LA DOBLE HÉLICE DNA-B Las dimensiones del diámetro de la doble hélice pueden variar según la orientación de la base con respecto a la ribosa, el grado de hidratación del DNA y la secuencia Surco menor Surco mayor 4

5 Las formas A y Z del DNA son poco comunes en la naturaleza. DESNATURALIZACIÓN de ACIDOS NUCLEICOS: 1) No se rompen enlaces covalentes. 2) Se rompen puentes de hidrógeno (entre bases apareadas) 3) Como consecuencia, se va abriendo la doble hélice. 4) Cuando la doble hélice se abre, las bases nitrogenadas quedan más expuestas y por tanto absorben más la luz ultravioleta (efecto hipercrómico) Diámetro (A): A B S n m TM TM ºC Tm = TEMPERATURA DE FUSION El DNA es la molécula que acarrea la información genética Experimentos de Avery, McLeod y McCarty (1944) Pneumococcus sp. Cepa Rugosa (R) (avirulenta) Pneumococcus sp. Cepa Lisa (S) (virulenta) Experimentos de Griffith (1928) y de Avery, McLeod y McCarty (1944) Eliminación de lípidos y CHOs después de lisar a la bacteria inactivada por calor Tratamiento de la solución con proteasas, RNAsas, o DNAsas Pneumococcus sp. Cepa Lisa (S) inactivada con calor Cepa Lisa (S) inactivada con calor + Cepa R viva El DNA es la molécula transformante. El tratamiento con calor mata a Pneumococcus (S) Las bacterias de la cepa R son transformadas por un material termoestable de la cepa S Mezclar estas muestras con bacterias R y observar cuál transforma para generar bacterias virulentas. Solamente cuando se elimina el DNA, se pierde el principio transformante 5

6 Experimento de Hershey y Chase, 1952 Experimento de Hershey y Chase, 1952 Infección de E. coli con el fago T2 Crecer E. coli en medio con: 32 P 35 S Lisis de las bacterias y obtención de los fagos marcados diferencialmente Bacteriofago T-2 32 P Se usan los fagos marcados para infectar E. coli 35 S Desprendimiento de los fagos por agitación Replicación del bacteriofago ORGANIZACIÓN DE LOS GENOMAS El genoma es el conjunto de genes que contiene la información necesaria para que una célula pueda existir y reproducirse Los genomas de eucariontes son muy grandes. Hay regiones intergénicas muy largas. Los genes están separados por regiones de DNA muy largas. Además, en la mayoría de los eucariontes los genes están segmentados: Estructura: Exón Intrón Exón: Segmento del DNA que está representado en el RNAm maduro. Intrón: Segmento del DNA que es transcrito a RNA pero que es eliminado de éste. Corresponde a regiones no codificantes. La progenie contiene DNA marcado 6

7 Tamaños relativos de los genomas haploides (pb) de distintos organismos Sin embargo, el tamaño del genoma no es proporcional al número de genes cuando se comparan procariontes y eucariontes Organismo Genoma (pb) # genes Bacteriófago φx x Escherichia coli 4.6 x ,400 Pseudomonas aeruginosa 6.3 x ,600 Plasmodium falcifarum 2.3 x ,300 Neurospora crassa 3.8 x ,100 Drosophila melanogaster 1.22 x ,000 Oryza sativa (arroz) 3.9 x , pb en el genoma haploide Homo sapiens 3.3 x ,000 La estructura del genoma varía mucho entre eucariontes y procariontes. Organización de genes en un cromosoma humano Cromosoma humano Sección (10%) del cromosoma (~40 genes) Sección (1%) del cromosoma (~4 genes) 1 gen, formado por 9 exónes El genoma en procariontes es más compacto que el de los eucariontes. 7

8 DNA basura? El 27.5% del genoma humano corresponde a genes y de éstas secuencias el solamente el 1.5% corresponde a regiones codificantes El genoma en bacterias está constituido por un solo cromosoma que forma un círculo cerrado covalentemente. Contiene aproximadamente 4,000 genes LINES (long interspersed nuclear elements) SINEs (short interspersed nuclear elements) LINES (long interspersed nuclear elements) Regiones codificantes de proteínas Genes El cromosoma bacteriano está súper compactado FORMAS TOPOLÓGICAS DEL DNA CIRCULAR CERRADO Una molécula circular localizada en el nucleoide de la célula. DNA cromosomal Plásmidos 8

9 El genoma en eucariontes está dividido en varios cromosomas. Los cromosomas son lineales El número de cromosomas de cada especie es característico de ésta Organismo Especie # diploide Humano Homos sapiens 46 Gato Felis catus 38 Bovino Bos taurus 60 Perro Canis familiaris 78 Caballo Eqqus caballus 64 Mosca fruta Drosophila melanogaster 8 Chícharo Pisum sativum 14 Arroz Oryza sativa 24 Frijol Phaseolus vulgaris 22 Maíz Zea mays 20 El DNA se encuentra empacado en los cromosomas eucariontes Segmento de doble hélice El DNA extendido de una célula de mamífero mediría aproximadamente 1 mt delongitud El DNA se encuentra empacado en los cromosomas eucariontes Segmento de doble hélice DNA + Histonas = Nucleosomas El DNA extendido de una célula de mamífero mediría aproximadamente 1 mt delongitud Octámero de Histonas: H2A; H2B; H3;H4 9

10 CONTENIDO DE LYS Y ARG DE LAS HISTONAS HISTONA %LYS %ARG H H2A H2B H H Esquema de una sección de la cromatina El octámero de histonas se asocia por int. hidrofóbicas Un nucleosoma consiste en 147 pb de DNA enrrollados en el octámero de histonas. INTERACCIONES ENTRE LAS HISTONAS Y EL DNA EN LOS EUCARIOTES Estructura de un nucleosoma El DNA se encuentra empacado en los cromosomas eucariontes Segmento de doble hélice DNA + Histonas = Nucleosomas El DNA extendido de una célula de mamífero mediría aproximadamente 1 mt delongitud Empaquetamiento de nucleosomas. Cromatina de 30 nm Octámero de Histonas: H2A; H2B; H3;H4 10

11 El DNA se encuentra empacado en los cromosomas eucariontes Segmento de doble hélice DNA + Histonas = Nucleosomas El DNA extendido de una célula de mamífero mediría aproximadamente 1 mt delongitud El DNA se encuentra empacado en los cromosomas eucariontes Segmento de doble hélice DNA + Histonas = Nucleosomas El DNA extendido de una célula de mamífero mediría aproximadamente 1 mt delongitud Empaquetamiento de nucleosomas. Cromatina de 30 nm Sección de cromosoma en forma extendida Octámero de Histonas: H2A; H2B; H3;H4 Empaquetamiento de nucleosomas. Cromatina de 30 nm Sección de cromosoma en forma extendida Octámero de Histonas: H2A; H2B; H3;H4 Sección de cromosoma en forma condensada El DNA se encuentra empacado en los cromosomas eucariontes Segmento de doble hélice DNA + Histonas = Nucleosomas El DNA extendido de una célula de mamífero mediría aproximadamente 1 mt delongitud Empaquetamiento de nucleosomas. Cromatina de 30 nm Sección de cromosoma en forma extendida Octámero de Histonas: H2A; H2B; H3;H4 Sección de cromosoma en forma condensada Cromosoma en metafase 11

12 Heterocromatina y Eucromatina Heterocromatina: Segmentos del cromosoma que se tiñen fuertemente y permanecen visibles, prácticamente, durante todo el ciclo celular. Regiones supercondensadas. Secuencias repetitivas de DNA, regiones no transcribibles en el genoma. Heterocromatina constitutiva. Se mantiene supercompactada en todas las fases del ciclo celular. Heterocromatina facultativa. Su grado de compactación varía a lo largo del ciclo celular y desarrollo. Eucromatina: Segmentos del cromosoma que no son visibles durante la telofase e interfase. Regiones que se condensan y se descondensan. Secuencias que contienen genes y que son transcripcionalmente activas. Centrómeros. Son regiones repetitivas de DNA ( pb) n Constituyen el sitio de unión de las fibras del huso mitótico. Componen del 1% al 3% de la secuencia de un genoma. Su posición varía en los distintos cromosomas. Telómeros Se encuentran en los extremos de los cromosomas. Se requieren para la replicación y estabilidad de los cromosomas. Son secuencias repetidas de DNA, en humanos: -TTAGGG- que se repite entre 250 a 1,500 veces. Los cromosomas ocupan compartimentos discretos en el núcleo. Las regiones de los cromosomas que tienen pocos genes se encuentran en la periferia del núcleo. Territorios cromosomales 12

13 Cómo podemos explicar el metabolismo del DNA como replicación, reparación y recombinación, si éste se encuentra estrechamente unido a las histonas formando los nucleosomas? La acetilación de las lisina neutraliza su carga positiva; se desestabiliza la interacción DNA proteína. Tipo de interacciones que estabilizan la unión DNAhistona. Cómo se pueden romper estas interacciones? Es un proceso reversible, pues hay: Histonas acetil-transferasas Histonas desacetilasas Estas modificaciones ocurren principalmente en las histonas H3 y H4 Cariotipo El set de cromosomas de una célula o individuo. Durante la metafase los cromosomas se pueden observar ordenados e identificar por su tamaño desde la posición del centrómero. Citogenética Tijo y Levan desarrollan las técnicas para teñir y observar a los cromosomas durante la metafase. Los cromosomas están duplicados y condensados pero el centrómero no se ha dividido. Clasificación de cromosomas por su tamaño y la posición del centrómero: Metacéntricos: Los dos brazos del mismo tamaño aprox. Submetacéntricos: Se observa un brazo corto (p) y un brazo largo (q). Acrocéntricos: Muestran una fuerte tinción, llamada satélite, en el extremo del brazo corto. 13

14 Cariotipo humano. Cromosomas en metafase. Cariotipo humano. Cromosomas en metafase. Morfología de los cromosomas La tinción clásica para el análisis del cariotipo es con el colorante Giemsa que tiñe diferencialmente algunas regiones de los cromosomas. Se distinguen las bandas G, que se tiñen con Giemsa y las bandas R que no se tiñen. Cada cromosoma tiene un patrón típico de bandas G y R, lo que permite su identificación. 14

15 Hay otras técnicas basadas en la hibridación de ácidos nucleicos que permiten identificar específicamente a cada uno de los cromosomas. Se emplean fluoróforos por lo que la observación de las preparaciones se debe hacer en un microscopio de epifluorescencia. El análisis de cariotipo tiene varias aplicaciones clínicas. Amniocentesis: Edad de la madre, antecedentes por ultrasonido Linfocitos. Diagnóstico de anormalidades congénitas. Patologías asociadas al cariotipo. EUPLOIDÍAS. Organismos que poseen múltiplos de la dotación cromosómica básica. Linfocitos circulantes en sangre Fijación, tinción y análisis de cariotipo Fitohemaglutinina Linfocitos estimulados. Alta división celular colcimida La mitosis se detiene en metafase Triploidía. 3n = 69 Ocurre si: Espermatocito diploide Ovocito diploide Dispermia durante la fertilización (fecundación por dos espermatozoides) Ocurre aborto en el 4 to mes y el feto muestra severas malformaciones. 15

16 Patologías asociadas al cariotipo. Aneuploidías. El número cromosómico difiere del silvestre en parte de la dotación cromosómica. Trisómico (2n + 1) Monosómico (2n 1) Nulisómico (2n 2) Trisomías (47; XY). De los 22 autosomas humanos, solamente 3 ocurren como trisomías en los productos que nacen. Otras trisomías son letales, y el producto muere durante la embriogénesis. Trisomía 21: Incidencia de 1/800 nacimientos. Trisomía 18: Incidencia de 1/10,000 nacimientos Trisomía 13: Incidencia de 1/25,000 nacimientos Las trisomías se deben a un defecto en la meiosis en la que no se separan los cromosomas. NO DISYUNCIÓN Esto puede ocurrir durante la meiosis I o meiosis II. Alineamiento de los cromosomas en el plano de la metafase Uno de los pares de cromosomas no se separan Meiosis Todos los gametos tienen un número anormal de cromosomas En la trisomía 21, la edad de la madre en el momento de la concepción es un factor de riesgo importante. Monosomías autosómicas. Falta alguno de los pares de cromosomas autosómicos. El genotipo es (45, XY). Todos son letales y llevan a la muerte del embrión durante los primeros días o semanas después de la concepción. Cromosoma X adicional. Genotipo (47; XXY). Conduce a una sintomatología de: Estatura alta Ausencia de caracteres sexuales secundarios No hay espermatogénesis Otros genotipos: 47; XYY => Varón, sin algún fenotipo característico. 47; XXX => Hembra, tampoco hay ningún fenotipo severo asociado. Inactivación del cromosoma X. En las células de mamíferos de hembras, solamente un cromosoma X está activo. El otro se inactiva y así permanece. Citológicamente, se observa como una masa de cromatina condensada empaquetada (Cuerpos de Barr). La inactivación ocurre durante los primeros días de la vida embrionaria. Se puede inactivar el X p o el X m 16

17 Inactivación del cromosoma X. MOSAICOS. Debido a que en algunas células se inactiva el cromosoma X p y en otras el cromosoma X m, el embrión y el organismo resultante se convierten en una mezcla de los dos tipos de células que expresan distintos alelos (mosaicos). En organismos, como gatos y ratones, en que el gen que codifica para la pigmentación del pelaje está presente en el cromosoma X, se observan mosaicos de colores en las hembras. => Calico 17