Experiencias en Q-PCR para la aplicación y diagnóstico en Medicina Humana
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- Mariano Río Chávez
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1 Experiencias en Q-PCR para la aplicación y diagnóstico en Medicina Humana MSc. Gonzalo Manrique Laboratorio de Biología Molecular Asociación Española Junio de 2009
2 INDICE INTRODUCCION (conceptos básicos, CT ó CP y eficiencia) REPORTEROS FLUORECENTES: TaqMan, Beacons moleculares, SYBR Green, Scorpions y otros CARACTERISTICAS DEL LightCycler 2.0 TIPOS DE ANALISIS Curvas de melting y genotipificación Cuantificación absoluta Cuantificación relativa CONTROLES DE CALIDAD ESTANDARIZACION OPTIMIZACION DEL ENZAYO ANALISIS DE DATOS LINKS
3 INTRODUCCION Detección y cuantificación de un reporter fluorescente (fluoróforo), cuya señal aumenta en proporción directa a la cantidad de producto Los productos de amplificación se observan a medida que transcurren los ciclos de amplificación
4 INTRODUCCIÓN Real-time PCR PCR convencional Preparación de la muestra No integrada No integrada Amplificación y detección Integrada y simultánea No Integrada Marcadores de sondas Fluoróforos Radioisótopos, biotina o enzimas Tiempo total 30 min (LightCycler: 35 ciclos de 32 capilares) 4-48 h Contaminación Riesgo reducido debido a sistema cerrado Riesgo significativo: sistema abierto Análisis de resultados Automatizado. Software, requiere de entrenamiento No automatizado Costo Mayor inversión en el equipamiento. Reactivos mas caros Menor costo del equipamiento y reactivos
5 Ventajas del PCR en tiempo real Simple y rápida (semi-automatizada). No hay manipulación post-pcr. Eliminación de contaminación por amplicones. Cuantificación del DNA o RNA molde inicial. Muy sensible. Detección de productos inespecíficos con la opción curva de desnaturalización (Melt-Curve). Detección de más de un producto específico en una misma reacción. Extraordinariamente específico. Amplio rango dinámico.
6 Fig. 1. Growing use of real-time PCR Valasek, M. A. et al. Advan. Physiol. Edu. 29: ; doi: /advan Copyright 2005 American Physiological Society
7 Principios del PCR en Tiempo Real real-time PCR amplification plots (7 x 10-fold dilns. + NTC) End point Señal fluorecente (no cuantitativo) Threshold o ciclo umbral ciclos de PCR CT Bajo (Alto no. copia) CT Alto (bajo no. copia)
8 Threshold Cycle Threshold cycle CT ó Cp, es el pimer ciclo al cual se detecta un incremento significativo de la fluorecencia por encima del nivel basal En cada ciclo hay una duplicación en el Nº de copias (asumiendo eficiencia del 100%) El CT se correlaciona con el número de copias al inicio de la reacción
9 Eficenica de la amplificación La eficiencia se calculaa partir de la pendiente (slope) de la curva estándar. E=10 (-1/pend) Ej: pend = -3,462 E= 10 (-1/3,462) =1,95 La eficiencia debe estar entre 90 y 110% (la pendiente ideal es de -3,32
10 Reactivos fluorescentes: Sondas ( probes ) e intercalantes Existen varios tipos de reactivos fluorescentes para la detección de productos en el real-time PCR: Agentes intercalantes: SYBRgreen Sondas de hidrólisis (TaqMan, Perkin-Elmer) Sondas horquilla (Molecular Beacons, Strategen) Sondas de hibridación (LigthCycler, Roche) Otras: Sondas Scorpions Ampli Fluor Plexor
11 Agentes intercalantes: SYBRgreen SYBR green Es un agente intercalante que se une al ADN doble cadena dando un incremento de la fluorescencia a medida que aumenta la cantidad de producto de PCR.
12 Sondas de hidrólisis TaqMan : se basa en la actividad 5 - exonucleasa de la Taq ADN polimerasa. Funcionamiento de sonda de hidrólisis (TaqMan ) (a) La sonda intacta no emite fluorescencia (fluoroforo enmascarado o apagado). (b) Sonda hidrolizada por Taq polimerasa emite fluorescencia.
13 Sondas horquilla Sonda horquilla Molecular Beacons (a) En ausencia de la secuencia blanco se forma estructura de horquilla. (b) En presencia de la secuencia blanco la estructura se desarma y el fuoroforo reportero fluoresce.
14 Sondas de hibridación FRET Fluorescence Resonance Energy Transfer Hibridación de sondas específicas marcadas con 2 fluorocromos: dador y aceptor. (a) Las dos sondas (aceptora y dadora) poseen fluoróforos distintos. (b) La transferencia de energía de resonancia fluorescente ocurre cuando ambas sondas se encuentran cercanas.
15 Sondas Scorpions
16 AmpliFluor y Lux Primer Clic aquí
17 LightCycler 2.0 Real-Time PCR Rápida identificación de productos Aplicaciones: Investigación, Salud, Alimentos Resultados rápidos y precisos Monitoreo en tiempo real: fluorescencia (30 minutos: 35 ciclos de 32 capilares) Eliminación riesgo contaminación 6 canales de detección
18 Tecnología Aire para el calentamiento y enfriamiento de la cámara de reacción y los capilares especialmente diseñados (relación volumen/superficie optimizada): permite realizar corrida de 35 ciclos de PCR, con 32 capilares en aprox. 30 min. 6 canales de detección
19 Tipos de análisis en LC 2.0 Qualitative Detection Determina presencia o ausencia de la secuencia target en la muestra. Absolute and Relative Quantification Calcula la concentración del target en muestras desconocidas (Cuantificación Absoluta) o el ratio de la secuencia target en función de un gen housekeeping (Cuantificación Relativa) Melting Curve Analysis Analiza la Tm y perfiles que permite obtener información específica del producto de PCR. Nucleic Acid Quantification Determina la concentración de ácidos nucleicos sin realizar la reacción de amplificación.
20 Ej: Genotipificación utilizando Tm
21 Sondas de hibridación HSV DNA pol Primers common to HSV 1 & 2 Hybridisation probes (to HSV-1) HSV-1 no mismatch Amplicon HSV-2 mismatch
22 Melting Curve Analysis 55 C HSV 1 o HSV 2 HSV 2 HSV 1 67oC HSV 1 HSV 2 73oC HSV 1 HSV 2
23 Ej: Cuantificación Absoluta
24 Cuantificación Relativa Expresión relativa de un gen de interés en relación a un gen de referencia (housekeeping gene) La cuantificación relativa puede realizarse con o sin curva estandar. Sin curva estandar: Se han publicado diferentes modelos matemáticos para calcular la expresión relativa.
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27 CONTROLES DE CALIDAD Eficiencia: múltiples factores pueden afectar la eficiencia de la amplificación Son críticos los controles negativos positivos, y calibradores
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29 Conclusiones La introducción de PCR en Tiempo Real en diversos campos de la investigación y diagnóstico ha sido un gran avance para la obtención y análisis de resultados. Gran cantidad de datos pueden generarse en un período de tiempo corto. Aunque es importante dedicar tiempo al chequeo y validación de los mismos, así como a la estandarización de la técnica. La mayoría de estos ensayos se caracterizan por la alta precisión y reproducibilidad. La veracidad de los resultados está muy ligada a la preparación de la muestra, así como la elección del gen blanco (expresión génica) y a los controles de calidad. Se ha ampliado el campo de aplicaciones en diversas áreas de investigación y diagnóstico. Análisis costo-beneficio respecto a PCR convencional: ahorro tiempo, ampliación aplicaciones, capacidad análisis, sensibilidad, reproducibilidad, SW análisis y almacenamiento de datos.
30 Links (Clic en el texto) Guia completa y resumida de QPCR, en pdf de Stratagene Empresa dedicada al diseño y síntesis de oligos y sondas marcadas. (animaciones y mas) Pag web que describe y resume todos los aspectos técnicos relacionados con realtime qpcr & qrt-pcr
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