UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA FACULTAD DE MEDICINA DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGIA PRACTICAS DE LABORATORIO COCOS GRAM POSITIVOS

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1 UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA FACULTAD DE MEDICINA DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGIA PRACTICAS DE LABORATORIO COCOS GRAM POSITIVOS Maye Bernal Rivera Introducción Los cocos gram positivos excluyendo las enterobacterias, son los microorganismos más frecuentemente aislados de muestras de pacientes y se han involucrado como agentes importantes en procesos de enfermedades infecciosas desde el año Se encuentran ampliamente distribuidos en la naturaleza y forman parte de la flora microbiana normal de la piel y las mucosas del hombre y de animales. Las infecciones en el hombre se producen por contacto directo con individuos infectados o portadores sanos, o por penetración a través de piel y mucosas mediante objetos corto punzantes por heridas, trauma o procedimientos quirúrgicos o por la acción de toxinas producidas por cepas de algunas especies. Staphylococcus Los estafilococos son células esféricas gram positivas dispuestas en grupos semejantes a racimos de uvas en medios sólidos o en pares, cadenas o tétradas, en medios líquidos. Crecen bien en medios simples y de acuerdo a la especie producen diferentes pigmentos: blanco, amarillo y dorado y algunas de ellas producen beta hemólisis. Son catalasa positiva, inmóviles, no esporulados, con raras excepciones, no encapsulados y son aerobios o anaerobios facultativos. Streptococcus Los estreptococos son células esféricas u ovaladas gram positivas dispuestas en pares o cadenas cortas o largas. Son más exigentes que los estafilococos, no crecen en medios simples, por el contrario requieren de factores de crecimiento como la sangre y sus derivados. Producen diferentes tipos de hemólisis, característica que permite clasificarlos en beta hemolíticos, alfa hemolíticos o no hemolíticos. No forman pigmentos, son catalasa negativa, inmóviles, no esporulados, con formación de cápsula variable. Son aerobios y anaerobios facultativos. Enterococcus Los enterococos clasificados anteriormente como una especie de estreptococos, son células esféricas gram positivas dispuestas en pares o cadenas cortas. Al igual que los estreptococos, requieren de factores de crecimiento como la sangre y sus derivados. Son capaces de desarrollarse en medios que contienen altas concentraciones de NaCl (6.5%) y de bilis (40%). Pueden producir hemólisis de tipo alfa, beta o ser no hemolíticos. No forman pigmentos, son catalasa negativa,

2 inmóviles, no esporulados, con formación de cápsula variable. Son aerobios y anaerobios facultativos. PRACTICA DE LABORATORIO Objetivo Proporcionar al estudiante el conocimiento científico y las habilidades prácticas de los métodos y técnicas utilizados en Microbiología Médica para el aislamiento e identificación de las principales especies de cocos gram positivos que afectan al hombre. PARTE I. SIEMBRA Objetivos específicos - Establecer la diferencia entre géneros de cocos gram positivos - Estudiar las características macroscópicas, microscópicas y cambios producidos en el medio de diferentes especies de cocos gram positivos - Conocer algunas de las pruebas bioquímicas de laboratorio utilizadas para la identificación de especies de cocos gram positivos - Identificar especies de Staphylococcus, Streptococcus y Enterococcus - Estudiar el caso clínico y aislar e identificar el agente etiológico, a partir de la muestra asignada de cada paciente. - Asa curva - Mechero - Casos clínicos - Muestras biológicas - Caldo BHI - Agar Sangre - Campana con vela (CO 2 ) e incubadora a 37ºC 1. Marcar adecuadamente cada uno de los medios. 2. Sembrar la muestra en caldo BHI y agar sangre (por agotamiento) 3. Incubar a 37ºC por 24 horas en aerobiosis con atmósfera de CO 2 4. Realizar pruebas para la identificación del agente, según instrucción del profesor. (Manitol, Novobiocina, DNAasa, Bacitracina, CAMP, Optoquina, KF, Motilidad, etc) Actividad 1. Investigue 3 características que diferencien las bacterias gram positivas de las gram negativas

3 2. Escriba qué pruebas se debe realizar para diferenciar Staphylococcus de Streptococcus 3. Cuáles son las especies de Staphylococcus, Streptococcus y Enterococcus más importantes en patología humana? PARTE II. LECTURA E INTERPRETACION PARA LA DIFERENCIACION E IDENTIFICACIÓN DEL AGENTE ETIOLÓGICO. Sthaphylococcus. Diagnóstico de Laboratorio Las colonias de estafilococo son fáciles de reconocer, relativamente son grandes tienen de 2 a 3 mm o más, dependiendo de la edad del cultivo. Las colonias son circulares, convexas, de superficie lisa, bordes enteros, cremosas, blancas o amarillas o doradas. Para iniciar la identificación además de las características de crecimiento tanto en medio líquido como sólido y la coloración de Gram, se utiliza la prueba de la catalasa que permite diferenciarlos del género estreptococo, el cual carece de esta enzima. Para identificar especies se utilizan diferentes pruebas dentro de las cuales están las siguientes. Pruebas Bioquímicas CATALASA La catalasa es una enzima que descompone el peróxido de hidrógeno (H2O2) en agua y oxígeno según la siguiente reacción: 2H2O2 2H2O + O2 (burbujas de gas) La prueba catalasa se usa con frecuencia, para diferenciar miembros de la familia Micrococcaceae de miembros de la familia Streptococcaceae. - Colonia aislada (Medio de cultivo sembrado e incubado) - Peróxido de hidrógeno al 3% 1. Con un palillo de madera, transferir parte del centro de una colonia a la superficie de un portaobjetos. 2. Agregar una gota de peróxido de hidrógeno al 3% y observar la formación de efervescencia o burbujas. - Positiva: Una prueba positiva esta dada por la aparición rápida y sostenida de burbujas o efervescencia. - Negativa: Unas pocas burbujas pequeñas después de 20 a 30 segundos se considera un resultado negativo.

4 - Falsas Positivas: Los eritrocitos poseen catalasa, por lo cual debe tenerse cuidado de no tomar eritrocitos del agar sangre junto con el material de la colonia. COAGULASA La coagulasa es una proteína de composición química desconocida, que tiene actividad similar a la protombina, capaz de convertir el fibrinógeno en fibrina, lo que da como resultado la formación de un coágulo visible en los sistemas apropiados. Se utiliza para identificar Staphylococcus aureus de otras especies. La coagulasa se presenta en dos formas, ligada y libre y para determinarlas se utiliza dos procedimientos: en lámina y en tubo; si la prueba en lámina da positiva, no hay necesidad de hacer la prueba en tubo. Prueba en lámina (Coagulasa ligada) - Lámina - Plasma de conejo - Colocar 1 gota de plasma sobre la lámina - Agregar la colonia en estudio - Mezclar - Positivo: La presencia de aglutinación o formación de grumos - Negativo: No se observa aglutinación, permanece emulsionada la colonia Prueba en tubo (Coagulasa libre) - Tubo de ensayo con 0.5 ml de plasma de conejo - Agregar la colonia en estudio al tubo de ensayo - Incubar a 35ºC por 4 horas; si no se ha formado el coágulo, reincubar por 24 horas a temperatura ambiente - Positivo: La formación de un coágulo - Negativo: No se observa formación de coagulo, permanece líquido el plasma MANITOL

5 Al utilizar el microorganismo al manitol como sustrato e incorporarlo al sistema Embden-Meyerhoff-Parnas, que tiene como productos finales ácidos que provocan la disminución del ph en el medio de cultivo, que se detecta mediante el viraje del indicador rojo de fenol a amarillo. - Caldo de Manitol - Sembrar la colonia en el caldo - Positivo: cuando el indicador del medio vira a amarillo - Negativo: cuando conserva su color rojo DNAsa Se basa en la presencia de la enzima termoestable DNAsa que es capaz de clivar los enlaces fosfodiester internos de la molécula de DNA. Para evidenciar la presencia de la enzima, se inunda el medio con ácido clorhídrico normal, el cual precipita la molécula del ácido pero no sus polímeros. - Agar DNA - Acido clorhídrico 1 Normal - Sembrar por estría gruesa la colonia en estudio, en el agar DNA - A las 24 horas: Inundar la superficie del medio con HCL 1N, esperar 2 minutos - Positivo: La formación de un halo transparente alrededor de la siembra indica presencia de DNAsa. - Negativo: La formación de un precipitado alrededor de la siembra indica ausencia de la enzima NOVOBIOCINA

6 Los estafilococos coagulasa negativos pueden dividirse en especies sensibles y resistentes a la novobiocina. Staphylococcus saprophyticus es de las especies resistentes, la más frecuente en humanos, causante de infecciones de el tracto urinario. Por lo tanto esta prueba proporciona una identificación presuntiva confiable de esta especie. - Disco de novobiocina de 5ug - Agar sangre de carnero - Preparar una suspensión (equivalente al estándar 0.5 de McFarland) del microorganismo en agua destilada. - Sembrar con escobillón en forma masiva sobre la placa de Mueller Hinton - Colocar con la pinza un disco de novobiocina en el centro - Incubar a 35ºC durante por 24 horas - Sensible: Halo de inhibición mayor a 16 mm - Resistente: Halo de inhibición menor a los 12 mm Tabla de identificación género Staphylococcus Prueba S. aureus S. epidermidis S. saprophyticus Coagulasa DNAsa Manitol Novobiocina S R Streptococcus y Enterococcus. Diagnóstico de Laboratorio Las colonias de estreptococos y enterococos son variables, dependiendo de la especie; Para iniciar la identificación además de las características de crecimiento tanto en medio líquido como sólido y la coloración de Gram, se utiliza la prueba de la catalasa que permite diferenciarlos del género estafilococo, el cual produce esta enzima. Para identificar especies se utilizan diferentes pruebas dentro de las cuales están las siguientes. Pruebas Bioquímicas BACITRACINA

7 Streptococcus pyogenes es sensible a bajas concentraciones (0.04U) de Bacitracina. - Agar sangre - Discos de Bacitracina : - Sembrar la colonia masivamente en cuadrícula sobre una placa de agar sangre - Colocar un disco de Bacitracina y presionar suavemente - Sensible: La aparición de cualquier halo de inhibición alrededor del disco - Resistente: Crecimiento alrededor del disco CAMP Se basa en que Streptococcus agalactiae produce un factor llamado CAMP (factor de monofosfato de adenina cíclica) que aumenta la zona de hemólisis producida por algunas cepas de Staphylococcus aureus productoras de ß lisina. - Agar sangre - Cepa de Staphylococcus aureus ß lisina positivo : - Sembrar sobre la palca de agar una estría de estafilococo ß lisina positivo - Perpendicular al estafilococo, hacer una estría con la colonia en estudio - Positivo: Presencia de una zona de hemólisis en forma de flecha - Negativo: Ausencia de la hemólisis en flecha OPTOQUINA El clorhidrato de etildihidrocupreína (optoquina) a muy bajas concentraciones, inhibe en forma selectiva el crecimiento de Streptococcus pneumoniae. La optoquina puede inhibir a otros estreptococos del grupo viridans, pero solo a concentraciones más altas.

8 - Agar sangre - Discos de Optoquina 5 ug. : - Sembrar la colonia masivamente en cuadrícula sobre una placa de agar sangre - Colocar un disco de Optoquina y presionar suavemente - Sensible: La aparición de un halo de inhibición mayor a 16 mm de diámetro - Resistente: Crecimiento alrededor del disco o halos menores a 16 mm KF Determinar la capacidad de un microorganismo de crecer en un medio inhibidor y fermentar un carbohidrato produciendo un cambio de color. - Agar KF : - Sembrar por doble picadura y estría en la superficie - Positivo: El medio vira a amarillo - Negativo: el medio permanece del color original PRACTICA DE LABORATORIO PARTE II. LECTURA E INTERPRETACION DE LOS CULTIVOS Y PRUEBAS DE IDENTIFICACIÓN Objetivos específicos - Estudiar las características macroscópicas de las colonias de cocos gram positivos - Diferenciar los tipos de hemólisis - Observar las características microscópicas de los diferentes géneros - Leer e interpretar diferentes pruebas bioquímicas utilizadas para la identificación de cocos gram positivos - Cultivos de las muestras de los pacientes asignadas y medios de las diferentes pruebas bioquímicas realizadas.

9 - Láminas, asas, mecheros, marcador de vidrio, papel absorbente - Colorantes para Gram - Microscopio y aceite de inmersión. 1. Describir las características macroscópicas de la colonia 2. Clasificar el tipo de hemólisis 3. Observar las características microscópicas mediante la coloración de Gram 4. Leer e interpretar las diferentes pruebas bioquímicas 5. Identificar el agente etiológico (Género y especie) 6. Revisar los casos clínicos y hallazgos de los dem Actividad 4. Dibuje las diferentes características microscópicas de los hallazgos. 5. Defina los diferentes tipos de hemólisis. 6. Realice un flujograma para la identificación del agente etiológico de la muestra asignada, 7. Escriba 5 enfermedades infecciosas que produzca cada uno de los agentes etiológicos aislados en el grupo y otras especies de microorganismos Gram positivos importantes en patología humana. 8. Para cada una de las entidades descritas en clase, escriba el examen microbiológico de laboratorio, útil para su diagnóstico.