TÉCNICAS DE BIOLOGÍA MOLECULAR PARA HPV E ITS EN ADOLESCENTES. María A. Martínez Tagle MSc, Ph.D

Transcripción

1 Programa de Microbiología- ICBM Facultad de Medicina-Universidad de Chile TÉCNICAS DE BIOLOGÍA MOLECULAR PARA HPV E ITS EN ADOLESCENTES María A. Martínez Tagle MSc, Ph.D

2 Declaración de Conflictos de Interés Declaro no tener conflicto de interés.

3 Ventajas de las técnicas de Biología molecular en la detección y diagnóstico de ITS Mayor sensibilidad No requieren viabilidad de los microorganismos Eficientes con muestras No invasivas Requieren menos tiempo para entrega de resultados De elección en el diagnóstico de N. gonorrhoeae y C. trachomatis de muestras urogenitales y No genitales en adolescentes y adultos Mayor eficiencia que las técnicas convencionales para el diagnóstico de T. vaginalis, Virus Herpes simplex y HPV

4 Pruebas que han superado las TAAN comerciales en su desarrollo Ausencia de reacciones falsas negativas, por mutaciones en los blancos de amplificación Ausencia de reactividad cruzada Estándar de referencia de validación Sensible y Específico Elevado VPP Elevado VPN No existen TAAN perfectas No todos las TAAN son iguales Distintas plataformas, blancos de amplificación, partidores distintos flujogramas y poblaciones empleadas en la validación

5 Limitaciones de las TAAN Mayor costo que es difícil de asumir por los países en desarrollo Buen costo-beneficio si pensamos en complicaciones y secuelas que se evitan Exigencias para la acreditación Diseño de laboratorios Personal competente Organismo acreditador Acceso expedito de los Laboratorios a: Insumos Mantención de equipos

6 Recomendaciones de Screening de C. trachomatis y N. gonorrhoeae en EUA ITS USPSTF # CDC AAFP ACOG C. trachomatis < 25 años Con riesgo < 25 años Con riesgo < 25 años Con riesgo < 25 años Con riesgo N.gonorrhoeae < 25 años Con riesgo No Con riesgo < 25 años Con riesgo Adolescentes Con riesgo MMWR 2014; 63:2 # US Preventive Services Task Force, 2013

7 Diagnóstico de laboratorio de C. trachomatis y N. gonorrhoeae. CDC-Abril 2014 MMWR 2014; 63:2 Las TAAN son las técnicas recomendadas para screening ó diagnóstico de C. trachomatis y N gonorrhoeae en muestras urogenitales Indicaciones sobre las muestras urogenitales: Obtenidas por el paciente (Screening) ó por el personal médico si se requiere examen clínico Hombres: Orina de 1er chorro ó secreción uretral son equivalentes Mujeres: Muestras vaginales ó endocervicales ú orina de 1er chorro. La orina es 10% menos sensible que las muestras vaginales ó cervicales Indicaciones sobre las técnicas No se requiere confirmar los resultados positivos, porque tienen: Especificidades >99% y VPP>90%

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9 Comparación muestras clínicas para el diagnóstico de C. trachomatis Muestras clínicas : -vaginales tomadas por la paciente - endocervicales tomadas posteriormente por el médico durante el examen clínico Población: mujeres 16 años (Centro de Salud Sexual, UK) Laboratorio: TAAN Aptima AC2, confirmado Prevalencia de infección 10,3% BMJ 2012; 345:e8013

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11 Qué se recomienda para el análisis de muestras rectales y orofaríngeas? Las TAAN son las técnicas de elección para screening ó diagnóstico de C. trachomatis y N. gonorrhoeae en muestras rectales y orofaríngeas La sensibilidad de las técnicas clásicas es muy baja en muestras extragenitales Los TAAN comerciales aún no han sido aprobados para el estudio de muestras No urogenitales En EUA los laboratorios deben seguir las indicaciones de Clinical Laboratory Improvement Amendments (CLIA) (Este Instituto es de la FDA y otorga certificación) MMWR 2014; 63:2

12 TAANs comerciales aprobadas por FDA para diagnóstico de N. gonorrhoeae y C. trachomatis Varias plataformas de TAAN aprobadas por la FDA Desarrolladas por 5 firmas comerciales La mayoría corresponden a técnicas de 2ª generación Algunas son útiles para laboratorios pequeños y otras son plataformas robotizadas para uso en laboratorios de gran complejidad Abbott RealTime m 2000 Reacción en cadena de la polimerasa Roche, Amplicor y COBAS Reacción en cadena de la polimerasa Hologic/ Gen-Probe, Aptima (Amplificación mediada por transcripción (TMA) BD ProbeTec Amplificación por desplazamiento de hebra (SDA) Cepheid, Xpert assay Amplificación isotérmica

13 BD Viper System Totalmente automatizado Incluye sistema de extracción de ADN Eficiencia Hasta 736 resultados por 8,5 h Demora 20 min por corrida Flexibilidad Puede analizar hasta 5 ITS simultáneamente

14 Tecnología Point of care (POC) Ventajas particulares Para laboratorios de baja ó mediana complejidad Equipamiento mínimo Resultados en min

15 Xpert CT/NG, Cepheid 90 minute detection and differentiation of Chlamydia trachomatis and Neisseria gonorrhoeae Sensibilidad analítica 10 genomas Muy flexible

16 Eficiencia de Xpert para la detección de C. trachomatis y N. gonorrhoeae en distintas muestras clínicas Estándar de comparación: APTIMA Combo 2 (AC2) y ProbeTec ET J Clin Microbiol 2013; 51:

17 Diagnóstico de N. gonorrhoeae: Comparación de técnicas y muestras clínicas Población: 3859 mujeres 16 años (Clínica GU de UK) Prevalencia gonorrea: 2.5% Cultivo: Médico: Muestra uretral y endocervical TAAN (Aptima AC2): Paciente: vaginal Médico: Endocervical BMJ 2012; 345:e 8107 Técnica Sens (%) P Cultivo 81 <0.001 Vaginal 99 Endocervical 96 Sintomáticas Cultivo Vaginal 100 Endocervical 100 Asintomáticas Cultivo Vaginal 98 Endocervical 90

18 Consideraciones adicionales para el diagnóstico de N. gonorrhoeae Mantener el uso del cultivo para vigilancia epidemiológica y susceptibilidad antimicrobiana Frente a sospecha de falla terapéutica debe efectuarse diagnóstico por cultivo y efectuar estudio de susceptibilidad Los resultados positivos de las muestras faríngeas deben confirmarse con otro DNA blanco, por la posibilidad de reacción cruzada con Neisseria spp. Las técnicas comerciales actuales suelen traer 2-3 blancos de amplificación distintos

19 Trichomonas vaginalis Agente de transmisión sexual no viral de mayor prevalencia mundial (180 millones casos nuevos/ año) Diferencias por acceso a salud, raza, nivel socioeconómico En Chile la literatura informa prevalencias en adolescentes sexualmente activas entre 2,2 y 5,7% No es una ITS reportable en la mayoría de los países Factor reconocido de riesgo de: Transmisión de VIH y otras ITS Parto prematuro EIP Parasitol.dia 1999; 23: 9-14 Rev Chil Obstet Ginecol 2003; 68:

20 Comparación de técnicas para el diagnóstico de T. vaginalis N=337 mujeres Las TAAN de 1ª generación no lograban superar esta sensibilidad Clin Infect Dis 2002;35:

21 Diagnóstico molecular de T. vaginalis Protocolo: Aptima T. vaginalis (TMA). SR: Ex al fresco y cultivo. Discordancias: Alt TMA Diseño: Estudio prospectivo multicéntrico USA Población: 933 mujeres 14 años con y sin síntomas urogenitales Prevalencia de infección: 7% Muestras clínicas Sens.(%) Esp.(%) Vaginal Endocervical ,4 Thin Prep (PAP) ,6 Orina 95,2 98,9 J Clin Microbiol; 2011; 49:

22 Virus Herpes simplex Técnicas de diagnóstico Cultivo (Shell vial/tubo) Técnica de referencia Tinción con AcMo tipo específicos 70-99% sensibilidad, 99% especificidad Examen citológico Sensibilidad y especificidad <60% PCR Distingue ambos tipos de virus Mayor sensibilidad

23 POC para diagnóstico de VHS IsoAmp HSV assay Aprobado por la FDA en 2011 Amplificación isotérmica Sensibilidad analítica: VHS-1: 5,5 genomas VHS-2: 34,1 genomas Tiempo: 60 min Expert Rev Mol Diagn. 2012;12(5):

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25 Técnicas de diagnóstico de la infección por VPH Citología (PAP) Colposcopía Moleculares TAAN Hibridación

26 Técnicas moleculares para VPH aprobadas por FDA Detección Genotipificación En base a PCR Son más sensibles y específicas Permiten la detección de infecciones latentes subclínicas y activas Determinar los genotipos virales

27 Aprobado para: AMPLICOR HPV Test (ROCHE) Screening primario de cáncer cervical Resultados indeterminados del PAP (ASCUS) Amplificación del DNA mediante PCR Desnaturalización Hibridación de ácidos nucleicos para detectar: 13 hrvph Sensibilidad: 96,1% Especificidad: 95,6% VPN: 99,8%-100% Ausencia de reactividad cruzada Buena reproducibilidad

28 Genotipificación de VPH Linear Array VPH Genotyping Test Tipos de Virus que Detecta Etapas procedimiento Amplificación del ADN Hibridación de los amplicones con sondas biotiniladas Detección mediante ELISA Sensibilidad: 96% Especificidad: 99% Sin reactividad cruzada Buena reproducibilidad Precisión: %

29 La expresión de marn de los oncogenes E6 y E7 de VPH indica actividad viral Se observa que le progresión de las lesiones aumentan en relación directa con los niveles de mrna de E6 y E7 Detección de ARNm de E6/E7 de VPH

30 Importancia de una prueba mrna E6/E7 de HPV Prueba negativa No hay actividad oncogénica Alto VPN Prueba positiva Hay multiplicación viral El monitoreo de los niveles de mrna permite seguir la progresión de la enfermedad con alto VPP Alto nivel de expresión de E6/E7 Existe actividad celular anormal Integración viral

31 Utilidad de las técnicas moleculares para la detección del VPH La principal utilidad es la detección temprana de lesiones de alto riesgo NIC II/III y recurrencia post-tratamiento no identificadas por citología Screening de cáncer cervical primario Screening de cáncer cervical primario simultáneo con PAP Especiar los intervalos del screening para las mujeres que no presenten infección por hrvph Seguimiento de mujeres con citologías ASCUS Seguimiento post tratamiento de NIC II/III

32 Adolescentes con LSIL (lesión intraepitelial escamosa de bajo grado) Las adolescentes presentan alta frecuencia de anormalidades citológicas de bajo grado (ASC-US/LSIL) La prevalencia de VPH en <21 años con citología ASC-US varía entre el 70-77% Hay regresión espontánea en 91% de los casos a los 36 meses Muy pocas desarrollan cáncer cervical No está indicada la detección de VPH en adolescentes con ASC-US/LSIL para evitar colposcopias ó tratamientos innecesarios Am J Obstet Gynecol 2007; 197: J Natl Cancer Inst 2002; 94: 102-7

33 Gracias