Bases moleculares de la pérdida de expresión de moléculas HLA de clase I en tumores de colon

Tamaño: px

Comenzar la demostración a partir de la página:

Download "Bases moleculares de la pérdida de expresión de moléculas HLA de clase I en tumores de colon"

Cabrera Morales Servicio de Análisis Clínicos e

1 Bases moleculares de la pérdida de expresión de moléculas HLA de clase I en tumores de colon Carmen M. Cabrera Morales Servicio de Análisis Clínicos e Inmunología, Hospital Universitario Virgen de las Nieves, Granada

Incidencia global del cáncer en los países desarrollados y en vías de desarrollo Pulmón Mama Colon Países desarrollados Países en vías de desarrollo

2 Incidencia global del cáncer en los países desarrollados y en vías de desarrollo Pulmón Mama Colon Países desarrollados Países en vías de desarrollo Estómago Hígado Próstata Cérvix Esófago Vejiga Linfoma no-hodgkin Cavidad oral Leucemia Páncreas Miles de nuevos casos diagnosticados en el año 2010

3 Modelo de tumorogénesis S Epitelio T. conjuntivo (1) (2) (3) Epitelio T. conjuntivo S, célula stem epitelial

4 Progresión adenoma-carcinoma: inactivación bialelica de APC Intestino normal Pólipo adenomatoso Carcinoma APC + / - Poliposis adenomatosa familial Pérdida de APC en células epiteliales Transformación maligna Tumores de colon esporádicos

5 Inestabilidad cromosómica (A) e inestabilidad de microsatélites (B) en tumores de colon A APC/b-Catenina COX-2 K-Ras p53 18q LOH B Normal Adenoma temprano Adenoma tardío Carcinoma APC/b-Catenina Genes MMR (hmsh2, hmlh1) TGFbRII, BAX, IGF-IIR, E2F4, TCF-4

6 Cáncer inmunoediting: generación de variantes tumorales inmunorresistentes a) b) c) Inestabilidad genética/ heterogeneidad tumoral Selección inmune

7 Ruta biosintética de moléculas HLA de clase I Antígeno tumoral Proteasoma Péptidos RE Superficie celular TAP b2m Complejo trimérico Aparato de Golgi

8 FENOTIPO HLA CLASE I NORMAL A2 A29 Cw4 B44 Cw1 B8 FENOTIPOS HLA CLASE I EN TUMORES A29 B44 A2 A29 A2 A29 B44 Cw4 Cw4 FENOTIPO I Pérdida Total Cw1 FENOTIPO II Pérdida de Haplotipo Cw1 FENOTIPO III Pérdida de Locus Cw1 FENOTIPO IV Pérdida de alelo

9 OBJETIVOS Y DISEÑO EXPERIMENTAL 1. Conocer los mecanismos implicados en la pérdida total de moléculas HLA de clase I (Fenotipo I). 95 tumores de colon estudiados por inmunohistología (Abms W6/32, HC10) 14 tumores con pérdida total de expresión de moléculas HLA de clase I Expresión de cadena pesada HLA de clase I Expresión de genes de la maquinaria de procesamiento y presentación antigénica (TAP1/TAP2, LMP2/LMP7) Estudio de defectos estructurales y de expresión en b2m Inestabilidad de microsatélites (MSI)

10 2. Dada la elevada frecuencia de pérdida selectiva de HLA-B44 (Fenotipo IV) encontrada en tumores de colon por técnicas inmunohistológicas, determinar los mecanismos responsables. Tumores de colon con ausencia de expresión de HLA-B44 (Abms , 66HA) 13 tumores con pérdida de HLA-B44 Estudio de pérdida de heterozigosidad en 6p21.3 Expresión y defectos estructurales en HLA-B 3. Determinar la frecuencia de pérdida de haplotipo HLA-I

11 MICRODISECCIÓN DE SECCIONES DE COLON CRIOPRESERVADAS Extracción de DNA y mrna

12 Microdisección manual Pipeta Aguja

13 Patrones inmunohistológicos en tumores de colon con Fenotipo I A B

14 Proteína RNAm Tumor HC/b2m b2m HC HLA b2m CO CO CO CO CO CO CO CO CO CO CO CO CO CO HC, cadena pesada HLA de clase I

15 Mutaciones de b 2 m encontradas en secuencias de repetición de mononucleótidos en tumores gastrointestinales con fenotipo mutador 5 -ATG CTCTCTCT AAAAA CCCCC AAAAA TAA-3 SECUENCIA LÍDER EXÓN 2 Inserciones y deleciones Mutaciones missense

Análisis de inestabilidad de microsatélites en tumores HLA de clase I negativos Patrón de inestabilidad de BAT26 y TGFbRII Tumor BAT 26 BAT 40 BAT- RII BAX TNM Grado histológico *CO86 + + - - T 4 N 2

16 Análisis de inestabilidad de microsatélites en tumores HLA de clase I negativos Patrón de inestabilidad de BAT26 y TGFbRII Tumor BAT 26 BAT 40 BAT- RII BAX TNM Grado histológico *CO T 4 N 2 M 1 MD *CO117 + ND ND + ND ND *CO T 4 N 3 M 0 MD CO T 4 N 2 M 0 PD Presencia (+) o ausencia (-) de MMP; MD, moderadamente diferenciado; PD, pobremente diferenciado; ND, no determinado; *Tumores HNPCC (Criterios de Amsterdam)

17 Mutaciones de b 2 m en tumores de colon MSI (inestabilidad de microsatélites) positivos Tumor Exon Homocigoto/ heterocigoto Mutación Posición del codon stop CO86 Exon 2 Exon 2 Heterocigoto Heterocigoto *deleción CA, codón 25 deleción A, codón CO117 Exon 2 Exon 2 Heterocigoto Heterocigoto deleción C, codón 91 *deleción CCGTG, codones CO132 Secuencia líder Homocigoto deleción CT, codones CO135 Secuencia líder Homocigoto deleción CT, codones *Deleción no descrita en la literatura.

18 CO86 CO132 Estroma Estroma Del. A (A5) Del. CT (CT4) CT A Tumor Tumor

19 Cromosoma 15 15qter 15q21 Centrómero Telómero D15S209 b2m D15S126 15pter-15qter 15q21(próximo a b2m)

20 Pérdida de heterozigosidad (LOH) en b 2 m (15q.22) Tumor D15S126 D15S209 CO5 LOH ROH CO6 MSI MSI CO14 MSI MSI CO18 ROH ROH CO19 H LOH CO22 ROH ROH CO26 H H CO85 CO86 ROH MSI H ROH LOH, pérdida de heterozigosidad; CO108 CO117 ROH MSI ROH MSI ROH, retención de heterozigosidad; CO128 CO132 CO135 ROH MSI MSI ROH MSI MSI H, homocigoto; MSI, inestabilidad de microsatélites.

21 Análisis de la expresión de genes APM en tumores de colon microdisectados MSI negativos PM C+ C- Actina pb β2m pb HLA pb TAP1-273 pb TAP2-298 pb LMP2-449 pb LMP7-542 pb LMP2M* pb LMP7M* pb

22 PÉRDIDAS HLA DE CLASE I EN TUMORES DE COLON Fenotipo I; 15% Pérdida de B44; 14% Resto de tumores; 71%

Frecuencia de HLA-B44 en la población caucásica 35 30

23 Frecuencia de HLA-B44 en la población caucásica B44 (24%) B7 B15 B27 B38 B41 B50 B56 B60

24 PÉRDIDA DE HETEROZIGOSIDAD EN 6p21.3 Cromosoma 6 Centrómero 6p21.3 Telómero TAP1 TAP2 HLA-B HLA-C HLA-A Clase II III Clase I D6S291 D6S273 C12C C125 D6S265 D6S105 D6S276 Microsatélites

Tumores con tinción inmunohistológica negativa de B44 y pérdida de haplotipo HLA-I Tumor Tipaje HLA STR Haplotipo perdido D6S311 D6S291 D6S273 C12C C125 D6S265 D6S105 D6S276 (SSO) CO32 A29, -; B44,

25 Tumores con tinción inmunohistológica negativa de B44 y pérdida de haplotipo HLA-I Tumor Tipaje HLA STR Haplotipo perdido D6S311 D6S291 D6S273 C12C C125 D6S265 D6S105 D6S276 (SSO) CO32 A29, -; B44, 62 N L H L L H H L ND CO67 A2, 29; B44, 51 L L H L L H L H A29/B44 CO69 A24, -;B44, 35 L L L L L H H L A24/B44 CO101 A2, 29; B44, 7 L L L L L L H L A29/B44 STR, microsatélite; N, normal; L, LOH; H, homocigoto; ND, no determinado

Tumores de colon con expresión negativa de HLA-B44 Tumor Tinción con los Abms 116-5-28/66-HA Tipaje HLA-B (SBT) CO46 CO49 CO53 CO57 CO61 CO74 CO81 CO99 CO100 - - - - - - - -

26 Tumores de colon con expresión negativa de HLA-B44 Tumor Tinción con los Abms /66-HA Tipaje HLA-B (SBT) CO46 CO49 CO53 CO57 CO61 CO74 CO81 CO99 CO B*4402/51011 B*4403/1402 B*4403/0702 B*4403/4005 B*4403/3534 B*4403/4501 B*4402/40011 B*4403/4501 B*4405/4501 SBT (Sequence Based Typing), secuenciación en alta resolución

27 Frecuencia de los diferentes subtipos de HLA-B44 en los tumores de estudio y en la población control 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0% B*4402 B*4403 B*4405 Tumor p <0.05 Control

28 Estrategia de secuenciación del locus HLA-B cdna Región 3 no traducida EX1 EX2 EX3 EX4 EX HLA-5UT BSA CG3 EF4 BNSA HLA-3UTB (1388 pb)

29 Imagen especular de HLA-B4402/4403/4405 Asp114 Asp114

30 Tapasina y el complejo de carga peptídico HLA de clase I BiP HC ERp57 Calnexina b2m Péptido subóptimo Crt Complejo de carga peptídico Tpn TAP1 TAP2 Péptido óptimo RE ATP ATP Citosol Proteina ubiquitinada Proteasoma HC, cadena pesada HLA de clase I Crt, calreticulina; Tpn, tapasina

31 Expresión de tapasina, TAP1/TAP2 en tumores de colon con ausencia de expresión en superficie de B C+ C- Tapasina* pb Tapasina pb b 2 m pb TAP1-273 pb TAP2-298 pb Tapasina*, expresión en mucosa autóloga

A Tumores de colon HLA-B44 positivos 62 67 94 101 106 C+ C- Tapasina

32 A Tumores de colon HLA-B44 positivos C+ C- Tapasina pb B C- C+ VE10 CL87 CL86 CL54 b 2 m pb Tapasina pb

33 Pérdida de haplotipo HLA-I asociado a pérdida de heterozigosidad en 6p21.3

34 Electroferogramas de microsatélites que mapean 6p21.3 Ds291 D6S273 C.1.2.C C D6S265 D6S105 Estroma Tumor Tumor CO15

35 69% de los tumores de colon presentan alteración HLA-I Tumores sin alteración HLA-I; 31% Fenotipo I; 14% Pérdida selectiva de B44; 15% Fenotipo II; 40% FI FIV FII Resto

36 Alteraciones HLA-I en los tumores de colon presentados 1. Fenotipo I MSI positivos - Inactivación bialelica de b2m (4casos). MSI negativos -Alteración del componente del proteasoma LMP7; y defecto de expresión de TAP2 (4 casos). - En un único caso no se ha podido determinar el mecanismo responsable (CO5). 2. Expresión negativa en superficie de B44 3. Pérdida de haplotipo HLA-I - Tumores con pérdida de haplotipo B44 (4 casos). -Tumores con defecto de expresión en la chaperona tapasina, componente del complejo de carga peptídico de clase I (9 casos). -El 40% de los tumores de colon presentan LOH en la región 6p21.3

Estadios y pronóstico en el cáncer de colon Estadio Dukes TNM Numérico Descripción Patológica A T 1 N 0 M 0 I Cáncer limitado a la mucosa y submucosa Tasa de supervivencia a los 5 años (%) >90 B 1 T

37 Estadios y pronóstico en el cáncer de colon Estadio Dukes TNM Numérico Descripción Patológica A T 1 N 0 M 0 I Cáncer limitado a la mucosa y submucosa Tasa de supervivencia a los 5 años (%) >90 B 1 T 2 N 0 M 0 II Cáncer extendido en la muscular 85 B 2 T 3 N 0 M 0 II Cáncer extendido en la serosa C T x N 1 M 0 III Invasión de los ganglios linfáticos regionales D T x N x M 1 IV Metástasis distantes (hígado, pulmón, etc)

Documentos relacionados

Es el cáncer hereditario. Dra. Pamela Mora Alferez Equipo Funcional de Genética y Biología Molecular INEN

Es el cáncer hereditario. Dra. Pamela Mora Alferez Equipo Funcional de Genética y Biología Molecular INEN Es el cáncer hereditario Dra. Pamela Mora Alferez Equipo Funcional de Genética y Biología Molecular INEN Leucemias y linfomas Qué es el cáncer Tejido epitelial carcinoma Tejido conectivo sarcoma Es la