Instrucciones de uso. Histamina - ELISA REF KAPL Histamina ELISA

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1 Instrucciones de uso ELISA REF KAPL ELISA

2 1. Uso y principio de la prueba Inmunoensayo enzimático para la determinación cuantitativa de histamina en plasma y orina. En combinación con el kit complementario (REF BA E-1100), el ensayo se realiza para la liberación de histamina en sangre heparinizada. En primer lugar la es acilada cuantitativamente. El kit competitivo de ELISA utiliza el formato de placa de microtitulación. El antígeno se une a la fase sólida de la placa de microtitulación. Los estándares, los controles, las muestras aciladas y los analitos ligados a la fase sólida compiten por un número fijo de lugares de unión al antisuero. Una vez el sistema está en equilibrio, los complejos sin antígeno y sin antígeno- antisuero son eliminados mediante el lavado. El anticuerpo unido a la fase sólida es detectado por un conjugado IgG-peroxidasa anti-conejo usando TMB como sustrato. La reacción es controlada a 450 nm. La cuantificación de muestras desconocidas se logra mediante la comparación de su absorbancia con una curva de referencia preparada con concentraciones estándar conocidas. 2. Almacenamiento y estabilidad Almacene los reactivos a 2-8 C hasta la fecha de vencimiento. No utilice los componentes más allá de la fecha de indicada en las etiquetas del kit. No mezcle varios lotes de ningún componente del equipo dentro de un mismo ensayo. 3. Contenido del kit BA 3050 Tampón de ajuste 1 x 4 ml Listo para su uso BA 3024 Placa de reacción 1 x 96 pocillos Listo para su uso BA Solución de lavado 1 x 20 ml Concentrado. Diluir el contenido con agua concentrada destilada para un volumen final de 500 ml BA Sustrato 1 x 11 ml listos para su uso, con solución de tetrametilbenzidina (TMB) BA Solución de parada 1 x 11 ml listo para su uso, con 0,25 MH 2 SO 4 BA Papel aluminio 1 x 4 ml Listo para su uso BA Estándar A 1 x 4 ml listo para su uso BA Estándar B 1 x 4 ml listo para su uso BA Estándar C 1 x 4 ml listo para su uso BA Estándar D 1 x 4 ml listo para su uso BA Estándar E 1 x 4 ml listo para su uso BA Estándar F 1 x 4 ml listo para su uso BA Antisuero de histamina 1 x 11 ml Proveniente de cabra, listo para su uso, de color azul, con tapa azul. BA Reactivo de acilación 3 x 0.5 ml Liofilizado BA Reactivo de igualación 1 x 3 ml Liofilizado BA Tiras de mircoplaca para 1 x 96 pocillos 12 tiras, 8 pocillos cada una, separadas, prerecubiertas BA Conjugado enzimático 1 x 11 ml listo para su uso, conjugado IgG anti-cabra con peroxidasa BA Control 1 1 x 4 ml listo para su uso BA Control 2 1 x 4 ml listo para su uso BA Diluyente de Acilación 1 x 2 ml listo para su uso 4. Materiales adicionales y equipos requeridos pero no incluidos en el kit - Micropipetas calibradas de precisión variable (ej.: µl / µl) - Dispositivo para lavado de placas de microtitulación - Lector Elisa con posibilidad de lectura de absorbancia a 450 nm y 620 nm o 650 nm - Agitador (con capacidad de agitación de 3mm; aproximadamente 600 rpm) - Material absorbente (toallas de papel) - Agua destilada, - Mezclador Vortex, 5. Toma y almacenamiento de muestras Plasma Se debe usar plasma (EDTA, heparina). Las muestras hemolítica y especialmente lipémicas no debe utilizarse con este ensayo. Almacenamiento: hasta 6 horas a 2-8 C, para períodos más largos (hasta 6 meses) a - 20 C. Se debe evitar ciclos repetidos de congelación y descongelación. Orina Se deben utilizar muestras de orina tomadas de manera espontánea o de 24 horas, recolectadas en un frasco con contenido de ml de 6 M HCL Almacenamiento: hasta 6 horas a 2-8 C, para períodos más largos (hasta 6 meses) a -20 C

3 Se deben evitar los ciclos repetidos de congelación y descongelación. Evite la exposición directa a la luz solar. Sangre La histamina liberada se analizada con sangre heparinizada. Para más información ver instrucciones de uso (REF BA BA ). 6. Procedimiento de la prueba Todos los reactivos deben estar a temperatura ambiente antes de su uso. Se recomiendan realizar mediciones en duplicado. 6.1 Preparación de los reactivos Tampón de lavado Diluya los 20 ml de tampón de lavado concentrado con agua destilada hasta obtener un volumen final de 1000 ml. Almacene el Tampón de lavado concentrado a una temperatura de 2-8 C. Vida útil: Consulte la fecha de vencimiento indicada en el kit. Reactivo de igualación Reconstituya el contenido del vial con 3 ml de agua destilada. El reactivo de igualación reconstituido no usado de manera inmediata debe ser congelado a -20 C (en partes alícuotas) y solamente puede ser descongelado una vez. Vida útil: por favor, consulte la fecha de caducidad indicada en el kit. Reactivo de acilación Reconstituya cada vial con 0,5 ml de diluyente de acilación. El reactivo de acilación debe prepararse justo antes del ensayo (no más de 1 hora antes). Si hay más de 0,5 ml es necesario combinar los contenidos de 2 ó 3 viales y mezclar bien. 6.2 Preparación y acilación de las muestras 1. Pipetee 25 µl de estándares, 25 µl de controles, y 25 µl de muestras de plasma o 10 µl de muestra de orina en los respectivos pocillos de la placa de reacción. 2. Añada 25 µl de tampón de ajuste a todos los pocillos. 3. Añada 25 µl de reactivo de igualación (vea 6.1) a todos los pocillos. 4. Añada 10 µl de reactivo de acilación (vea 6.1) a todos los pocillos. 5. Incube durante 1 hora a temperatura ambiente (20-25 C) en un agitador (aprox. 600 rpm). 6. Añada 200 µl de agua destilada a todos los pocillos. 7. Incube durante 30 minutos a temperatura ambiente (20-25 C) en un agitador (aprox. 600 rpm). Tome 20 µl de los estándares, contrles y muetras preparados para la prueba Histamine ELISA 6.3 ELISA 1. Pipetee 20 µl de los estándares, controles y muestras acilados en los pocillos correspondientes de las Tiras de microtitulación para histamina. 2. Pipetee 100 µl del Antisuero de histamina en todos los pocillos. 3. Agite las Tiras de Microtitulación para brevemente con la mano y cúbralas con lámina adhesivo. Incube durante horas a 2-8 C. 4. Retire la lámina adhesiva. Deseche o aspire el contenido de los pocillos y lave por completo cada pocillo 4 veces con 300 µl de Tampón de lavado. Seque agitando la placa en posición invertida sobre material absorbente. 5. Pipetee 100 µl de Conjugado enzimático en todos los pocillos. 6. Cubra la placa con lámina adhesiva e incube durante 1 hora a temperatura ambiente (20-25 C) en un agitador (aprox. 600 rpm). 7. Retire la lámina adhesiva. Deseche o aspire el contenido de los pocillos y lave por completo cada pocillo 4 veces con 300 µl de Tampón de lavado. Seque agitando la placa en posición invertida sobre material absorbente.

4 8. Pipetee 100 µl del sustrato en cada pocillo e incubar durante minutos a temperatura ambiente (20-25 C) en un agitador (aprox. 600 rpm. Evite la exposición directa a la luz del sol. 9. Añada 100 µl de la solución de parada a cada pocillo y agite la placa de microtitulación para garantizar una distribución homogénea de la solución. 10. Realice la lectura de absorbancia de la solución en los pocillos dentro de un tiempo de 10 minutos, utilizando un lector de microplacas programado a 450 nm con una longitud de onda de referencia entre 620 nm y 650 nm. 7. Cálculo de resultados Concentración de los estándares Estándar A B C D E F (ng / ml = µg/l) (nmol/l) Conversión (ng / ml) x 9 = (nmol / L) La curva de calibración se obtiene trazando las lecturas de absorbancia (cálculo de la absorbancia media) de los estándares (lineal, eje-y) contra las concentraciones estándar correspondientes (logarítmica, eje x). Utilice una regresión no lineal para el ajuste de la curva (ej.: Trazado de línea de curra, parámetro 4, akima). Muestras de plasma y controles: Las concentraciones de las muestras de plasma y los controles se pueden leer directamente de la curva estándar. Muestras de orina Las concentraciones de lectura de la histamina en la orina deben ser multiplicadas por 2,5 Calcule la excreción de 24 horas para cada muestra de orina: ug / 24h = ug / L x L / 24h 7.1 Control de calidad Se recomienda el uso de muestras de control de acuerdo a las regulaciones estatales y federales. Utilice controles en los niveles normales y patológicos. El kit control u otros controles comerciales deben estar dentro de los límites de confianza establecidos. Los límites de confianza de los controles del kit se encuentran indicados en el informe de control de calidad. 7.2 Calibración La unión de los antisueros, los conjugados de enzima y la actividad de la enzima utilizada dependen de la temperatura, los valores de extinción podrían variar si no se utiliza un termostato. A mayor temperatura, mayor son los valores de extinción. Los valores de extinción también dependen de los tiempos de incubación. La temperatura óptima durante el inmunoensayo enzimático se encuentra entre C. En caso de desbordamiento, realiza la lectura de absorbancia de la solución en los pocillos durante un tiempo de de 10 minutos, utilizando un lector de microplacas programado a 405 nm 7.3 Curvas típicas de calibración Ejemplo. No utilice para realizar cálculos

5 8. Características del ensayo Valores de referencia esperados Sensibilidad analítica (Límite de detección) Especificidad analítica (Reactividad cruzada) Precisión Sustancia Plasma Orina 24 h Espontánea < 1 ng/ml < 45 µg/d < 45 µg/g creatinina Sensitividad de plasma Sensitividad de Orina 23 ng / ml 0.25 ng / ml Reactividad cruzada (%) metil- 0.1 Tiramina 0.01 L-Fenilalanina < 0.01 L-Histidina < 0.01 L- Tirosina < 0.01 Triptamina < 0.01 Acido 5-Hidroxi-Indole-acetico < 0.01 Serotonina < 0.01 Intra-ensayo Muestra Rango (ng / ml) CV (%) Inter-ensayo Muestra Rango (ng / ml) CV (%) ± Muestras ± en Orina ± control de histamina ± ± en Plasma ± Linealidad Recuperación Comparación de los métodos frente a ELISA* * ELISA Immunotech Rango Dilución en serie Media (%) hasta Orina ng/ml 1: Plasma ng/ml 1: Media Rango Orina Plasma % de recuperación después de la adición Orina ELISA = 0.9 This ELISA 3.1 r = 0.99, n = 29 Plasma ELISA = This ELISA 0.4 r = 0.99; n = 47

6 9. Indicaciones para la manipulación de la prueba 9.1 Fiabilidad de los resultados de las pruebas Con el fin de asegurar una evaluación fiable de los resultados de la prueba, esta debe llevarse a cabo de acuerdo con las instrucciones y de conformidad con las normas y directrices vigentes (GLP, RILIBÄK, etc.). Se debe prestar especial atención para controlar las revisiones de precisión y corrección durante la prueba, los resultados de estos controles deben estar dentro del rango normal. En caso de discrepancias significativas entre las características preestablecidas para esta prueba y los resultados reales, póngase en contacto con el fabricante del kit de prueba para obtener instrucciones adicionales. Se recomienda que cada laboratorio establezca sus propios intervalos de referencia. Los valores reportados en este instructivo de prueba son solamente de carácter indicativo. Los resultados obtenidos con este kit de prueba no deben ser tomados como la única razón para ninguna consecuencia terapéutica, sino que se deben correlacionar con otras pruebas de diagnóstico y observaciones clínicas. 9.2 Quejas En caso de quejas por favor envíe al fabricante un informe escrito que contenga todos los datos acerca de cómo se llevó a cabo la prueba, los resultados obtenidos y una copia de la impresión original de la prueba. Póngase en contacto con el fabricante para obtener un formulario de reclamación y enviarlo completamente diligenciado. 9.3 Garantía Este kit de prueba se produjo de acuerdo a los últimos avances en tecnología y sometido a estrictos controles de control de calidad externa e interna. Cualquier alteración del equipo de prueba o del procedimiento de ensayo, así como el uso de reactivos de diferentes cargos puede presentar una influencia negativa en los resultados del examen y por lo tanto no son cubiertos por la garantía. El fabricante no se hace responsable por los daños ocasionados durante el transporte del kit. 9.4 Eliminación Las sustancias residuales y/o todos los productos químicos, reactivos y soluciones listas para usar restantes, son residuos especiales. Su disposición está sujeta a leyes y reglamentos de la federación y los países. Las autoridades responsables o compañías de eliminación de residuos deben informar acerca del desecho de residuos especiales. La eliminación del kit debe hacerse de acuerdo con las normas oficiales nacionales. Las bases jurídicas para la eliminación de residuos especiales son el ciclo económico y la ley de residuos. Las hojas de datos de seguridad adecuadas de los productos individuales están disponibles en la página principal. Las hojas de datos de seguridad corresponden a la norma: ISO Interferencias No se deben mezclar los reactivos ni las soluciones de diferentes lotes. Considere diferentes condiciones de transporte y de almacenamiento. El manejo inadecuado de las muestras o desviaciones en la reglamentación pueden afectar los resultados. No utilice los componentes del kit después de la fecha de vencimiento. Evite la contaminación microbiológica de los reactivos y el agua de lavado. Considere la posibilidad de periodos de incubación y referencias de lavado. 9.6 Precauciones Tenga en cuenta los períodos de incubación y lavado. Nunca pipetee con la boca y evite el contacto de la piel con los reactivos y las muestras. No fume, coma o beba en zonas donde se manipulen las muestras o los tubos del kit de prueba. Cuando se trabaje con los componentes del kit o muestras, use siempre guantes de protección y lávese las manos completamente una vez haya terminado. Evite rociar cualquier producto. Use ropa protectora y guantes desechables. Todos los pasos se deben llevar a cabo según el protocolo. Sólo se obtienen resultados óptimos del ensayo al utilizar pipetas calibradas. La azida de sodio podría reaccionar con tubos de plomo y cobre, y formar azidas metálicas altamente explosivas. Durante la limpieza, enjuague con abundante agua para prevenir la formación de las azidas metálicas. Todos los reactivos de este kit el cual contiene suero humano/animal o plasma han sido analizados y presentan resultados negativos de VIH I / II, HBsAg y HCV mediante procedimientos aprobados por FDA. Sin embargo, todos los reactivos deben ser tratados como materiales biológicos potencialmente peligrosos durante su uso y para su eliminación. Para obtener documentación actual, información sobre relevancia clínica o cualquier otra información por favor contacte a su proveedor local.