Eduardo Martínez Morillo, Paula Lafuente Ganuza, Belén Prieto García, Francisco V. Álvarez Menéndez

Transcripción

1 DESARROLLO DE UN MÉTODO DE CROMATOGRAFÍA DE GASES ACOPLADA A ESPECTROMETRÍA DE MASAS EN TÁNDEM PARA LA DETECCIÓN DE ESCOPOLAMINA Y CONFIRMACIÓN DE BENZODIACEPINAS EN MUESTRAS DE ORINA Eduardo Martínez Morillo, Paula Lafuente Ganuza, Belén Prieto García, Francisco V. Álvarez Menéndez Servicio de Bioquímica Clínica Laboratorio de Medicina

2 Introducción Los inmunoensayos son los métodos de cribado habitualmente usados para la detección de benzodiacepinas en orina en casos de intoxicaciones, o para la monitorización de pacientes psiquiátricos Pueden presentar falsos positivos (por sertralina, AINES, etc) Los métodos de referencia pueden ser necesarios para confirmar los resultados positivos La escopolamina (burundanga) es un alcaloide tropánico obtenido de plantas solanáceas (estramonio) Indicaciones en medicina: Prevención de la cinetosis Premedicación en anestesia Espasmos del tracto gastrointestinal A dosis : efectos en el SNC Dolor de cabeza Desorientación, mareo Agitación, alucinaciones Delirio y confusión. La escopolamina ha sido asociada a casos de abusos sexuales por sumisión química Disponer de un método de referencia que permita identificar su presencia en casos sospechosos de intoxicación puede ser de utilidad 2

3 Objetivo Desarrollar dos métodos de cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas en tándem (GC-MS/MS) para la detección de escopolamina y para la confirmación de benzodiacepinas en muestras de orina. 3

4 Material y Métodos Cromatógrafo de gases (456-GC) acoplado a un espectrómetro de masas de triple cuadrupolo (Scion TQ, Bruker) Columna capilar Rxi -5Sil MS (RESTEK) - escopolamina Columna capilar BR-5ms - benzodiacepinas Escopolamina Extracción sólido-líquido cartuchos Bond Elut Certify, Agilent 2 ml de orina con escopolamina (Sigma-Aldrich) µl de PI (Proadifen, 100 µg/ml) + 1 ml de tampón fosfato (0.1M, ph=6). - Lavado del cartucho con agua, ácido acético 1M y metanol - Elución con 2 ml de diclorometano-isopropanol-amoniaco (78/20/2) Evaporación del disolvente en corriente de nitrógeno +50 µl BSTFA-TMCS 1% (agente derivatizante) Incubación a 70ºC durante 20 min +150 µl de acetato de etilo Se inyectan 2 µl de muestra en el GC-MS/MS 4

5 Material y Métodos Cromatógrafo de gases (456-GC) acoplado a un espectrómetro de masas de triple cuadrupolo (Scion TQ, Bruker) Columna capilar Rxi -5Sil MS (RESTEK) - escopolamina Columna capilar BR-5ms - benzodiacepinas Benzodiacepinas Incubación 1 ml orina 3 horas a 65ºC con β-glucuronidasa Extracción sólido-líquido cartuchos Bond Elut Certify, Agilent - Lavado del cartucho con agua, tampón acetato (ph=4.0) y metanol - Elución con 2 ml de metanol-amoniaco (98/2) Evaporación del disolvente +50 µl BSTFA-TMCS 1% (agente derivatizante) Incubación a 70ºC durante 20 min +150 µl de acetato de etilo Se inyectan 2 µl de muestra en el GC-MS/MS 5

6 Material y Métodos Cromatógrafo de gases (456-GC) acoplado a un espectrómetro de masas de triple cuadrupolo (Scion TQ, Bruker) Columna capilar Rxi -5Sil MS (RESTEK) - escopolamina Columna capilar BR-5ms - benzodiacepinas Optimización del método en tres pasos Análisis de muestras en modo: 1. Full Scan Identificación de compuestos en librería NIST MS Search 2.0 y selección de los iones precursores más característicos 2. Product Ion Selección de fragmentos y energías de colisión (EC) 3. MRM Selección de las 4-5 transiciones más intensas y específicas 6

7 Resultados y discusión Análisis de escopolamina en modo MRM (polaridad positiva) Tª del inyector: 250ºC Gas portador: He a flujo constante: 1 ml/min Tiempo total de análisis: 35 min (tabla 1) Gradiente de temperaturas (ºC) del horno para la separación de la escopolamina Tiempo de retención Proadifen (PI): min Tiempo de retención Escopolamina: min Espectro de masas obtenido para una solución patrón de escopolamina 10 µg/ml (A) y comparación con el espectro disponible en la librería NIST MS Search 2.0 (B) 7

8 Resultados y discusión Patrón de fragmentación del ión 375 (Precursor) Análisis en modo product ion y selección de fragmentos iónicos para ser filtrados en el tercer cuadrupolo Fragmentos con mayor intensidad: iones 154, 138, 120 y 94 8

9 Resultados y discusión Transiciones utilizadas para la identificación de la escopolamina y del proadifen Evaluación de sensibilidad. Pico cromatográfico en 6 muestras de orina con 0, 150, 300, 500, 1000 y 2000 ng/ml de escopolamina Transiciones e intensidades relativas del método MRM La escopolamina fue detectada en todas las muestras salvo en la primera (blanco de muestra) 9

10 Resultados y discusión Características del método MRM para benzodiacepinas: Calibradores Preciset DAT Plus I, Cobas, Roche Material de control Liquichek TM Qualitative Urine Toxicology (Bio-Rad) Se confirmó que este método es capaz de identificar nordiazepam ( 150 ng/ml) y oxazepam ( 300 ng/ml) a concentraciones los puntos de corte utilizados en los métodos de cribado 10

11 Conclusión La es una metodología que proporciona mejores prestaciones analíticas que la tradicional GC-MS El análisis en modo MRM es más específico que el análisis en modo SIM y más sensible que el análisis en modo Full Scan Es una metodología de referencia de alto rendimiento para la confirmación de benzodiacepinas e identificación de escopolamina en muestras de orina 11