Actualización Técnicos Especialistas en Laboratorio del Servicio Andaluz de Salud

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1 Actualización Técnicos Especialistas en Laboratorio del Servicio Andaluz de Salud

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3 Técnicos Especialistas en Laboratorio del Servicio Andaluz de Salud Tema 11 Cambiar el epígrafe 4 por la que sigue: 4. Sangre, suero, plasma La sangre es un líquido que recorre el cuerpo humano, realizando múltiples funciones vitales: surtir de nutrientes a las diferentes células, recoger elementos de desecho, control de la temperatura La sangre se compone de una parte líquida y una forme claramente diferenciadas: 1. Parte líquida: compuesta por el plasma, líquido intersticial que baña a los elementos formes. Cuando eliminamos el fibrinógeno del plasma obtenemos suero. 2. Parte forme: compuesta por todas las células sanguíneas. Se añade un apartado 6: 6. Orina Análisis macroscópico de la orina Análisis de la orina Debemos recordar que el laboratorio tiene la última palabra en cuanto a la recogida y conservación de la muestra de orina, ellos son los responsables de aceptar o no la muestra para su análisis. Lo ideal sería que la muestra se analizara inmediatamente tras su recogida, si no es posible la guardaremos en el refrigerador hasta que se pueda hacer su análisis. Otra posibilidad es usar conservadores químicos hasta el momento de su análisis. Estos son muy útiles cuando debemos recoger orina de 24 h para una prueba determinada. Si hacemos uso de estos conservantes debemos anotarlo en el tarro de recogida, ya que pueden alterar determinados parámetros. El análisis de la orina se realiza con mucha asiduidad a los pacientes hospitalizados, por ser un buen indicador de la salud/enfermedad del paciente y no ocasionar grandes molestias. El análisis básico de la orina comprende 4 categorías: Características generales: color, olor, ph, densidad Determinaciones químicas: glucosuria, proteinuria, hemoglobinuria

4 4 Técnicos Especialistas en Laboratorio del Servicio Andaluz de Salud Examen microscópico: células, cristales, bacterias Detección y cuantificación de la bacteriuria. Toma de muestra Hay muchas formas de recoger la muestra de orina; la técnica elegida dependerá del paciente y de los parámetros buscados, pero, independientemente del tipo de técnica debemos lavar las manos y los genitales con agua y jabón, aclarando con abundante agua limpia, antes de recoger la muestra, así evitaremos contaminarla y que salgan valores erróneos. Si es posible desecharemos la primera parte de la micción, aunque, como vamos a ver a continuación, esto no siempre es posible. En los adultos la muestra será recogida en un recipiente de plástico estéril, con un tapón de rosca y una capacidad de 100 ml, suficiente para realizar todas las pruebas pertinentes. Los pacientes que hayan recogido la orina en tarros de mermelada, aceitunas deben ser informados convenientemente y no recoger la muestra. En los adultos que presenten problemas de incontinencia urinaria la muestra será recogida por medio de un sondaje uretral, si la técnica se realiza con la debida asepsia la muestra no estará contaminada. En los niños pequeños que no controlan sus esfínteres la orina será recogida en bolsas de polietileno flexible, estas bolsas se adhieren a los genitales externos de los niños y las dejaremos el tiempo necesario. En los niños en los que no podamos usar bolsas recolectoras de orina realizaremos una punción suprapúbica para la recogida de la muestra, también está indicada en cultivos anaerobios. Si necesitamos recoger orina de cada riñón para analizarlas por separado realizaremos una cateterización ureteral, introduciremos un catéter por uretra, pasaremos la vejiga y lo introduciremos por los uréteres hasta llegar a la pelvis renal donde recogeremos la orina. Otra técnica de recogida es la técnica de los tres vasos, donde recogeremos la orina de una misma micción en tres vasos diferentes para poder estudiar el origen de las células u elementos que aparecen en una muestra previa. La primera muestra contendrá elementos uretrales, vesicales, ureterales y renales. La segunda contendrá elementos vesicales, ureterales y renales, pero no los uretrales. La tercera se recoge tras un masaje prostático y contendrá líquido prostático. Para los parámetros normales podemos utilizar la orina de cualquier momento del día, si pedimos una muestra de sedimento la orina que debemos recoger es la primera de la mañana por ser la más concentrada. Si el parámetro que buscamos se elimina de forma irregular a lo largo del día (hormonas, proteínas ) pediremos al paciente que recoja la orina de 24 h, así podemos conseguir valores representativos. Pediremos al paciente que rechace la primera orina de la mañana, a partir de ese momento recogerá toda la orina excretada hasta la primera orina de la mañana siguiente que quedará incluida, en un recipiente de plástico que ha de ser rígido, opaco y con un tapón de rosca. La orina debe guardarse en todo momento en un frigorífico para evitar el deterioro de la misma y la consiguiente alteración de los resultados. En cuanto la orina sea recogida será llevada al laboratorio. Para no falsear los errores obtenidos informaremos al paciente de apuntar la cantidad de líquidos que ha tomado durante el día de recogida.

5 Técnicos Especialistas en Laboratorio del Servicio Andaluz de Salud La orina comienza a deteriorarse en muy poco tiempo, sufriendo alteraciones de color, olor, ph, disminución de la glucosuria, por esto la orina que no va a ser analizada inmediatamente tras su recogida será conservada en el frigorífico o le serán añadidos conservantes de la orina, y siempre en recipientes opacos para evitar que se destruyan el urobilinógeno y la bilirrubina. La orina con ph ácido (inferior a 6) se conserva mejor. Los conservantes de la orina que se pueden usar son muy variados, pero casi todos son antimicrobianos, para avisar al laboratorio rotularemos el bote de recogida con el conservante añadido, algunos de los más usados son: Ácido bórico: útil para conservar hormonas, aunque dificulta la determinación de la glucosa y aumenta la precipitación de los cristales de ácido úrico. La concentración utilizada es de 0,3 g/100 ml. Fluoruro sódico: útil para conservar los valores de la glucosuria durante 24 h. Para conservar el ph < 3 usaremos HCl, así mantendremos el ácido vanilmandélico y los aminoácidos. Para conservar el ph en niveles de 6-7 usaremos ácido acético y mantendremos los niveles de porfirinas. Timol: aunque es útil para las determinaciones de 24 horas altera sensiblemente la determinación de las proteínas por provocar su precipitación. Las concentraciones a las que suele ser utilizado son de unos 5-10 ml de una solución al 10% en isopropanol. Formol: no se debe utilizar para la determinación de proteínas ni de glucosa. Se utilizarán 1-2 gotas al 10% por cada 25 ml de orina Valoración preanalítica Cuando las muestras recogidas llegan al laboratorio, antes de ser analizadas determinaremos una serie de parámetros Muestra aceptable Para que una muestra sea aceptada por el laboratorio debe cumplir unos requisitos, que son los que siguen a continuación: La muestra llegada correctamente etiquetada: nombre del paciente, número de historia, hora de recogida de la muestra, incluida la petición debidamente rellena. El tipo de envase y la cantidad recogida son los adecuados. Se ha conservado de forma correcta y durante el tiempo adecuado. Carece de signos visibles de contaminación. El laboratorio tiene capacidad para anular una muestra que no considere aceptable por no haber sido recogida de la forma adecuada o por no presentar debidamente rellena la petición. De igual forma el laboratorio es el responsable de facilitar los diferentes tarros de recogida y la información necesaria. Debemos recordar que existen casos en los que los pacientes entregan directamente las muestras al laboratorio y éstos son los responsables de explicar de forma eficaz y sencilla las normas para la recogida.

6 6 Técnicos Especialistas en Laboratorio del Servicio Andaluz de Salud Color de la orina El color normal de la orina es amarillo, esta tonalidad es debida a los cromógenos que contiene, dependiendo de la concentración de éstos el tono de la orina será más o menos claro. El principal cromógeno es el urocromo. Si el tono de la orina no es amarillento se deberá a diversas patologías: Coloración rojiza: debida a la presencia de hematuria más o menos intensa. Si la coloración es rojo púrpura será debida a la porfiria (alteración hereditaria de la síntesis del grupo hemo). Para detectar de donde proviene la hematuria realizaremos la técnica de los tres vasos. Si la paciente es mujer tendremos que descartar que la sangre provenga de la menstruación. Coloración parda: debido a la presencia de abundante bilirrubina directa, el paciente lo define como orina de color coñac. También es posible que sea debido a una hematuria intensa donde la hemoglobina ya se ha degradado en otros pigmentos. Coloración pardo naranja o rojo naranja: se debe a la presencia de urobilina. Coloración pardo amarilla o pardo verdosa: si la espuma es blanca nos encontramos con una orina muy concentrada, si es amarilla nos hallamos ante la presencia de bilirrubina. En la ictericia obstructiva la orina puede adquirir tonos verdes. Coloración negra o marrón oscura: puede deberse a varias razones; a la presencia de metahemoglobina, a la presencia de melanina en la orina, o a que nos encontramos ante enfermos de alcaptonuria (enfermedad del metabolismo de la tirosina). Aspecto lechoso: puede ser debido a una concentración elevada de colesterol y triglicéridos por un síndrome nefrótico o fractura ósea, se denomina lipiduria. A la presencia de parafina procedente de cremas vaginales. A la presencia de pus en la orina (piuria). O a la presencia de linfa en la orina, se denomina quiluria y es muy extraña. Ante la aparición de una orina de color anormal lo primero que debemos hacer es preguntar al paciente qué medicación está tomando y cuáles son sus hábitos alimenticios, ya que hay fármacos y alimentos que dan coloraciones especiales en la orina Turbidez La orina normal es completamente transparente, aunque debido a la presencia de sales y cristales puede adoptar un aspecto algo turbio, sobre todo si la orina es concentrada y ha permanecido algún tiempo en reposo, que se eliminará agitándola, estas sales y cristales normales en la orina son: ácido úrico, fosfatos, uratos, carbonatos y oxalatos. En la orina normal también es normal encontrar hilos de mocos de las vías urinarias. Si la turbidez aparece en la orina recién emitida será por alguna de las siguientes causas: Presencia elevada de bacterias u hongos. Presencia de una cantidad importante de leucocitos o hematíes.

7 Técnicos Especialistas en Laboratorio del Servicio Andaluz de Salud 7 Presencia de abundante moco de las vías urinarias debido a una inflamación de las mismas. Presencia de líquido prostático. Presencia de semen. Presencia de materia fecal. Alteraciones del ph Olor La orina normal posee un olor característico, que será más intenso si la orina está concentrada, solamente en la insuficiencia renal aguda la orina puede carecer de olor. Cuando la orina se ha contaminado y no es válida como muestra exhala un olor amoniacal debido a la degradación de la urea. La orina puede ver alterado su olor si el paciente presenta determinadas enfermedades, en la siguiente tabla observamos algunos de ellos: Enfermedad Enfermedad de la orina con olor a jarabe de arce Tirosinemia Fenilcetonuria Olor Jarabe de arce Rancio Ratones Volumen La excreción de orina normal en un adulto es de ml al día, apareciendo una cantidad media de ml/día, en los niños la cantidad es algo superior. Como es evidente, estos valores están directamente relacionados con el balance hídrico que presente el paciente. El balance hídrico se establece de la siguiente forma: Aporte de líquidos Eliminación de líquidos Considerando como aporte todo lo que se introduce en el organismo: líquidos bebidos, transfundidos, administrados por vía nasogástrica y como pérdidas todo lo que sale: orina, vómitos, sudoración En un individuo normal el balance hídrico debe ser nulo, es decir, debe eliminar la misma cantidad de líquidos que ingiere. Si el individuo presenta una emisión de orina superior a ml de orina al día se denomina poliuria, es uno de los síntomas de diabetes, entre otras alteraciones. Debemos distinguir entre poliuria y polaquiuria, que es un número mayor de micciones al día pero con un total normal de orina emitida y que es muy frecuente en las infecciones de las vías urinarias. En el lado opuesto de la poliuria tenemos la oliguria, emisión inferior a los 500 ml de orina al día, si los niveles están por debajo de los 100 ml se denomina anuria. Si nos encontramos ante uno de estos casos lo primero que debemos hacer es sondar al paciente, ya que puede ser debido a una retención urinaria, si no es debido a una retención debemos ponerlo en conocimiento del médico, ya que puede deberse a alteraciones graves.

8 8 Técnicos Especialistas en Laboratorio del Servicio Andaluz de Salud Determinación de la densidad La densidad es una proporción entre el volumen total de orina y la cantidad de solutos que presenta. El valor normal de la densidad urinaria es de y se determina por medio de un urinómetro. Al introducir la orina en el urinómetro el flotador nos marcará la densidad que presenta. Esta prueba hay que realizarla a una temperatura determinada, normalmente a 15 ºC, si la temperatura de la muestra es otra deberemos realizar una corrección que consiste en añadir o restar 0,001 a la cantidad obtenida por cada 3 ºC de diferencia que aparezcan en nuestra muestra Determinación del ph urinario Urinómetro La determinación del ph se suele realizar mediante tiras reactivas que ya vienen diseñadas para esto. El ph de la orina oscila entre 4,5-8,2, aunque lo normal es que aparezcan unos valores aproximados de 6. La tira reactiva suele ser múltiple, permitiendo la lectura de varios datos de forma simultánea. La técnica es muy básica y consiste en introducir la tira durante 5 segundos en la muestra de orina, colocarla en un papel de filtro para eliminar el exceso de orina y contrastar el color aparecido con la escala que presenta el bote. En el caso del ph los reactivos son el rojo de metilo y el azul de bromotimol y la escala de colores oscila entre el naranja y el azul. Como ocurre con todas las tiras reactivas deben ser guardadas en lugares secos y frescos para evitar la alteración de los reactivos Análisis bioquímico de la orina Determinación de la proteinuria En un individuo sano los niveles de proteinuria son insignificantes, oscilando entre 2-8 mg/dl de orina, las proteínas que encontramos son en su mayoría globulinas de la fracción, principalmente albúmina, aunque encontramos a todos los tipos en cantidades ínfimas. El aumento de estos niveles de proteinuria será indicativo de una enfermedad, estando en relación directa los niveles de proteinuria y la gravedad de la enfermedad renal. Dependiendo de los valores obtenidos podemos encontrarnos con: Proteinuria intensa: valores superiores a 4 g/día. Aparece principalmente en glomerulonefritis y síndrome nefrótico. Proteinuria moderada: valores que oscilan entre 0,5-4 g/día. Proteinuria mínima: valores inferiores a 0,5 g/día, corresponden a riñones poliquísticos.

9 Técnicos Especialistas en Laboratorio del Servicio Andaluz de Salud También existen otros casos no patológicos que justifican la presencia de proteinuria en la muestra de orina, los principales casos que nos podemos encontrar son: Proteinuria ortostática: aparece en jóvenes y se caracteriza por una proteinuria que sólo aparece durante el día y desaparece por la noche. Proteinuria funcional: es una proteinuria que no aparece como consecuencia de una alteración renal, sino con otras alteraciones como la fiebre o las situaciones de estrés. Proteinuria falsa: errores en la toma de muestra. Los métodos que existen para la determinación de la proteinuria son muy diversos; a continuación explicaremos los principales Método de las tiras reactivas Las proteínas presentan la capacidad de cambiar el color del azul de tetrabromofenol, si introducimos una tira que presente este reactivo en una muestra de orina el color del reactivo cambiará de amarillo a verde azulado. La técnica es muy simple y el método está comercializado; podemos encontrarlo de 2 formas: Individualizada (Albustix ): consiste en tiras que sólo presentan este reactivo, en sus extremos presenta un cuadradito impregnado del reactivo adecuado. Múltiples (N Multistix ): consiste en tiras que presentan varios reactivos diferentes para la determinación de diferentes parámetros simultáneos. Ambos métodos deben presentar en su envase una tabla que especifica los colores originales del reactivo y los colores que adoptan éstos al ponerse en contacto con muestras que contengan proteínas. Independientemente del tipo de tira reactiva que sea, la técnica es la que sigue: Mezclar la muestra de orina de forma adecuada, la muestra no debe estar centrifugada. Introducir la tira reactiva durante unos segundos. Sacar la tira y colocarla sobre un papel de filtro para que se absorba el resto de la orina. Acercar la tira a las tablas presentes en los distintos tipos comercializados y comprobar el resultado. Siempre que el color del reactivo vire de amarillo a verde azulado la prueba se considera positiva. Estos métodos son muy rápidos y muy utilizados para este tipo de determinaciones aunque dependen del grado de objetividad de la persona que realiza la prueba.

10 10 Técnicos Especialistas en Laboratorio del Servicio Andaluz de Salud Método de Dhommée Es un método que puede ser cuantitativo o cualitativo y que se basa en la precipitación de las proteínas en presencia del reactivo de Dhommée. Composición del reactivo de Dhommée Ácido tricloroacético 1 g Ácido cítrico 2,5 g Ácido pícrico 0,5 g Agua destilada 100 ml Para la determinación cualitativa bastará poner en contacto 5 ml de la muestra de orina con unas gotas del reactivo, si se produce la precipitación la prueba será positiva, la muestra de orina presenta niveles de proteínas; si no aparece el precipitado la prueba será negativa, la muestra no presenta proteínas en niveles valorables. Si queremos realizar la prueba de forma cuantitativa deberemos seguir los siguientes pasos: 1. Poner 10 ml de la muestra de orina en un tubo de centrífuga. 2. Añadir 5 ml del reactivo. 3. Dejar reposar durante minutos. 4. Centrifugar durante 3-5 minutos a 2000 rpm. 5. Leer la altura en el tubo de centrífuga y comprobar en la tabla de Dhommée los niveles de proteínas presentes. Precipitado cm 3 Precipitado (décimas de cm 3 ) ,25 0,37 0,5 0,7 0,85 1 1,15 1,30 1 1,50 1,60 1,75 1,85 2 2,1 1,25 2,35 2,50 2,60 2 2,75 2,85 3,0 3,15 3,25 3,40 3,50 3,60 3,75 3, ,1 4,25 4,4 4,5 4,6 4,75 4,90 5 5, Método de Biuret Es el mismo método que se utiliza para el recuento total de proteínas en sangre: se basa en la formación de complejos violetas azulados formados por las proteínas cuando las colocamos en un medio alcalino. Estos complejos pueden ser cuantificados por espectrofotometría a 545 nm. La muestra de orina debe ser de 24 horas y estar conservada con sustancias que no alteren la presencia de proteínas en la muestra. El tubo debe estar rotulado con el conservante elegido.

11 Técnicos Especialistas en Laboratorio del Servicio Andaluz de Salud 11 La técnica es la que sigue: Mezclar en un tubo 0,5 ml de la muestra y 5 ml de una solución de ácido tricloroacético al 5%. Dejar reposar 5 minutos Centrifugar durante 10 minutos a rpm. Decantar el sobrenadante. Rotular 3 tubos como blanco, problema y patrón y añadir lo siguiente en cada tubo: Muestra Reactivo Biuret Patrón Blanco 5 ml Problema Precipitado obtenido 5 ml Patrón 5 ml 0,1 ml Dejar reposar 20 minutos a temperatura ambiente. Efectuar la lectura a 545 nm, el color permanecerá estable durante varias horas. Los valores normales oscilan alrededor de 0,1 g/l Método turbidimétrico con ácido tricloroacético Si ponemos en contacto las proteínas con ácido tricloroacético se insolubilizan; por métodos espectrofotométricos podemos averiguar la cantidad de proteínas insolubilizadas Determinación de los niveles de glucosuria En las personas sanas los niveles de glucosuria son muy pequeños, aproximadamente 100 mg/día, si los niveles de glucemia son muy elevados los riñones no serán capaces de filtrar todo el azúcar y aparecerá una glucosuria elevada, de igual forma si el riñón se encuentra dañado no será capaz de realizar el filtrado adecuado del azúcar apareciendo una glucosuria elevada. Existen casos fisiológicos como es el embarazo en el cual no existe una alteración renal, simplemente se aumenta el índice de filtración glomerular y puede aparecer glucosuria con niveles normales de glucemia. Los métodos para la determinación de los niveles de glucosuria son muy variados; a continuación explicamos los principales Método de la tira reactiva Es muy parecido al método de la tira reactiva para la determinación de la proteinuria; la técnica es la misma y el reactivo cambia de color verde a pardo.

12 12 Técnicos Especialistas en Laboratorio del Servicio Andaluz de Salud Las reacciones que tienen lugar son las siguientes: Glucosa oxidasa Glucosa + O 2 + H 2 O Ácido glucónico + H 2 O 2 Peroxidasa H 2 O 2 + indicador cromógeno + H 2 O Este método nos indicará la presencia de glucosa en la muestra si el reactivo cambia de color y la ausencia si no lo hace Test de Fehling Para la realización de esta prueba utilizamos dos soluciones diferentes: 1. Solución de Fehling A: SO 4 Cu + SO 4 H 2 + Agua destilada. 2. Solución de Fehling B: tartrato sódico potásico, Na (OH) y agua destilada. El reactivo está formado por partes iguales de ambas soluciones. La técnica es la que sigue: Poner en un tubo de ensayo 0,5 ml de la muestra de orina y 2 ml del reactivo. Calentar a ebullición durante 2 minutos. Comprobar la aparición del precipitado. Si el precipitado aparece la prueba será positiva, la orina presenta niveles de glucosa detectables, si no lo hace consideraremos que la muestra no presenta niveles de glucosa. Los niveles de glucosa se establecen según el color del precipitado según el siguiente cuadro: Amarillo + Amarillo anaranjado ++ Rojo +++ Actualmente este método está en desuso Test de Benedict Es el método más utilizado actualmente, y también se basa en la precipitación de las sales de cobre. La técnica es la que sigue: Poner en un tubo de ensayo 5 ml del reactivo y añadir 8 gotas de la muestra de orina. Mezclar bien. Introducir el tubo en un baño de agua hirviendo durante 5 minutos. Dejar enfriar. Observar el precipitado.

13 Técnicos Especialistas en Laboratorio del Servicio Andaluz de Salud 13 La presencia de precipitado y el color del mismo nos indican el resultado de la prueba tal y como se aprecia en la siguiente tabla. Coloración Registro Niveles de glucosa Opacidad azul clara o verde sin presencia de precipitado mg/100 ml Color verde con precipitado amarillo mg/100 ml Color amarillo verdoso con precipitado amarillo mg/100 ml Color naranja con precipitado amarillo mg/100 ml Sobrenadante claro y precipitado naranja rojizo ++++ > 2000 mg/100 ml Método de la orto toluidina Si colocamos la glucosa en un medio ácido que presente orto toluidina se formarán unos complejos de color verde azulado que pueden ser cuantificados por métodos espectrofotométricos a 620 nm. La técnica es la que sigue: Rotular 3 tubos como blanco, problema y patrón y añadir lo siguiente. Muestra O - toloudina Patrón Agua destilada Problema 100 µl 4 ml Blanco 4 ml 100 µl Patrón 4 ml 100 µl Colocar durante 5 minutos en un baño de agua a 100 ºC. Introducir los 3 tubos en un baño de agua fría durante otros 5 minutos. Realizar las lecturas a 620 nm. El color permanecerá estable durante una hora. Los valores normales oscilan entre 0-20 mg/100 ml Determinación de cuerpos cetónicos Los cuerpos cetónicos provienen de la degradación de los ácidos grasos y se forman en el hígado, podemos encontrarnos tres formas principales: Ácido acetil acético: también denominado ácido diacético, es el precursor de los otros dos, hallándose en una proporción del 20%. Ácido - hidroxibutírico: es el que encontramos en mayor cantidad en los análisis normales, encontrándose en una proporción del 78%. Acetona: es el que encontramos en menor cantidad en los análisis normales, encontrándose en una proporción del 2%.

14 14 Técnicos Especialistas en Laboratorio del Servicio Andaluz de Salud La aparición de los cuerpos cetónicos en la orina se denomina cetonuria y puede ser debida a varios factores como: ayunos prolongados o perturbaciones metabólicas como la diabetes. Normalmente los tres aparecen de forma simultánea, no siendo necesaria su determinación por separado. Por esta razón algunas de las técnicas no son sensibles para las tres formas Determinación de la cetonuria por el método de la tira reactiva El método es el mismo que el explicado con anterioridad, los reactivos utilizados en este caso son el nitroprusiato sódico, glicina y fosfato ácido de sodio. Si la prueba es positiva, es decir, existe cierta cantidad de cuerpos cetónicos en la muestra el cuadradito de la tira presentará un aspecto púrpura. Esta técnica no es sensible para el -hidroxibutírico, aunque sí para los otros dos, siendo más sensible para el ácido aceto acético Determinación de la cetonuria por el método de Rothera En este caso la determinación se realizará en un tubo de ensayo; la técnica es la que sigue: Colocar en un tubo de ensayo 5 ml de la muestra de orina. Añadir 2 3 gotas de nitroprusiato sódico al 10%. Añadir 1 g de sulfato de amonio. Mezclar bien. Inclinar el tubo de ensayo y dejar caer por la pared 1 ml de amoniaco concentrado. Esperar 90 segundos. Si en este tiempo aparece un anillo de color rosa púrpura la prueba se considera positiva, si el anillo aparece de otro color (marrón) o no aparece se considerará negativa. Si la prueba es positiva se valorará según la siguiente tabla. Valoración Negativa Indicios (+) Moderada (++) Elevada (+++) Apariencia No aparece anillo o no es del color indicado Anillo de color leve que aparece lentamente Anillo de color adecuado pero estrecho. Anillo de color e intensidad adecuados y ancho Determinación de bilirrubina Los pigmentos biliares (bilirrubina y biliverdina) aparecen de la degradación de los eritrocitos, esto ocurre de forma fisiológica y, normalmente no se encuentran en sangre en proporciones suficientes para ser detectadas en orina. La única bilirrubina que puede atravesar la barrera es la bilirrubina directa por ser hidrosoluble, como

15 Técnicos Especialistas en Laboratorio del Servicio Andaluz de Salud 15 consecuencia sólo podremos detectarla cuando aparezca alguna alteración que origine el aumento de este tipo. Estimaremos valores elevados de bilirrubina cuando sean superiores a 0,05-0,1 mg/dl Determinación de la bilirrubina mediante azul de metileno Esta prueba es muy simple y se realiza muy rápido, siendo muy utilizada en los laboratorios. La técnica es como sigue: Colocar en un tubo de ensayo 5 ml de la muestra. Añadir 2 gotas de azul de metileno. Comprobar la coloración. Al añadir el reactivo aparecerá una coloración azulada, si la muestra presenta bilirrubina se transformará en verde, de lo contrario permanecerá azul Determinación de la bilirrubina por el método de Fouchet Para poner de manifiesto el pigmento utilizaremos el reactivo de Fouchet, que se prepara de la siguiente forma: Reactivo de Fouchet Ácido tricloroacético Cloruro férrico al 10% Agua destilada 24 g 10 ml 100 ml La técnica es como sigue: Colocar en un tubo de ensayo 10 ml de la muestra. Añadir 5 ml de solución de cloruro bárico al 10%. Agitar y filtrar. Introducir una tira de papel de filtro. Dejar caer unas gotas del reactivo de Fouchet. Esperar reacción. Si la prueba es positiva aparecerá una coloración verdosa Determinación por medio de la tira reactiva Al igual que ocurre con otras determinaciones la bilirrubina puede medirse por medio de tiras reactivas; en este caso el reactivo utilizado es el 2,4 dicloroanilina, que virará a marrón si la orina presenta bilirrubina Determinación de urobilinógeno El urobilinógeno se forma a partir de la bilirrubina, sobre la que actúan las bacterias saprofitas del paciente. Este urobilinógeno se puede eliminar por la orina, por las heces, denominándose estercobilina o volver a la circulación normal.

16 16 Técnicos Especialistas en Laboratorio del Servicio Andaluz de Salud De forma fisiológica la cantidad eliminada por orina en 24 horas oscila entre 5-3 mg. De forma patológica aumentarán los niveles siempre que aumenten los niveles de bilirrubina o aparezca una alteración que impida su reabsorción normal. Determinación del urobilinógeno mediante tiras reactivas El método es similar a las otras ocasiones, siendo en este caso el reactivo utilizado el paradimetilaminobenzaldehído y una solución ácida. La escala de colores entre los que puede virar el reactivo va desde el amarillo hasta un marrón oscuro y la tira ha de leerse a los 60 segundos de ser impregnada. Determinación del urobilinógeno mediante el método de Érlich Poner 5 ml de la muestra en un tubo de ensayo. Añadir 3 gotas de reactivo de Érlich (paradimetilaminobenzaldehído). Dejar 5 minutos en reposo. Comprobar el cambio de color. Si la reacción es positiva la muestra virará a un tono rojo cereza. Reactivo de Érlich Paradimetilaminobenzaldehído Ácido clorhídrico Agua destilada 10 g 75 ml 75 ml Determinación de nitritos De forma fisiológica la orina no debe presentar ningún tipo de bacterias, es decir, debe ser estéril. En muchas ocasiones los análisis se realizan por sospecha de una infección urinaria. Muchas de las bacterias que contaminan la orina son enterobacterias capaces de transformar los nitritos, siendo fácilmente detectables por métodos sencillos. La determinación de nitritos se realiza por medio de tiras reactivas con ácido arsenílico y 1, 2, 3, 4, tetrahidro-quinolina 3 ol. Si aparecen nitritos el reactivo virará a tonalidades rosadas Estudio del sedimento urinario Sedimento urinario Podemos definir al sedimento como el depósito que deja sobre el fondo de un recipiente la sustancia sólida contenida en un líquido en estado de suspensión. Partiendo de esta definición consideramos al sedimento urinario como el material no soluble que se deposita en el fondo de un recipiente en el cual se encuentra la muestra, de forma espontánea o por centrifugación.

17 Técnicos Especialistas en Laboratorio del Servicio Andaluz de Salud 17 Realizaremos una observación microscópica de este sedimento para comprobar la presencia o ausencia de parámetros patológicos en la orina del paciente. El equipo necesario para el estudio básico del sedimento es el que enumeramos a continuación: Una centrifugadora simple. Un microscopio estándar con una buena fuente de luz. Filtros de luz polarizante. Tinciones. Medios de cultivo y equipos de cristal adecuados. Incubadora. Refrigerador. Para realizar un examen del sedimento pediremos al paciente que recoja la primera orina de la mañana, por ser la más concentrada y facilitar el hallazgo de elementos formes; normalmente nos basta con una enumeración cualitativa o semicuantitativa de los elementos encontrados. Buscamos: Células. Cilindros. Cristales. Bacterias. Hongos. Espermatozoides. Contaminantes o artefactos Examen microscópico del sedimento Para examinar el sedimento debemos seguir los siguientes pasos: Mezclar ml de la muestra de orina y colocarlo en un tubo de centrifugación cónico. Centrifugar durante 5 minutos a rpm. Desechar el sobrenadante. Resuspender el sedimento en 1 ml de la orina. Si el sedimento resultante está claro colocaremos una gota en un portaobjetos y pondremos sobre ella un cubreobjetos, entonces iniciaremos el examen. Iniciaremos el examen con una ampliación baja, buscando cilindros y otros elementos formes, aumentando después la ampliación para buscar células, cristales Debemos realizar el recuento de, al menos, 12 campos, los resultados que entregamos son la media de los obtenidos en los 12 campos. Es importante cambiar la luz para distinguir las diferentes estructuras buscadas, utilizar una luz central amortiguada para el estudio de rutina y una luz oblicua para buscar elementos delicados. Además de los métodos rutinarios podemos realizar técnicas especiales con el fin de lograr una mejor definición de algunas estructuras.

18 18 Técnicos Especialistas en Laboratorio del Servicio Andaluz de Salud Contraste de fases Usaremos un condensador y un objetivo especiales para aumentar el contraste mejorando la visibilidad y definición de estructuras con un índice de refracción similar al medio que las rodea. El microscopio de fases retrasa la longitud de onda de la luz difractada, produciendo un halo en las superficies de índices de refracción distintos. Esto es muy útil en cilindros hialinos o células difíciles de visualizar en condiciones normales por ser traslúcidas. Actualmente su uso es principalmente en la investigación, aunque se ha utilizado en bacteriología, citología y otros campos con buenos resultados, permitiendo obtener fotografías de objetos que resultaban invisibles con el microscopio ordinario Interferencia diferencial Proporciona al objeto una aparente tridimensionalidad, permitiendo definir formas geométricas, junto con la resolución vertical se pueden identificar objetos especialmente pequeños. Esta técnica también favorece la distinción de colores Luz polarizada Podemos transformar el microscopio corriente en un microscopio de luz polarizada con un polarizador y un analizador, esta técnica resulta especialmente interesante para identificar sustancias de doble refracción o anisotrópicas, como los cuerpos grasos Filtros Si colocamos un filtro debajo del condensador nos ayudará a observar los detalles de las diferentes estructuras del sedimento. El color del filtro dependerá de la estructura que queramos observar. Color del filtro Amarillo Verde Igual color que la estructura Color de la estructura Azules Rojas Estructuras fuertemente teñidas Tinciones Aunque algunos autores opinan que el estudio del sedimento sin teñir es suficiente, cuando realizamos tinciones sobre el mismo ponemos de relieve una serie de estructuras que son más difíciles de observar sin la tinción. Ayudándonos a diferenciar bacterias y células. Existen multitud de tinciones que están explicadas de forma detallada en cualquier manual de laboratorio; a continuación comentamos las más comunes.

19 Técnicos Especialistas en Laboratorio del Servicio Andaluz de Salud 19 Gram Nombre de la tinción Azul de metileno y fucsina fenicada Ziehl - Neelsen Tinción de la cápsula Tinta china Tinción de flagelos Sternheimer- Malbin Eosina Y Sudán III Iodo Nitroprusiato de benzidina Estructura que pone de relieve Es una de las principales tinciones; diferencia entre bacterias gram positiva (púrpura) de las gram negativa (rojo). Morfología general de los microorganismos. Bacterias ácido alcohol resistentes. Bacterias encapsuladas. Bacterias encapsuladas. Bacterias flageladas. Leucocitos. Hematíes, para diferenciarlos de los cuerpos grasos ovales. Cuerpos lipídicos. Contaminantes vegetales. Levaduras de los hematíes Identificación de células Hematíes Los hematíes son células sin núcleo con forma de disco bicóncavo; en el sedimento sin teñir aparecen con tonos pálidos. Su tamaño puede variar dependiendo de la concentración de la orina pero siempre serán más pequeños que los leucocitos y las células epiteliales, con un diámetro de 7,5 micras y un espesor de 2 micras. Hematíes Podemos considerar como normal el recuento de 2 o 3 hematíes por campo, un número mayor se denomina hematuria y siempre será patológico, excepto si la técnica de recogida ha sido traumática (punción suprapúbica traumática ) o se ha contaminado con sangre vaginal por encontrarse la paciente en fase de menstruación.

20 20 Técnicos Especialistas en Laboratorio del Servicio Andaluz de Salud La cantidad de sangre presente en la orina puede variar mucho, puede ser invisible a primera vista o hacer que la orina se tiña de un intenso color rojo. La primera señal de la presencia de sangre en la orina suele ser un botón rojo que aparece en el fondo del tubo tras ser centrifugado. Para poner en evidencia la presencia de hematuria utilizaremos una serie de test para la hemoglobina, como el de la Bencidina o Guaiac. Además estos test nos sirven para diferenciar los hematíes de otros elementos con los que se suelen confundir, como las células de levadura. La aparición de hematuria debe hacernos pensar en un proceso patológico y debe bastar para iniciar un estudio en profundidad del sistema urinario. Los procesos a los que está unido este descubrimiento son muy variados: lesión del glomérulo, lesión de los túbulos, lesión de la pelvis renal, presencia de cálculos, procesos inflamatorios, o procesos sistémicos sin relación inicial con el sistema renal. Por esta razón debemos realizar un estudio en profundidad del paciente, y determinar la etiología de la hematuria. La presencia de una orina de color rojizo no siempre es debida a la presencia de hematuria, la orina también se puede teñir de este color por la ingestión de determinados medicamentos como el piramidón o la antipirina, o a la presencia de porfirinas en la orina (porfirinuria) Leucocitos Los leucocitos que solemos encontrar en la orina son polimorfonucleares, con formas redondeadas, varios núcleos y gránulos en su citoplasma. Su tamaño es intermedio entre los hematíes y las células epiteliales, entre µ. Leucocitos Consideramos como normal encontrar un recuento leucocitario de 3 5 leucocitos por campo, un número mayor se denomina leucocituria, y será indicativo de algún proceso infeccioso en el sistema urinario. Si los leucocitos encontrados son piocitos nos encontramos ante una piuria, indicando procesos supurativos en alguna zona del sistema urinario: riñón (pielonefritis), vejiga (cistitis) o uretra (uretritis). La presencia de pus en la orina suele ser intermitente, originando orina turbia si es muy intensa. Cuando nos encontramos con una orina turbia debemos eliminar como razón principal la concentración de fosfatos y albúmina, para decidirnos por las concentraciones elevadas de piocitos como última opinión.

21 Técnicos Especialistas en Laboratorio del Servicio Andaluz de Salud Células epiteliales Debido a las importantes alteraciones morfológicas y degenerativas que presentan las células epiteliales es difícil distinguir sus tipos; cuando podemos hacerlo encontramos las siguientes células epiteliales diferentes: Células del epitelio tubular: Son células un poco mayor que los leucocitos y pueden adoptar formas cúbicas o de columnas, proceden del sistema tubular del riñón. El túbulo proximal suele dar células con formas de columnas y bordes festoneados, el túbulo distal suele dar células cúbicas sin bordes festoneados y los tubos colectores pueden dar células cúbicas o columnas. Consideraremos con normal la aparición de hasta 2 células por campo, un número mayor sería indicativo de una degeneración del parénquima renal. Células epiteliales tubulares Cuerpos grasos ovales: La mejor forma de detectarlos es con un aumento bajo y una luz amortiguada, debido al elevado índice de refracción de los componentes grasos que lo forman. Si lo observamos de esta manera se detectarán como manchas negras, a mayor aumento podemos observarlos como células epiteliales cargadas de gotitas de componentes refractarios. Para facilitar su identificación podemos teñir el sedimento o usar luz polarizante. Su presencia parece estar relacionada con nefropatías importantes, indicando una degeneración tubular extensa. Células del epitelio de transición: Son células que pueden adoptar formas variadas; piriformes, redondeadas, con forma de raqueta, con un diámetro 2 4 veces superior al de los leucocitos. Pueden proceder de la pelvis renal, uréteres, vejiga o uretra y su aparición indica una exfoliación anormal del territorio. También se han asociado a la presencia de una neoplasia. Células epiteliales de transición Células epiteliales escamosas

22 22 Técnicos Especialistas en Laboratorio del Servicio Andaluz de Salud Células de epitelio escamoso: Son grandes células aplanadas cuyo núcleo puede aparecer intacto o ser imposible de distinguir. Estas células pueden adoptar formas enrolladas semejantes a cigarrillos. Es muy común encontrarlas en las muestras de orina y provienen de la uretra, si no se acompañan de leucocitos no tendrán significado clínico Histiocitos Los histiocitos son células fagocitarias que van a adoptar diferentes formas y tamaños en el sedimento urinario, sus bordes son irregulares y su núcleo puede adoptar formas redondeadas o alargadas. En su citoplasma aparecen numerosas vacuolas que pueden aparecer rotas al observarlas, siendo sólo identificable su núcleo. Debemos tener cuidado de no confundirlas con células epiteliales tubulares. Su presencia indica procesos inflamatorios o reacciones inmunes Cuerpos de inclusión citomegálicos Estos cuerpos de inclusión pueden aparecer en el citoplasma de diferentes células encontradas en el sedimento urinario, haciendo su tamaño sea hasta 4 veces superior al normal. A las células que los poseen se les denomina ojos de búho. Aparecen como entidades individuales granulosas y acidófilas y pueden estar separadas del citoplasma por un halo claro. Su aparición está relacionada con enfermedades citomegaloblásticas Células malignas Las células neoplásicas son difíciles de identificar, ya que pueden presentar una gran variedad de tamaños y formas. Su principal característica radica en las alteraciones de su núcleo, normalmente más grande, y su citoplasma hipercromático. Cuando aparecen indican neoplasias en el sistema urinario, se encuentran con mayor frecuencia en neoplasias de la pelvis renal, pero también debemos buscarlas en orinas hematúricas Células de levadura Son células de formas ovoides, incoloras y con una pared de doble refracción que hace que se confundan a menudo con los hematíes. Para distinguirlos de los hematíes debemos saber que son insolubles en soluciones ácidas y alcalinas y no se tiñen con eosina Identificación de cilindros Son estructuras formadas por diferentes elementos que se aglutinan en los túbulos renales adquiriendo su forma, su aparición se denomina cilindruria.

23 Técnicos Especialistas en Laboratorio del Servicio Andaluz de Salud 23 La aparición de cilindros en el sedimento urinario no implica la presencia de un proceso patológico, ya que pueden aparecer en individuos sanos tras ejercicios intensos o en orinas concentradas o muy ácidas. Por regla general, sin embargo, la presencia de cilindros implica una disfunción de la nefrona, que filtra elevadas cantidades de proteínas u otras sustancias. Dependiendo del túbulo en el cual se forman los cilindros pueden presentar tres tamaños: estrecho, intermedio y ancho Cilindros hialinos Son cilindros formados por proteínas y material mucoide del túbulo. Son incoloros y con un índice de refracción cercano al medio que los rodea, esto dificulta enormemente su localización. El uso de filtros verdes, contraste de fases o microscopía con interferencia diferencial facilitan su detección. Presentan longitud variable, bordes regulares y puntas redondeadas, su tamaño, como ocurre con todos los cilindros, dependerá del lugar de formación. Dependiendo de los elementos que lo forman podemos encontrar: Cilindros hialinos granulosos: presentan restos celulares granulosos. Cilindros hialinos celulares: presentan células tubulares en su matriz. Cilindros hialinos grasos: presentan gotitas grasas en su matriz. La presencia de cilindros hialinos en el sedimento urinario está relacionada siempre con proteinuria, aunque puede ser indicativa de procesos patológicos severos como el mieloma múltiple Cilindros de epitelio tubular Son cilindros formados por acúmulo de células epiteliales descamadas; son difíciles de diferenciar, ya que para ello debemos detectar las diferentes membranas celulares. Son indicativos de procesos patológicos en los túbulos renales. Si su aparición coincide con la presencia de grasa en el interior del cilindro podemos pensar en la presencia de un síndrome nefrótico Cilindros granulosos Su origen no está muy claro, parecen ser el resultado de la degeneración de los cilindros del epitelio tubular, donde las células comenzarían a descomponerse formando los cilindros granulosos. Al comienzo de la descomposición aparecerán cilindros con aspecto granuloso grueso, si la descomposición continúa se transformará en gránulos finos. Estos cilindros pueden adoptar formas diversas, siendo curvos por una zona y rectos por otra, más delgados por una zona que por otra Sus indicaciones son las mismas que en los cilindros epiteliales, ya que provienen de éstos.

24 24 Técnicos Especialistas en Laboratorio del Servicio Andaluz de Salud Cilindros leucocitarios Son formaciones proteicas donde han quedado atrapados leucocitos, son difíciles de distinguir de los cilindros de células epiteliales, ya que algunas veces éstos se encuentran en descomposición. Para distinguir estos cilindros realizamos la tinción de Sternheimer Malbin, apareciendo los núcleos de los leucocitos teñidos de color púrpura inmersos en una matriz rosada. Debemos tener cuidado, ya que al realizar la centrifugación de la orina los leucocitos pueden formar agrupaciones cilíndricas que podemos confundir con cilindros. Estos cilindros provienen siempre de los túbulos, siendo siempre indicativos de alteraciones renales intrínsecas Cilindros hemáticos Son agrupaciones proteicas en cuyo interior han quedado atrapados hematíes, son fáciles de identificar porque las membranas de los diferentes hematíes se pueden diferenciar con claridad, presentan una tonalidad rojiza característica. La identificación se complica si los hematíes han comenzado a degradarse. Su presencia es indicativa de una hemorragia en la nefrona o procesos inflamativos o degenerativos Cilindros con morfología especial Cilindros anchos: son cilindros formados en los túbulos colectores, por esto son mucho mayores que los otros, normalmente pertenecen al tipo epitelial, aunque puede presentar cualquier elemento en su interior. Su aparición suele deberse a una disminución del flujo renal de la zona, si aparecen en un gran número indican el estadio final de una enfermedad renal grave. Cilindros estrechos: son cilindros formados en túbulos cuya luz está disminuida por cicatrices o tumefacción de la zona. Cilindros contorneados: cilindros formados en los túbulos contorneados. Cilindroides: no son verdaderos cilindros acaban en punta y presentan bordes irregulares Cilindros asociados a componentes anormales de la orina Cilindros céreos: presentan tonalidades amarillentas y un alto índice de refracción, suelen ser más cortos, anchos y opacos. Cilindros amiloides: produce una reacción tintorial azul con el azul de metileno, ya que es metacromático, su naturaleza química no está bien definida aunque parece ser que presenta proteínas y polisacáridos. Cilindros de uratos: formados por varias sales de ácido úrico.

25 Técnicos Especialistas en Laboratorio del Servicio Andaluz de Salud Identificación de cristales En la composición normal de la orina existen multitud de elementos que pueden adoptar formas de cristales; la formación de los mismos dependerá de la concentración de estos elementos en la orina, del ph La presencia de cristales en la orina se denomina cristaluria. La aparición de cristaluria puede no tener importancia clínica o ser indicativa de varios procesos patológicos, dependerá del tipo de cristal ante el cual nos encontremos y su concentración en la orina. Aunque los diferentes cristales que podemos encontrarnos adoptarán formas precisas y fácilmente reconocibles, disponemos de varios métodos para distinguirlos, como la luz polarizada, o métodos químicos que nos ayudarán a identificar el tipo de cristal ante el cual nos encontramos. Entre las características más importantes de estos cristales podemos indicar la refracción de los mismos. La capacidad de determinados cristales de brillar sobre un fondo oscuro, al observarlos bajo una luz polarizada se denomina birrefringencia, si el cristal aparece en un tono azul diremos que presenta birrefringencia positiva y si aparece en un tono amarillo será negativa. Existen otros métodos químicos simples que nos servirán para identificar varios tipos de cristales; a continuación presentamos un esquema de los principales Cristales de oxalato cálcico Aparecen en orinas con ph ácido, neutro o ligeramente alcalino. Son cristales incoloros que presentan formas octaédricas o de sobre. Presentan una refracción doble y son fácilmente reconocibles, aunque pueden ser confundidos con algunos tipos de cristales de ácido úrico. Suelen aparecer en personas en cuya alimentación abundan los alimentos ricos en oxalato: tomate, ajo, naranjas o espárragos. Cristales de oxalato cálcico También aparecerán en personas con un metabolismos alterado incapaz de digerir el oxalato, en estos casos el diagnóstico es más importante, ya que los cristales de oxalato se asentarán por todo el organismo pudiendo ocasionar la muerte del paciente. Están muy relacionados con cálculos urinarios, pudiendo llegar a provocar una insuficiencia renal Cristales de fosfato cálcico y otros fosfatos Aparecen en orina de ph alcalino, suelen adoptar formas de prismas o cristales plumosos incoloros. Los cristales de fosfato cálcico y fosfatos triples son muy corrientes en infecciones urinarias, estasis y paraplejía, aunque no presentan interés clínico. También suelen aparecer en personas que ingieren gran cantidad de frutas.