AISLAMIENTO Y MODIFICACIÓN ESTRUCTURAL DE CEMBRANOIDES 2-11 CICLIZADOS DE

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1 CNSEJ NACINAL DE CIENCIA Y TECNLGÍA -CNCYT- SECRETARÍA NACINAL DE CIENCIA Y TECNLGÍA -SENACYT- FND NACINAL DE CIENCIA Y TECNLGÍA -FNACYT- FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS Y FARMACIA UNIVERSIDAD DE SAN CARLS DE GUATEMALA INFRME FINAL AISLAMIENT Y MDIFICACIÓN ESTRUCTURAL DE CEMBRANIDES 2-11 CICLIZADS DE Briareum asbestinum, PARA PTENCIALIZAR SU CITTXICIDAD Y PRPIEDADES ANTICÁNCER PRYECT FDECYT No SCAR MANUEL CÓBAR PINT Investigador Principal GUATEMALA, ENER DE 2009 Facultad de Ciencias Químicas y Farmacia Universidad de San Carlos

2 AGRADECIMIENTS La realización de este trabajo, ha sido posible gracias al apoyo financiero del Fondo Nacional de Ciencia y Tecnología FNACYT-, otorgado por la Secretaría Nacional de Ciencia y Tecnología SENACYT- y del Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología CNCYT-, Proyecto FDECYT

3 TRS AGRADECIMIENTS Al equipo de investigación: Lic. Abraham Alejandro Vásquez Mencos, Lic. Jorge Alejandro Torres Flores, Licda. Ruth Yarseny Molina Gonón, Lic. Luis ugo Santa Cruz Cruz, Br. Ana Lucrecia Gómez López. Al Dr. Abimael D. Rodríguez del Departamento de Química, Facultad de Ciencias Naturales, Universidad de Puerto Rico, Recinto de Río Piedras. A los Laboratorios de los Departamentos de: Química rgánica, Fisicoquímica, Unidad de Bioensayos del Laboratorio de Investigación en Productos Naturales LIPRNAT- de la Facultad de Ciencias Químicas y Farmacia de la Universidad de San Carlos de Guatemala y Química de Productos Naturales Marinos de la Universidad de Puerto Rico, Recinto de Río Piedras. Licda. Stella María Cóbar Coronado y Br. Jorge Arroyo Robles, por su apoyo en la elaboración del manuscrito Survey of 2,11-cyclized cembranoids from Caribbean sources, publicado en Natural Product Resarch. 2009, 23 (1),

4 CNTENID Página RESUMEN 01 ABSTRACT 02 PARTE I I.1 INTRDUCCIÓN 03 I.2 PLANTEAMIENT DEL PRBLEMA 04 I.3 BJETIVS E IPÓTESIS 06 I.4 METDLGÍA 07 PARTE II MARC TEÓRIC 12 PARTE III III.1 RESULTADS 17 III.2 DISCUSIÓN DE RESULTADS 33 PARTE IV IV.1 CNCLUSINES 42 IV.2 RECMENDACINES 44 IV.3 REFERENCIAS BIBLIGRÁFICAS 45 IV.4 ANEXS 49 Extracción, fraccionamiento, separación, purificación de cembranoides 2,11-ciclizados naturales y síntesis de derivados. 49 Esquema de Aislamiento de Briareum asbestinum. 52 Esquema de Farmacóforos de Cembranoides 2,11-ciclizados naturales. 53 Esquema de Farmacóforos de Cembranoides 2,11-ciclizados 6-ester urocánicos. 55 Esquema de Farmacóforos de Cembranoides 2,11-cicizados 6-glucosidados. 57 Esquema de Farmacóforos de Cembranoides 2,11-ciclizados utilizados como comparación. 58 Survey of 2,11-ciclyzed cembranoids from Caribbean sources. 60 PARTE V INFRME FINANCIER 61

5 1 RESUMEN Esta investigación generó conocimiento básico sobre las propiedades citotóxicas y farmacofóricas de cembranoides 2,11-ciclizados (Asbestininos y Briarellinas), naturales y estructuralmente modificados, aislados del gorgonio caribeño Briareum asbestinum, con el objetivo de incrementar su citotoxicidad y posteriormente preparar extractos con propiedades anticáncer, que contengan estos metabolitos secundarios. La investigación se desarrolló en cuatro fases de trabajo: En la primera fase se obtiene Briareum asbestinum colectado en aguas de Isla de Mona parte norte de Puerto Rico, por el Dr. Abimael Rodríguez del Laboratorio de Química de Productos Naturales Marinos, de la Facultad de Ciencias Naturales del Recinto de Río Piedras de la Universidad de Puerto Rico. En la segunda fase, se extrae, aisla, purifica e identifica cinco cebranoides 2-11 ciclizados, cuatro con un grupo hidroxilo sobre el carbono 6 de la molécula (Asbestinino 7, Asbestinino 20, 4-deoxyasbestinino G y Briarellina E) y uno con un grupo carbonilo sobre el carbono 6 de la molécula (Asbestinino 9). La tercera fase consistió en la síntesis orgánica de un derivado glusosidado (6- glucósido de Asbestinino 7) y cuatro derivados 6-ester urocánicos (6-ester urocánico de Asbestinino 7, 6-ester urocánico de Asbestinino 20, 6-ester urocánico de 4- deoxyasbestinino G y 6-ester urocánico de Briarellina E). La cuarta fase estudio de la actividad citotóxica de los productos sintetizados y de sus propiedades farmacofóricas, permitió determinar la CL 50 (Concentración Letal Media) contra nauplios de Artemia salina de cuatro metabolitos naturales y cinco modificados, además de las propiedades farmacofóricas de los cinco cembranoides 2,11- ciclizados naturales aislados, los cinco modificados estructuralmente y tres utilizados para fines de comparación. Se concluye que la CL 50 de los derivados 6-ester urocánicos es mayor que la de aquellos análogos naturales que se encuentra ya reportada en la literatura y determinada por la misma metodología. El derivado 6-glucósido de Asbestinino 7 sintetizado mostró una CL 50 mucho mayor (menos tóxico) que los cuatro cembranoides naturales aislados y los cuatro derivados 6-ester urocánicos sintetizados. Adicionalmente, todos los cembranoides 2,11-ciclizados estudiados, presentan propiedades farmacofóricas importantes que los ubica como probables moléculas sujetas a posteriores estudios. Estas propiedades se obtuvieron utilizando software de última generación y comparando los cembranoides 2,11-ciclizados naturales aislados y sus derivados sintetizados, con tres moléculas que poseen el mismo esqueleto carbonado que son objeto de estudio en el FDA -Food and Drug Administration- de los Estados Unidos como medicamentos anticáncer. Los resultados de esta investigación demostraron la alta potencialidad que tienen estos metabolitos secundarios de origen marino como probables medicamentos anticáncer, ya que los derivados modificados estructuralmente, al esterificarlos con ácido urocánico, demostraron valores de Concentración Letal Media (CL 50 ) en contra de nauplios de artemia salina superiores a los obtenidos del compuesto utilizado como

6 2 materia prima, incluso valores que se encuentran a nivel nanomolar (10-9 Molar), comparables a los obtenidos por Eleuterobina, cembranoide 2,11 ciclizado que se encuentra en estudios de Fase Clínica II como medicamento anticáncer en el FDA de los Estados Unidos de América. Se elaboró una extensa revisión bibliográfica sobre este tipo de compuestos, que generaron una publicación científica en la revista arbitrada Natural Product Research de Taylor & Francis Editores; scar M. Cóbar. Survey of 2,11-cyclized cembranoids from Caribbean sources. Natural Product Research. 2009, 23 (1), De esta forma, se contribuye con las líneas de investigación sobre Uso de Productos Naturales y Determinación de Principios Activos de la Comisión Técnica Intersectorial de Salud, Estudios sobre Especies Silvestres de Flora y Fauna de la Comisión Intersectorial de Medio Ambiente y la generación de conocimiento básico en Química rgánica de la Comisión de Ciencias Básicas del Sistema Nacional de Ciencia y Tecnología, Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología y del Sistema de Investigación de la Universidad de San Carlos de Guatemala, con probable aplicación directa a la salud de los guatemaltecos. ABSTRACT Five 2,11-ciclized cembranoids was isolated from the gorgonian Briareum asbestinum collected at Mona island, North of Puerto Rico (Asbestinins 7, 9, 20, 4- deoxyasbestinin G and Briarellin E), four 6-ester urocanic cembranoids (6-ester urocanic of Asbestinin 7, 6-ester urocanic of Asbestinin 9, 6-ester urocanic of 4-deoxyasbestinin G and 6-ester urocanic of Briarellin E) and one 6-glucosyde cembranoid (6-glucosyde of Asbestinin 7) was synthesized. Four natural compounds (Asbestinin 7, Asbestinin 20, 4-deoxyasbestinin G and Briarellin E) and all the four 6-ester urocanic synthetic cembranoids showed CL 50 values against A. salina at nanomolar level. The later comparable with those of Eleutherobin and more potent that their natural homologues. The CL 50 showed by the 6-glycoside of Asbestinin 7 was at micromolar level, one thousand less potent that its 6-ester urocanic and natural homologues. The principal pharmacophoric properties was calculated for all the five natural compounds isolated, the five synthesized and three natural 2,11 cyclized cembranoids of the Sarcodyctin Class for comparison purposes. An extensive bibliographic revision was performed on 2,11 cyclized cembranoids literature, that generate a scientific paper published in Natural Product Research of Taylor & Francis Editors; scar M. Cóbar. Survey of 2,11-cyclized cembranoids from Caribbean sources. Natural Product Research. 2009, 23 (1),

7 3 PARTE I I.1 INTRDUCCIÓN Producir una cantidad adecuada y sustentable de metabolitos secundarios bioactivos, para su posterior estudio de actividad biológica y uso medicinal es uno de los principales retos en el estudio de la química de los invertebrados marinos. El porcentaje de rendimiento de estos compuestos orgánicos, cuando se aislan directamente del organismo que los produce, es bajo, obteniéndose entre y 0.01% de peso seco del organismo productor (10 mg de compuesto por Kg de peso seco) (Wright, A.E. 1998). La Síntesis rgánica muy a menudo es inaccesible, debido a la complejidad de las estructuras de estos metabolitos, lográndose algunas síntesis totales con rendimientos globales del 2-3% en el mejor de los casos y sumamente costosas para su aplicación a nivel comercial. Se ha reportado a la fecha la síntesis de tres cembranoides 2,11-ciclizados del Caribe Mesoamericano, Briarellinas E y F (Corminboeuf,. et. al. 2003) y 4- deoxyasbestinino D (Crimmins, M.T.; Ellis, J.M. 2005), obteniéndose en un % de rendimiento. Experimentalmente han existido dificultades para el crecimiento de invertebrados marinos fuera de su hábitat natural, sin embargo existen algunos ejemplos exitosos (jima, I. et. al. 1999, Munro, M. et. al. 1999, Taglialatela-Scafati,. et. al. 2002). La fauna invertebrada marina es especialmente rica en las aguas del Caribe Mesoamericano, situándose como la segunda barrera de arrecifes más grande del mundo, detrás de la gran barrera de arrecifes de Australia y por encima de las aguas del Pacífico, las que son especialmente abundantes cerca de las costas de kinawa y las islas del Japón y Filipinas (Faulkner, D.J. 2000). Debido al estrés a que se ven sometidos estos invertebrados marinos, sésiles y sin defensas físicas, biosintetizan compuestos orgánicos como mecanismos de defensa para rechazar a sus depredadores. Estos metabolitos secundarios poseen estructuras químicas sin precedentes y han demostrado poseer actividad biológica hasta diez veces mayor que los aislados del mundo terrestre, por lo que su estudio como potenciales fármacos ha crecido durante los últimos veinte años, reportándose alrededor de 5,000 moléculas nuevas, la mayoría con potente actividad biológica (Faulkner, D. J. 2000, Newman, D.J.; Cragg, G.M.; 2007, Blunt J.W. et. al. 2007). Actualmente el avance de las técnicas espectroscópicas y espectrométricas en la elucidación estructural de moléculas orgánicas, así como en las técnicas de estudio in vitro de actividad biológica y modelaje molecular ha permitido el desarrollo actual de este campo (Blagg, J. 2006, Gassner, N.C. 2007). Utilizando el conocimiento existente sobre la estructura y química de cembranoides 2,11-ciclizados del Caribe Mesoamericano, las técnicas de aislamiento y elucidación estructural, la metodología para determinar su citotoxicidad y propiedades farmacofóricas, se procedió a generar conocimiento científico que ubica a estas moléculas de origen marino como potenciales medicamentos anticáncer.

8 4 I.2 PLANTEAMIENT DEL PRBLEMA La química de Productos Naturales Marinos es relativamente reciente, aislándose más de siete mil moléculas, la gran mayoría con estructura química distinta a la observada en el mundo terrestre y con actividad biológica hasta diez veces mayor. En la actualidad el estudio de estos compuestos orgánicos aislados del Caribe mesoamericano ha cobrado auge, teniéndose varios compuestos estudiándose como probables medicamentos anticáncer en el FDA de los Estados Unidos de América e incluso con uno de ellos ya comercializándose (Ecteinascidina 743 o Trabectedin ). Los cembranoides 2,11-ciclizados están poco estudiados en cuanto a su potencial actividad biológica, existiendo únicamente el trabajo de Cinel y colaboradores sobre Eleutherósidos (Cinel, B. et.al. 2000), de su modificación estructural con fines de potencializar dicha actividad. Esta investigación está orientada a generar conocimiento básico sobre las propiedades citotóxicas de cembranoides 2,11 ciclizados (Asbestininos y Briarellinas), estructuralmente modificados y aislados del gorgonio caribeño Briareum asbestinum, con el objetivo de incrementar su citotoxicidad y posteriormente preparar extractos con propiedades anticáncer, que contengan estos metabolitos secundarios. I.2.1 Antecedentes en Guatemala. En Guatemala, únicamente la Facultad de Ciencias Químicas y Farmacia realiza investigación científica sobre la química de invertebrados marinos. El equipo de investigación, coordinado por el Dr. scar Cóbar, ha realizado desde 2,002 investigaciones sobre aislamiento y elucidación estructural de metabolitos secundarios de corales blandos (Velásquez, P.; Cóbar,.M. 2006), estudios sobre la actividad biológica no estudiada de estos metabolitos secundarios (Cóbar, S.M.; Cóbar,.M. 2006), síntesis de moléculas aisladas con el objetivo de estudiar su actividad biológica (Cóbar,.M.; Vásquez, A.A. 2004) y cultivo de invertebrados marinos para aislar metabolitos secundarios activos (Cóbar,.M. et. al. 2006). Este es el primer trabajo que se realiza, a nivel mundial sobre modificación estructural de Asbestininos y Briarellinas con fines de potencializar su citotoxicidad. Adicionalmente es el primer estudio sobre las propiedades farmacofóricas in-vitro que se realiza a nivel mundial sobre este tipo de compuestos. I.2.2 Justificación. El número importante de cembranoides 2,11-ciclizados, aunado a su variada y sorprendente actividad biológica y aspectos estructurales únicos, las hacen moléculas que deben ser sujetas a estudios profundos, tanto en su potencial farmacológico, como en el análisis de la relación entre su estructura y actividad biológica, para planificar su síntesis orgánica y producción a nivel macro. I.2.3 Impacto del proyecto. A mediano plazo puede continuar estudiándose otro tipo de actividad biológica que permita darle una utilizad biomédica a estos compuestos, que pueden ser patentados al ser compuestos nuevos (sin precedente en la literatura).

9 A largo plazo se pretende cultivar este gorgonio en ambientes artificiales exsitu, para que produzca estos metabolitos y tener materia prima para producir los derivados sintetizados e incluso poder comercializar extractos de B. asbestinum como medicamentos naturales anticáncer a bajo costo. No obstante ser un proyecto de investigación básica, su proyección directa al sector salud del país es alta. Los resultados de la investigación serán publicados en al menos una revista arbitrada de carácter internacional, en revistas científicas nacionales y congresos internacionales sobre la temática. Las moléculas bioactivas sintetizadas pueden ser patentadas a nivel nacional o internacionalmente, previo acuerdo entre el CNCYT, la Universidad de San Carlos y los autores de la investigación. 5

10 6 I.3 BJETIVS E IPTESIS I.3.1 bjetivos I General Aislar, modificar estructuralmente y determinar la actividad citotóxica de cuatro cembranoides 2-11 ciclizados hidroxilados, aislados del gorgonio caribeño Briareum asbestinum. I Específicos I Sintetizar al menos un cembranoide 2-11 ciclizado glucosidado mediante la reacción de -glicosidación. I Sintetizar cuatro cembranoides 2-11 ciclizados ester-urocánicos mediante la reacción de esterificación. I Determinar la actividad citotóxica de los derivados de los cembranoides 2-11 ciclizados sintetizados. I Comparar la actividad citotóxica reportada de los cembranoides 2-11 ciclizados naturales con la obtenida de los derivados de cembranoides 2-11 ciclizados. I ipótesis Los cembranoides 2,11-ciclizados estructuralmente modificados poseen mayor actividad citotóxica que los de origen natural.

11 7 I.4 METDLGIA I.4.1 Diseño, población a estudiar y muestra. I Universo. Se selecciona el gorgonio caribeño Briareum asbestinum, al conocerse su composición de cembranoides 2-11 ciclizados, la metodología extractiva y la ubicación de poblaciones de este invertebrado marino en el área de la costa atlántica guatemalteca y del Caribe mesoamericano. I Población. Aproximadamente 0.5 kg de peso seco de especímenes de Briareum asbestinum. I btención, procesamiento y transporte de la muestra de material a estudiar. El organismo fue colectado en aguas de la Isla de Mona, Puerto Rico en 1994, a metros de profundidad utilizando buceo, coordenadas 18º Norte y 67º este, identificado por el Dr. Abimael Rodríguez. La muestra se colocó en bolsas plásticas inmediatamente luego de colectadas y colocadas en hieleras equipadas con hielo seco (-10 o C), transportadas inmediatamente al laboratorio. Se procede a su liofilización (LABCNC de 12 litros de capacidad) para separar el agua de mar y se pesa. I Modelo de muestreo. Se utilizó un modelo de tipo estratificado, preferencial y por conveniencia. Los estratos (asociaciones del gorgonio aparentemente homogéneas entre sí) se definieron por exploraciones de buceo previas y preliminares en la expedición de colecta. I Preparación de extracto crudo. Luego del proceso de liofilización, el organismo seco, es macerado exhaustivamente en CCl 3 /Me (1:1), hasta obtenerse aproximadamente 10 litros de extracto crudo. El extracto fluido se concentra a presión reducida a una temperatura inferior a los 45 C utilizando un evaporador rotatorio (Buchi modelo R215), se elimina todo el solvente utilizando una bomba de alto vacío y se pesa. Los extractos orgánicos, fracciones, cembranoides 2,11-ciclizados naturales aislados y sintetizados, fueron procesados en el Laboratorio de Investigación en Productos Naturales Marinos de la Universidad de Puerto Rico, Recinto de Río Piedras, Puerto Rico, con ubicación en 18º Norte y 66º este, a 30 MSNM y una temperatura media de 28 o C y Laboratorio de Investigación de Productos Naturales de la Facultad de Ciencias Químicas y Farmacia de la Universidad de San Carlos de Guatemala, ubicado en 14º Norte y 99º este, a 1517 MSNM y temperatura media de 23 o C.

12 8 I Preparación de extractos orgánicos. El extracto crudo seco, se suspende en agua y somete a extracción líquido/líquido con n-hexano, luego CCl 3 y finalmente Me. Se utilizan solventes grado reactivo, realizándose 4 o 5 extracciones con cada uno I.4.2 Aislamiento de asbestininos y briarellinas (Cóbar,.M. 1996). I Separación por Cromatografía de Exclusión de Tamaño. El extracto n-hexánico se somete a cromatografía en columna utilizando Biobeads como fase estacionaria y tolueno como fase móvil. Se obtienen cuatro fracciones, monitoreadas por cromatografía en capa fina utilizado acetato de etilo/nhexano (7:3) como fase móvil, siendo las fracciones 3 y 4 las ricas en Asbestininos (Rodríguez, et. al. 1994). El extracto clorofórmico es rico en Briarellinas y Briareinas (Rodríguez A.D.; Cóbar,.M. 1995a). I Aislamiento y purificación vía Cromatografía en Columna y Cromatografía Líquida de Alta Resolución PLC-. Las fracciones 3 y 4 provenientes de la etapa anterior se someten a cromatografía en columna utilizando Sílica Gel G como fase estacionaria y n-hexano/acetato de etilo (7:3) como fase móvil. De ser necesario se purifica via PLC (Shimadzu modelo LC 20 AT) utilizando el mismo sistema de solventes. El extracto clorofórmico se fracciona por el mismo método, utilizando y purifica utilizando n-hexano/acetato de etilo (8:2) y purifica vía PLC, utilizando Me/ 2 (97:3 hasta 90:10 de ser necesario) en columna de fase reversa DS (Alltech 250 mm X 4.6 mm, tamaño de partícula de 5 m). I Identificación de cembranoides 2,11-ciclizados aislados. Las fracciones puras obtenidas, se someten a Resonancia Magnética Nuclear de Protón y de Carbono trece (Espectrómetro Bruker multinuclear modelo DRX 500, utlizando CDCl 3 como solvente) para identificarlos (Rodríguez, A.D. et. al. 1994, Rodríguez, A.D.; Cóbar,.M. 1995a; Rodríguez A.D.; Cóbar,.M. 1995b). Los compuestos obtenidos que posean un grupo hidroxilo en el carbono 6, se utilizarán para su derivatización. I.4.3 Modificación estructural de asbestininos y briarellinas. I Glucosidación (Toshima, K.; Tatsuta, K. 1993, Nicolau, K.; Mitchell,. 2001, Euzen, R. et. al. 2007). I Benzoilación de Asbestinino 7 (Reich, M. 2001). 60 mg de Asbestinino 7 se disuelven en una mezcla de 2.5 ml de anhidrido benzoico disuelto en n-hexano, 2.0 ml de DCC y 2.0 ml de DMAP. La mezcla se agita a temperatura ambiente durante 48 horas y luego remueve el solvente por rotaevaporación. El residuo es particionado entre agua 2.0 ml y éter dietílico 2.0 ml, se separa la fase orgánica.

13 9 La fase acuosa es nuevamente particionada con 2.0 ml de éter dietílico y combinan las fracciones orgánicas. Las fracción orgánica combinada se rotaevapora y deseca sobre sulfato de magnesio. Se caracteriza el producto por su punto de fusión, 1 -RMN y peso molecular. Se espera obtener 48.0 mg de Asbestinino 7-6-benzoilado (80% de rendimiento de la reacción). I Glucosidación de Asbestinino 7-6-benzoilado. 54 mg (1 mmol) de 2,3,4,6-tetra--bencill-glucopiranosa (obtenida de Fluka AG, Buchs, Suiza), 17 mg (005 mmol) de sulfato ácido de tetrabutilamonio y 34 mg (6 mmol) de hidróxido de potasio finamente dividido, se disuelven en 15 ml of dietoxymetano y enfría a 0 C. A esta temperatura, 35 mg (0.06 mmol) of Asbestinino 7-6-benzoilado se añaden a la mezcla, la cual se agita por 1 hora vigorosamente. Se añaden luego 15 ml de benceno, se filtra el precipitado y evapora a sequedad. El sólido se mezcla con una solución de 10 ml de agua y 5 ml de etanol, añadiéndosele 10 ml de K al 50% y reflujado durante 8 horas. La mezcla se enfría a 0 o C, se lleva a p 8 con Cl al 10% y se elimina el solvente por alto vacío. El residuo es mezclado con 15 ml de agua y 20 ml de acetato de etilo, llevándose la fase acuosa a p 5 agitándolo con Cl al 10%. Se separa la fase orgánica y la fase acuosa se extrae una vez más con 10 ml de acetato de etilo y combina con la fase orgánica. La fase orgánica combinada se seca con sulfato de magnesio y evapora el solvente. El residuo se somete a Cromatografía en Columna utilizando Silica Gel G 60 como fase estacionaria y diclorometano/n-hexano/etanol (20:8:2). El producto obtenido se concentra por rotaevaporación y obtiene el producto sólido. Se determina su punto de fusión, 1 -RMN y obtiene el peso molecular para identificar el compuesto. I Esterificación con ácido urocánico (Tenakado, D.; riyama, D. 2006, Reich, M. 2001). Aproximadamente 30 mg del asbestinino o briarellina correspondiente se disuelven en una mezcla de 2.5 ml de ácido urocánico, 2.0 ml de DCC y 2.0 ml de DMAP se agitan a 25 o c durante 48 horas. El exceso de reactivo se remueve por rotaevaporación y el residuo obtenido se particiona entre agua y éter dietílico. Los extractos etéreos combinados se desecan sobre Na 2 S 4 para obtener el éster urocánico correspondiente.

14 10 I Elucidación estructural de Cembranoides 2,11-ciclizados derivatizados (Cóbar,.M. 1996). Los cembranoides 2,11-ciclizados derivatizados, se someten a Resonancia Magnética Nuclear de Protón y de Carbono 13 para identificarlos para determinar si efectivamente la reacción se realizó. Se espera modificaciones en ambos espectros, específicamente señales derivadas de los carbonos de la glucosa y del ácido urocánico, ubicados ahora en sobre el Carbono 6 del cembranoide. Adicionalmente se somete a Espectrometría de Masas por Impacto Electrónico para obtener el peso molecular y su patrón de fragmentación para confirmar su estructura. I Determinación de la Actividad Citotóxica de Cembranoides 2,11-ciclizados Derivatizados (CYTED 1995). Los derivados sintetizados son sometidos a pruebas de actividad citotóxica, utilizando la metodología estándar del Programa Iberoamericano de Ciencia y Tecnología para el Desarrollo (CYTED) de 1995, este ensayo permite la estimación de la citotoxicidad en nauplios de A. salina mediante la evaluación de al menos 3 niveles de dilución del extracto y las fracciones a ensayar. La técnica consiste en la preparación de un medio salino adecuado, la colocación de huevos del crustáceo en dicho medio y su eclosión, que se resume de la siguiente manera: Se transfiere la mayor cantidad de nauplios vivos a un erlenmeyer con medio salino fresco. Se preparan para cada sustancia de prueba 3 niveles de dilución (1000, 500 y 250 µg/ml) y se colocan por triplicado en 9 pozos de la microplaca, haciendo un volumen total por pozo de 100 µl de solución a ensayar. Posteriormente se agregan a cada pozo 100 µl de medio salino conteniendo de nauplios y 100 µl de medio salino. Se utilizan 3 pozos como controles negativos los que se preparan en forma similar, utilizando como sustancia de prueba el medio de disolución de los extractos. Luego de 24 horas, se procede a contar el número de sobrevivientes en cada dilución, del que por diferencia con el valor inicial, se calcula el número de decesos observados. La Concentración Letal Media (CL 50 ) se calcula mediante una regresión no paramétrica utilizando el programa Trimmed Spearman-Karber Method, versión 1.5. I Modelaje Molecular y Propiedades Farmacofóricas de Cembranoides 2,11- ciclizados Derivatizados. Se realizan los estudios de Modelaje Molecular de los cembranoides 2,11- ciclizados aislados y derivatizados: Asbestinino 9, 4-deoxyasbestinino G y 6-ester urocánico de 4-deoxyasbestinino G, Briarellina E y 6-ester urocánico de Briarellina E, Asbestinino 20 y 6-ester urocánico de Asbestnino 20, Asbestinino 7, 6-ester urocánico de Asbestinino 7 y 6-glucósido de Asbestinino 7. Ellos fueron minimizados utilizando el Algoritmo RM1, re-parametrización de AM1 contenido en el Programa Spartan for Windows 2006 (G.B. Rocha, R.. Freire, A. Simas and J.J.P. Stewart, J.Computational Chem. 2006, 27, 1101) de Wavefunction Inc.

15 11 De cada uno se calcularon, entre otros, los siguientes parámetros: Energía de Formación Momento Dipolo Distancia entre cada uno de los enlaces de la molécula Distancia espacial entre átomos de la molécula Densidad Superficial ighest ccupied Molecular rbital -M- Lowest ccupied Molecular rbital -LUM- Las propiedades farmacofóricas estudiadas de los compuestos citados son: C log P (Indice de Solubilidad en n-octano) TPSA (Topological Polar Surface Area) Número de Aceptores de Protones Número de Donadores de Protones Número de Negativos Ionizables Número de Positivos Ionizables Relación átomos/enlaces Número de Anillos Enlaces Rotables Atomos Aromáticos Estas propiedades se calcularon utilizando los siguientes programas informáticos: LigandScout v. 1.03, (No. de Serie: ) de Inte:Ligand S.A. basado en: G. Wolber and T. Langer. LigandScout: 3-D Pharmacophores Derived from Protein-Bound Ligands and Their Use as Virtual Screening Filters J. Chem. Inf. Model; 2005; 45(1); Peter Ertl, Bernhard Rohde, Paul Selzer. Fast Calculation of Molecular Polar Surface Area Directly from SMILES. Novartis Pharma AG, ChemInformatics, C-4002, Basel, Switzerland. Basado en: Ertl, P., Rohde, B., Selzer, P. Fast calculation of molecular polar surface area as a sum of fragment based contributions and its application to the prediction of drug transport properties. J. Med. Chem. 2000, 43,

16 12 PARTE II MARC TEÓRIC Química de Productos Naturales Marinos Producir una cantidad adecuada y sustentable de metabolitos secundarios bioactivos, para su posterior estudio de actividad biológica y uso medicinal es uno de los principales retos en el estudio de la química de los invertebrados marinos. El porcentaje de rendimiento de estos compuestos orgánicos, cuando se aislan directamente del organismo que los produce, es bajo, obteniéndose entre y 0.01% de peso seco del organismo productor (10 mg de compuesto por Kg de peso seco) (Wright, A.E. 1998). La Síntesis rgánica muy a menudo es inaccesible, debido a la complejidad de las estructuras de estos metabolitos, lográndose algunas síntesis totales con rendimientos globales del 2-3% en el mejor de los casos y sumamente costosas para su aplicación a nivel comercial. Experimentalmente han existido dificultades para el crecimiento de invertebrados marinos fuera de su hábitat natural, sin embargo existen algunos ejemplos exitosos (jima, I. et. al. 1999, Munro, M. et. al. 1999, Taglialatela-Scafati,. et. al. 2002). La fauna invertebrada marina es especialmente rica en las aguas del caribe Mesoamericano, situándose como la segunda barrera de arrecifes más grande del mundo, detrás de la gran barrera de arrecifes de Australia y por encima de las aguas del Pacífico, las que son especialmente abundantes cerca de las costas de kinawa y las islas del Japón y Filipinas (Faulkner, D.J. 2000). Debido al estrés a que se ven sometidos estos invertebrados marinos, sésiles y sin defensas físicas, biosintetizan compuestos orgánicos como mecanismos de defensa para rechazar a sus depredadores. Estos metabolitos secundarios poseen estructuras químicas sin precedentes y han demostrado poseer actividad biológica hasta diez veces mayor que los aislados del mundo terrestre, por lo que su estudio como potenciales fármacos ha crecido durante los últimos veinte años, reportándose alrededor de 5,000 moléculas nuevas, la mayoría con potente actividad biológica (Faulkner, D. J. 2000, Newman, D.J.; Cragg, G.M.; 2007, Blunt J.W. et. al. 2007). Actualmente el avance de las técnicas espectroscópicas y espectrométricas en la elucidación estructural de moléculas orgánicas, así como en las técnicas de estudio in vitro de actividad biológica y modelaje molecular ha permitido el desarrollo actual de este campo (Blagg, J. 2006, Gassner, N.C. 2007). Briareum asbestinum. Briareum asbestinum (phylum Coelenterata, sub-phylum Cnidaria, clase Anthozoa, sub-clase Alcyonaria, orden Gorgonacea, sub-orden Scleroxonia, familia Briareidae, género Briareum, especie asbestinum) es un habitante común de las aguas poco profundas del Caribe Mesoamericano, en donde se le encuentra en dos morfologías, incrustada y erecta. Taxonomicamente se le ubica entre los grupos Alcyonacea y Gorgonacea de octocorales, los que son abundantes en los arrecifes de los océanos Pacífico y Atlántico respectivamente (presko, D.M. 1973, Coll, J.C. 1992, Rodríguez, A.D. 1995). El primer reporte describiendo metabolitos secundarios aislados de un espécimen caribeño de Briareum asbestinum aparece en 1966 (yde, R.W. 1966) en la Disertación

17 13 Doctoral de R. W. yde en la Universidad de klahoma, en la que describe una serie de diterpenos clorinados sin asignar estructuras. John Faulkner y colaboradores reportan los primeros Asbestininos en 1980 (Stierle, D.B. et. al. 1980) y A. D. Rodríguez y. M. Cóbar las primeras Briarellinas en 1995 (Rodríguez, A.D.; Cóbar,.M. 1995). A la fecha se han reportado 39 Asbestininos, la mayoría (21) aislados por. M. Cóbar, todos del Caribe Mesoamericano (Cóbar,.M. 1996), 29 Briarellinas; 22 por. M. Cóbar y A. D. Rodríguez (Rodríguez, A.D.; Cóbar,.M. 1995, Rodríguez, A.D.; Cóbar,.M. 1995a, spina, C.A. et. al. 2003, spina, C.A.; Rodríguez, A.D. 2006) y 7 por Sheu y colaboradores en aguas taiwanesas.(wang, G , Wang, G ). En la actualidad sólo existen dos reportes de eunicelinas aisladas de organismos del Caribe Mesoamericano; Polyanthellin A de Briareum polyanthes de Puerto Rico (spina, C.A. et. al. 2003) y las Sarcodyctinas; Eleutherobin, junto con tres Eleutherósidos de Eritrhopdium caribaeorum, de aguas del Caribe y cultivado en el Canadá (Taglialatela- Scafati,. et. al. 2002). De estos metabolitos, sesenta y nueve (69) provienen de organismos del caribe mesoamericano y fueron aislados de Briareum asbestinum (44), Briareum polyanthes (18) y Erithropodium caribaeorum (7). Esqueleto de Asbestinino Esqueleto de Eunicelina Esqueletos carbonados de diterpenoides de Briareum asbestinum Esqueleto de Briareina Cembranoides 2-11 Ciclizados. Los cembranoides 2-11 ciclizados de origen marino, son metabolitos secundarios presumiblemente formados biogeneticamente por la ciclización de una molécula de cembrano (Stierle, D.B. et. al. 1980, Bernardelli, P.; Paquette, L.A. 1998). Este grupo de compuestos se divide en cuatro familias; Eunicelinas, Briarellinas, Asbestininos y Sarcodictinas, cuyo común origen biogenético se resume así: Ciclización de la molécula del cembrano entre los carbonos 2 y 11, origina el esqueleto carbonado de las Eunicelinas Cembrano Eunicelina

18 14 Posterior oxidación entre los carbonos 3 a 16 y 2 a 9, seguida de ciclización, produce el esqueleto de Briarellina Eunicelina Briarellina Transposición subsecuente de metilo entre los carbonos 11 y 12 forma el esqueleto de Asbestinino Briarellina Asbestinino De igual manera, la oxidación entre los carbonos 4 y 7 del esqueleto de Eunicelina, seguida de posterior ciclización, origina el esqueleto de las Sarcodictinas Eunicelina Sarcodictina Briarellinas y Asbestininos pueden sufrir posterior ruptura oxidativa entre los carbonos 6 y 7 para producir las Secobriarellinas y los Secoasbestininos Briarellina Seco-briarellina Aabestinino Seco-asbestinino Es esta propuesta biosintética la que se ha tomado como fundamento para clasificar así a estos compuestos orgánicos, no obstante, existe otro criterio de clasificación, el que engloba a Eunicelinas, Briarellinas y Sarcodictinas como parte de las

19 15 Cladielinas (sinónimo para varios autores de Eunicelinas) y a los Asbestininos como el otro grupo, basado en la estructura del esqueleto carbonado de ambos grupos de compuestos (Bernardelli, P.; Paquette, L.A. 1998). Los cembranoides 2-11 ciclizados son metabolitos comunes en diversos géneros de octocorales (Phylum Coelenterata, Clase Anthozoa, Sub-clase ctocorallia), entre los que se encuentran Briareum, Eunicella, Cladiella, Solenopodium y Erithropodium entre otros, poseen estructuras únicas, sin precedente en el mundo terrestre y una variedad de actividades biológicas (anti-inflamatoria, citotóxica, antitumoral, antiviral e insecticida entre otras), que los hacen promisorios futuros medicamentos (Coll, J.C. 1992, Rodríguez, A.D. 1995, Sung P-J; Cheng M-C. 2002). En la actualidad se han reportado más de ciento cincuenta metabolitos de este tipo, siendo los más abundantes las Eunicelinas, seguido de los Asbestininos, Briarellinas y Sarcodictinas en su orden (Blunt, J.W. et. al. 2007). Las Eunicelinas (Cladielinas), fueron los primeros cembranoides 2-11 ciclizados aislados de un organismo marino, siendo Eunicelina obtenida del gorgonio del mediterráneo Eunicella estricta en 1968 la primera reportada (Kennard,. et. al. 1968). Desde ese año, se han reportado alrededor de 70 Eunicelinas, la mayoría del hemisferio norte (gran barrera de arrecifes de Australia, el céano Índico, el Mar Mediterráneo y las aguas del Pacífico Japonés) con una gran variedad de actividad biológica (citotóxica, ictiotóxica, hemolítica y anti-inflamatoria, entre otras) (Kennard,. et. al. 1968, Sung, P-J.; Chen M-C. 2002). Ac C 3 C 2 Ac C 3 C 3 Eunicelina (1) Los primeros Asbestininos (Asbestininos 1 al 5) fueron aislados hasta 1980 de especimenes de Briareum asbestinum del caribe centroamericano, reportándose que antagonizan el efecto de la acetilcolina en preparaciones de íleo de ratones de guinea a niveles de 16 g/ml (Stierle, D.B. et. al. 1980). En la actualidad se han reportado 39 Asbestininos, todos del caribe mesoamericano y con actividad biológica poco estudiada, pero altamente citotóxicos en contra varias líneas celulares cancerosas (Sung, P-J.; Chen M-C. 2002, Blunt, J.W. et. al. 2007). Ac Ac Asbestinino 1 C 3 Ac C 3 C 3 7 Las Briarellinas se han aislado en su gran mayoría de especimenes del género Briareum de aguas del caribe mesoamericano, siendo Briarellina A, en conjunto con Briarellinas B, C, D y Secobriarellina, las primeras descritas en 1995 (Rodríguez, A.D.; Cóbar,.M. 1995a). Se reporta en esta publicación, que Briarellina A posee citotoxicidad contra células ela a valores de IC 50 = 20.0 g/ml.

20 16 La estructura inicial de Briarellina A fue revisada y reasignada como la que se muestra a continuación (spina, C.A. et. al. 2003). Actualmente se han reportado 29 Briarellinas, 22 aisladas de gorgonios del género Briareum del caribe mesoamericano (Cóbar,. M. 2000, Sung, P-J.; Chen M-C. 2002, Blunt, J.W. et. al. 2007,). C 3 C 2 C C Briarellina A C 3 C3 Seco-briarellina Sarcodictina A, junto con sus congéneres Sarcodictinas B, D, E y F, fue reportada en 1987 de Sarcodictyon roseum del pacífico australiano (D Ambrosio, M. et. al. 1987) indicándose que este compuesto posee actividad antitumoral contra una variedad de células cancerígenas a niveles de IC 50 entre 400 y 900 nm e induce polimerización de las tubulinas y estabilización de los microtúbulos, un mecanismo de acción que actualmente se encuentra en estudio y es por el que actúa Taxol, comercializado como medicamento anticáncer con el nombre comercial de Paclitaxel. (Cragg, G. M.; Newman, D. J. 2004). Actualmente se han reportado 22, la mayoría del pacífico norte y pareciera ser el grupo que mayor actividad biológica posee, reportándose Eleutherobina con un IC 50 entre 10 y 15 nm contra una variedad de células cancerosas, induciendo también la polimerización de tubulinas y la estabilización de los microtúbulos (Boik, J. 2001, Sung, P-J.; Chen M-C. 2002, Blunt, J.W. et. al. 2007, Altmann, K-.; Gertsch, J. 2007). C 3 C C 3 C 3 C 3 CMe Sarcodictina A N N C 3

21 17 PARTE III III.1 RESULTADS III.1.1 btención de la Muestra El organismo fue colectado en aguas de la Isla de Mona, Puerto Rico en 1994, a metros de profundidad utilizando buceo, identificado por el Dr. Abimael Rodríguez. La muestra se colocó en bolsas plásticas inmediatamente luego de colectadas y colocadas en hieleras equipadas con hielo seco (-10 o C), transportadas inmediatamente al laboratorio. Se procede a su liofilización para separar el agua de mar y pesadas (peso seco del espécimen). Una muestra del espécimen se encuentra depositado en el Laboratorio de Química de Productos Naturales Marinos de la Universidad de Puerto Rio, Recinto de Río Piedras, bajo el número BAPR04-1. III.1.2 btención del Extracto Crudo. Luego del proceso de liofilización, se obtienen 480 g de peso seco de Briareum asbestinum, que es macerado exhaustivamente en CCl 3 /Me (1:1), hasta obtener aproximadamente 10 litros de extracto crudo. El extracto fluido se concentra a presión reducida a una temperatura inferior a los 45 C utilizando un evaporador rotatorio, se elimina todo el solvente utilizando una bomba de alto vacío, se pesa, obteniéndose 57.4 g (11.96%) de extracto crudo (BAM) III.1.3 btención de Extractos rgánicos Los 57.4 gramos de extracto crudo, se suspenden en agua y someten a extracción líquido/líquido con n-hexano, luego CCl 3 y finalmente Me. Se obtienen g de extracto n-hexánico -BAM- (74.25%), 8.07 g de extracto clorofórmico -BAMC- (14.07%) y 6.70 g de extracto metanólico -BAMM- (11.68%). III.1.4 Fraccionamiento de Extracto n-hexánico III Fraccionamiento por Cromatografía de Exclusión de Tamaño g del extracto n-hexánico se disuelve en tolueno y fracciona por exclusión de tamaño utilizando BIBEADS SX-2 como fase estacionaria, obteniéndose cuatro fracciones: BAM1 (12.50 g, 31.2%), BAM2 (8.39 g, 20.9%), BAM3 (6.98 g, 17.4%) y BAM4 (12.13 g, 30.5%). Las cuatro fracciones sometidas a estudio de Cromatografía en Capa Fina -TLC-, utilizando como fase estacionaria Sílica Gel G 60 (Merck, precortadas) y fase móvil n- hexano/acetato de etilo (70:30) determina que la fracción BAM4 es la de mayor contenido en cembranoides 2,11-ciclizados, por lo que se procedió a su fraccionamiento.

22 18 III Fraccionamiento por Cromatografía en Columna y Cromatografía Líquida de Alta Resolución -PLC g de la fracción BAM4 se someten a fraccionamiento por Cromatografía en Columna utilizando Sílica Gel (Alltech) de tamaño de partícula entre 35 y 75 micrómetros como fase estacionaria y EtAc/n-hexano (3:7) grado analítico como fase móvil. (Anexo 1) Se obtienen 21 fracciones, las cuales se analizaron por Cromatografía en Capa Fina, utilizando Sílica Gel G 60 como fase estacionaria y n-hexano/acetato de etilo (70:30) como fase móvil. (Anexo 2) Adicionalmente a las fracciones de mayor pureza se les realizó estudios de 1 - RMN y 13 C-RMN para determinar las que poseen los cembranoides 2,1-ciclizados a aislar y purificar. III.1.5 Aislamiento y Elucidación Estructural de Cembranoides 2,11-ciclizados. III Aislamiento y Elucidación Estructural de Asbestinino 9. La Fracción BAM4.11 (120 mg) es sometida a PLC utilizando Me/ 2 (9:1), como fase móvil y Columna DS, como fase estacionaria, obteniéndose 48 mg de analíticamente puro Asbestinino 9. La identificación de la molécula se obtiene por sus señales de 1 -RMN ( 2.28, 23; 0.22, Me 24; 5.26, 11; 5.23, 19a; b) y de 13 C-RMN ( 176.3, C21; 36.5, C22; 18.4, C23; 13.7, Me24; 146.7, C7; 114.0, C19; 72.7, C11; 206.6, C6). Figura 1. Estructura de Asbestinino C C 3 III Aislamiento y Elucidación Estructural de 4-Deoxyasbestinino G. La Fracción BAM4.20 es fraccionada sucesivamente vía Cromatografía en Columna utilizando Si Gel G 60 como fase estacionaria y n-hexano/etac (80:20) como fase móvil, la tercera fracción produce 80 mg de analíticamente puro 4-deoxyasbestinino G. La identificación de la molécula se obtiene por sus señales de 1 -RMN ( 0.97, Me 24; 5.26, 11; 5.30, 19a; b; 4.22, 6) y de 13 C-RMN ( 173.7, 146.4, C7; 115.8, C19; 73.2, C11). Figura 2. Estructura de 4-deoxyasbestinino G C C 3

23 19 III Aislamiento y Elucidación Estructural de Briarellina E. La Fracción BAM4.12 (65 mg) es sometida a PLC utilizando Me/ 2 (8:2), como fase móvil y Columna DS Ultrasphere Si-Gel, como fase estacionaria, obteniéndose 34 mg de analíticamente pura Briarellina E. La identificación de la molécula se obtiene por sus señales de 1 -RMN ( 1.31, Me20; 0.81, Me 17; 1.58, 15; 5.17, 4; 4.50, 9; 4.18, 6; 5.47, 19a; b) y de 13 C-RMN ( 175.0, C21; 67.3, C16; 71.6, C4; 36.4, C15; 24.8, C13; 10.3, Me17; 148.2, C7; 115.1, C19; 71.6, C11; 74.0, C6). Figura 3. Estructura de Briarellina E 3 C 19 C C III Aislamiento y Elucidación Estructural de Asbestinino 20. La Fracción BAM4.13 (72 mg) es sometida a PLC utilizando Me/ 2 (75:25), como fase móvil y Columna DS Ultrasphere Si-Gel, como fase estacionaria y luego Cromatografía en Columna utilizando Si Gel G 60 como fase estacionaria y n- hexano/etac (80:20) como fase móvil obteniéndose 38 mg de analíticamente puro Asbestinino 20. La identificación de la molécula se obtiene por sus señales de 1 -RMN ( 2.07, Me22; 4.09, 6; 5.38, 11; 5.17, 4; 5.20, 19a; b) y de 13 C-RMN ( 171.0, C21; 29.0, C4; 148.0, C7; 114.4, C19; 73.6, C11; 75.3, C6). Figura 4. Estructura de Asbestinino C 3 19 C 2 III Aislamiento y Elucidación Estructural de Asbestinino 7. La Fracción BAM4.18 (190 mg) es sometida a PLC utilizando Me/ 2 (93:07), como fase móvil y Columna DS Ultrasphere Si-Gel, como fase estacionaria obteniéndose 96 mg de analíticamente puro Asbestinino 7. La identificación de la molécula se obtiene por sus señales de 1 -RMN ( 2.07, Me22; 4.53, 6; 5.37, 11; 5.52, 4; 5.31, 19a; b) y de 13 C-RMN ( 171.0, C21; 173.0, C23; 69.5, C4; 144.4, C7; 117.2, C19; 73.6, C11; 87.0, C6).

24 20 Figura 5. Estructura de Asbestinino C C 3 23 III.1.6 Glucosilación de 4-deoxyasbestinino G. III Benzoilación de Asbestinino 7. Como producto de la esterificación con anhídrido benzoico de Asbestinino 7, se obtienen 42 mg (70 % de rendimiento) de Asbestinino 7-6-benzoilado. El producto posee un Punto de Fusión de 398 ± 2 o C con descomposición. Se observan cinco señales de 1 RMN adicionales al de Asbestinino 7 en la región de ppm, correspondiendo al anillo aromático de la fracción del ester benzoilo y la señal correspondiente al 6, es desplazada a campo bajo de 4.56 ppm a 5.42 ppm, típico de haber sufrido esterificación dicha posición hidroxilada. El Espectro de Masas de Impacto Electrónico, muestra un peso molecular de 624 umas. Esquema 1. Benzoilación de Asbestinino 7 C 3 C 2 1. DCC 2. DMAP 3. Anhidrido Benzoico C 3 III Glucosidación de Asbestinino 7-6-benzoilado. Como producto de la reacción de glucosidación del Asbestinino benzoilado, se obtienen 7.0 mg del Asbestinino 7-6-glucosidado (0.01 mmol, 17% de rendimiento). El producto se descompone arriba de 225 o C. Se observan seis señales de 1 RMN adicionales al de Asbstinino 7 en la región de 3.35 a 3.62 ppm que corresponden a los protones hidroxilados del azúcar y una a 4.57 ppm que corresponde al protón anomérico. La señal correspondiente al 6, es desplazada a campo alto de 4.56 ppm a 3.26 ppm, típico de haber sufrido alquilación dicha posición. El Espectro de Masas de Impacto Electrónico, muestra un peso molecular de 682 umas. C 2

25 21 Esquema 2. Glucosidación de Asbestinino 7-6-benzoilado C 3 C ,3,4,6-tetra--bencil glucopiranosa 2. (Bu 4 N)S 4 3. K 4. Cl C 3 C 2 III.1.7 Urocanización de 4-deoxyasbestinino G, Briarellina E, Asbestinino 20 y Asbestinino 7. III Urocanización de 4-deoxyasbestinino G. Como resultado de la reacción de esterificación de 35 mg (0.08 mmol) de 4- deoxyasbestinino G con ácido urocánico, se obtienen 27 mg (0.05 mmol, 62.5% de rendimiento) de 6-ester urocánico de 4-deoxyasbestinino G. Por la poca cantidad de compuesto obtenido y la descomposición observada en el derivado glucosidado de Asbestinino 7, no se procedió a tomar su Punto de Fusión. Se observan cuatro señales de 1 RMN adicionales al de 4-deoxiyasbestinino G, una en la región de 6.0 ppm que corresponde a uno de los protones vinílicos de la cadena alifática del éster urocánico y tres a ppm que corresponden al otro protón vinílico y los protones del anillo nitrogenado del éster. La señal correspondiente al 6, es desplazada a campo bajo de 4.22 ppm a 5.18 ppm, típico de haber sufrido esterificación dicha posición. El Espectro de Masas de Impacto Electrónico, muestra un peso molecular de 526 umas. Esquema 3. Esterificación con Acido Urocánico de 4-deoxyasbestinino G C 3 C 2 1. DCC 2. DMAP 3. Acido Urocánico C 3 C 2 N N III Urocanización de Briarellina E. Como resultado de la reacción de esterificación de 30 mg (0.06 mmol) de Briarellina E con ácido urocánico, se obtienen 22 mg (0.036 mmol, 61.0% de rendimiento) de 6-ester urocánico de Briarellina E. Por la poca cantidad de compuesto obtenido y la descomposición observada en el derivado glucosidado de Asbestinino 7, no se procedió a tomar su Punto de Fusión. Se observan cuatro señales de 1 RMN adicionales a las de Briarellina E, una en la región de 6.2 ppm que corresponde a uno de los protones vinílicos de la cadena alifática del éster urocánico y tres a ppm que corresponden al otro protón vinílico y los protones del anillo nitrogenado del éster. La señal correspondiente al 6, es desplazada a

26 22 campo bajo de 4.18 ppm a 5.24 ppm, típico de haber sufrido esterificación dicha posición. El Espectro de Masas de Impacto Electrónico, muestra un peso molecular de 598 umas. 3 C Esquema 4. Esterificación con Acido Urocánico de Briarellina E C 3 C 2 1. DCC 2. DMAP 3. Acido Urocánico 3 C C 3 C 2 N N III Urocanización de Asbestinino 20. Como resultado de la reacción de esterificación de 25 mg (0.066 mmol) de Asbestinino 20 con ácido urocánico, se obtienen 17 mg (0.034 mmol, 52.0% de rendimiento) de 6-ester urocánico de Asbestinino 20. Por la poca cantidad de compuesto obtenido y la descomposición observada en el derivado glucosidado de Asbestinino 7, no se procedió a tomar su Punto de Fusión. Se observan cuatro señales de 1 RMN adicionales al de Asbestinino 20, una en la región de 6.1 ppm que corresponde a uno de los protones vinílicos de la cadena alifática del éster urocánico y tres a ppm que corresponden al otro protón vinílico y los protones del anillo nitrogenado del éster. La señal correspondiente al 6, es desplazada a campo bajo de 4.09 ppm a 5.14 ppm, típico de haber sufrido esterificación dicha posición. El Espectro de Masas de Impacto Electrónico, muestra un peso molecular de 498 umas. Esquema 5. Esterificación con Acido Urocánico de Asbestinino 20 C 2 1. DCC 2. DMAP 3. Acido Urocánico C 2 N N C 3 C 3 III Urocanización de Asbestinino 7. Como resultado de la reacción de esterificación de 50 mg (0.096 mmol) de Asbestinino 7 con ácido urocánico, se obtienen 46 mg (0.071 mmol, 74.0% de rendimiento) de 6-ester urocánico de Asbestinino 7. Por la poca cantidad de compuesto obtenido y la descomposición observada en el derivado glucosidado de este mismo compuesto, no se procedió a tomar su Punto de Fusión. Se observan cuatro señales de 1 RMN adicionales al de Asbestinino 7, una en la región de 6.0 ppm que corresponde a uno de los protones vinílicos de la cadena alifática

27 23 del éster urocánico y tres a ppm que corresponden al otro protón vinílico y los protones del anillo nitrogenado del éster. La señal correspondiente al 6, es desplazada a campo bajo de 4.53 ppm a 5.19 ppm, típico de haber sufrido esterificación dicha posición. El Espectro de Masas de Impacto Electrónico, muestra un peso molecular de 640 umas. Esquema 6. Esterificación con Acido Urocánico de Asbestinino 7 C 3 C 2 1. DCC 2. DMAP 3. Acido Urocánico C 3 C 2 N N III.1.8 Determinación de la actividad citotóxica de Cembranoides 2,11-ciclizados derivatizados. La interpretación de los resultados se realizó mediante inferencia estadística, haciendo uso de técnicas no paramétricas, donde se utilizó para la estimación de concentraciones inhibitorias al 50% (CI 50 ) el método de Trimmed Spearman-Karber, versión 1.5, para la actividad citotóxica en nauplios de A. salina. Se determinó la actividad citotóxica contra A. salina de 6-glucósido de asbestinino 7, 6-ester urocánico de 4-deoxyasbestinino G, 6-ester urocánico de Briarellina E, 6-ester urocánico de Asbestinino 20 y 6-ester urocánico de Asbestinino 7 los que fueron evaluados por quintuplicado agregando 100 µl del extracto disuelto y 100 µl del agua de mar con nauplios (concentración final de 1mg/mL), utilizando como control negativo 100 µl de agua de mar y 100 µl de agua de mar con nauplios. III Tamizaje de la actividad citotóxica de Cembranoides 2,11-ciclizados a 1 mg/ml contra nauplios de A. Salina.

28 24 Compuesto Cuadro 1. Tamizaje de actividad Citotóxica Contra Nauplios de A. salina. Pozo No.1 Muertos /Total 4-deoxyasbestinino G 10/10 10/10 10/10 10/10 10/10 50/ ester urocánico de 10/10 10/10 10/10 10/10 10/10 50/ deoxyasbestinino G Briarellina E 10/10 10/10 10/10 10/10 10/10 50/ ester urocánico de 10/10 10/10 10/10 10/10 10/10 50/ Briarellina E Asbestinino 20 10/10 10/10 10/10 10/10 10/10 50/ ester urocánico de 10/10 10/10 10/10 10/10 10/10 50/ Asbestinino 20 Asbestinino 7 10/10 10/10 10/10 10/10 10/10 50/ ester urocánico de 10/10 10/10 10/10 10/10 10/10 50/ Asbestinino 7 6-glucósido de 10/10 10/10 10/10 10/10 10/10 50/ Asbestinino 7 Como el porcentaje de mortalidad de nauplios de A. salina en todos los compuestos fue del 100 por ciento (CL 50 menor de 1 mg/ml), se realizó la prueba nuevamente utilizando concentraciones mucho más bajas. Fuente: Datos experimentales. III Determinación de la CL 50 de Cembranoides 2,11-ciclizados. La CL 50, se calculó por el método de Trimmed Spearman-Karber v. 1.5 (amilton et. al. 1977), utilizando tres diferentes concentraciones de los compuestos a evaluar (1.0, 0.5 y 0.25 g/ml), seleccionadas debido a que la literatura reporta concentraciones de citotoxicidad para asbestininos en el rango de los 10 g/ml (Cóbar,.M. 1996). Cuadro 2. Concentración Letal Media de Cembranoides 2,11-ciclizados Compuesto % de nauplios muertos por cada concentración CL 50 g/ml Intervalo de Confianza 1.0 g/ml 0.50 g/ml 0.01 g/ml (nanomolar) LCS-LCI al 95% 4-deoxyasbestinino G (1480) 6-ester urocánico de deoxyasbestinino G (260) Briarellina E (830) 6-ester urocánico de Briarellina E (150) Asbestinino (1320) 6-ester urocánico de Asbestinino 20 (230) Asbestinino (200) 6-ester urocánico de Asbestinino 7 (110) 6-glucósido de Asbestinino 7 (14950) Fuente: Datos experimentales. Pozo No.2 Muertos /Total Pozo No.3 Muertos /Total Pozo No.4 Muertos /Total Pozo No.5 Muertos /Total Total muertos/ Total ensayo Nauplios muertos (%)

29 25 III.1.9 Modelaje Molecular y Propiedades Farmacofóricas de Cembranoides 2,11- ciclizados Derivatizados. Los resultados obtenidos de los cembranoides 2,11-ciclizados naturales (se incluyen Sarcodictina A y B y Eleutherobina) y derivatizados se presentan en las tablas siguientes: III ptimización Geométrica y Propiedades Farmacofóricas de 4- deoxyasbestinino G. Cuadro 3. Propiedades Fisicoquímicas y Farmacofóricas de 4-deoxyasbestinino G. C 3 Propiedad Valor Fórmula Molecular C Peso molecular (umas) Calor de Formación (Kcal/Mol) clogp TPSA No. de Aceptores 5 No. de Donadores 1 Negativos Ionizables 0 Positivos Ionizables 0 Atomos/Enlaces 68/71 Anillos 4 Enlaces Rotables 9 Atomos Aromáticos 0 Momento Dipolar (Debyes) 5.17 Fuente: Datos experimentales III ptimización Geométrica y Propiedades Farmacofóricas de 6-ester urocánico de 4-deoxyasbestinino G. Cuadro 4. Propiedades Fisicoquímicas y Farmacofóricas de 6-éster urocánico de 4- deoxyasbestinino G. C 2 C 2 C 3 N N

30 26 Propiedad Valor Fórmula Molecular C N 2 6 Peso molecular (umas) Calor de Formación (Kcal/Mol) clogp TPSA No. De Aceptores 7 No. De Donadores 0 Negativos Ionizables 0 Positivos Ionizables 0 Atomos/Enlaces 83/88 Anillos 5 Enlaces Rotables 13 Atomos Aromáticos 5 Momento Dipolar (Debyes) 5.94 Fuente: Datos experimentales. III ptimización Geométrica y Propiedades Farmacofóricas de Briarellina E. Cuadro 5. Propiedades Fisicoquímicas y Farmacofóricas de Briarellina E. Propiedad 3 C C 3 C 2 Valor Fórmula Molecular C Peso molecular (umas) Calor de Formación (Kcal/Mol) clogp TPSA No. de Aceptores 6 No. de Donadores 2 Negativos Ionizables 0 Positivos Ionizables 0 Atomos/Enlaces 82/85 Anillos 4 Enlaces Rotables 15 Atomos Aromáticos 0 Momento Dipolar (Debyes) 7.95 Fuente: Datos experimentales III ptimización Geométrica y Propiedades Farmacofóricas de 6-ester urocánico de Briarellina E. Cuadro 6. Propiedades Fisicoquímicas y Farmacofóricas de 6-ester urocánico de Briarellina E.

31 27 3 C C 2 N N C 3 Propiedad Valor Fórmula Molecular C N 2 Peso molecular (umas) Calor de Formación (Kcal/Mol) clogp TPSA No. de Aceptores 8 No. de Donadores 1 Negativos Ionizables 0 Positivos Ionizables 0 Atomos/Enlaces 98/102 Anillos 5 Enlaces Rotables 19 Atomos Aromáticos 5 Momento Dipolar (Debyes) Fuente: Datos experimentales. III ptimización Geométrica y Propiedades Farmacofóricas de Asbestinino 20. Cuadro 7. Propiedades Fisicoquímicas y Farmacofóricas de Asbestinino 20. C 3 Propiedad Valor Fórmula Molecular C Peso molecular (umas) Calor de Formación (Kcal/Mol) clogp TPSA No. de Aceptores 5 No. de Donadores 1 Negativos Ionizables 0 Positivos Ionizables 0 Atomos/Enlaces 61/65 Anillos 4 Enlaces Rotables 7 Atomos Aromáticos 0 Momento Dipolar (Debyes) 4.50 Fuente: Datos experimentales. C 2

32 28 III ptimización Geométrica y Propiedades Farmacofóricas de 6-ester urocánico de Asbestinino 20. Cuadro 8. Propiedades Fisicoquímicas y Farmacofóricas de 6-ester urocánico de Asbestinino 20. C 2 N N C 3 Propiedad Valor Fórmula Molecular C N 2 6 Peso molecular (umas) Calor de Formación (Kcal/Mol) clogp TPSA No. de Aceptores 7 No. de Donadores 0 Negativos Ionizables 0 Positivos Ionizables 0 Atomos/Enlaces 77/82 Anillos 5 Enlaces Rotables 11 Atomos Aromáticos 5 Momento Dipolar (Debyes) 7.26 Fuente: Datos experimentales. III ptimización Geométrica y Propiedades Farmacofóricas de Asbestinino 7. Cuadro 9. Propiedades Fisicoquímicas y Farmacofóricas de Asbestinino 7. C 3 C 2 Propiedad Valor Fórmula Molecular C Peso molecular (umas) Calor de Formación (Kcal/Mol) clogp TPSA No. de Aceptores 7 No. de Donadores 1 Negativos Ionizables 0 Positivos Ionizables 0

33 29 Atomos/Enlaces 84/87 Anillos 4 Enlaces Rotables 16 Atomos Aromáticos 0 Momento Dipolar (Debyes) 3.40 Fuente: Datos experimentales. III ptimización Geométrica y Propiedades Farmacofóricas de 6-ester urocánico de Asbestinino 7. Cuadro 10. Propiedades Fisicoquímicas y Farmacofóricas de 6-ester urocánico de Asbestinino 7. C 3 C 2 Propiedad Valor Fórmula Molecular C Peso molecular (umas) Calor de Formación (Kcal/Mol) clogp TPSA No. de Aceptores 9 No. de Donadores 0 Negativos Ionizables 0 Positivos Ionizables 0 Atomos/Enlaces 98/103 Anillos 5 Enlaces Rotables 19 Atomos Aromáticos 5 Momento Dipolar (Debyes) 5.44 Fuente: Datos experimentales. III ptimización Geométrica y Propiedades Farmacofóricas de 6-glucósido de Asbestinino 7. Cuadro 11. Propiedades Fisicoquímicas y Farmacofóricas de 6-glucósido de Asbestinino 7. C 3 C 2 N N

34 30 Propiedad Valor Fórmula Molecular C Peso molecular (umas) Calor de Formación (Kcal/Mol) clogp TPSA No. de Aceptores 12 No. de Donadores 4 Negativos Ionizables 0 Positivos Ionizables 0 Atomos/Enlaces 103/108 Anillos 5 Enlaces Rotables 21 Atomos Aromáticos 0 Momento Dipolar (Debyes) 4.66 Fuente: Datos experimentales. III ptimización Geométrica y Propiedades Farmacofóricas de Asbestinino 9 Cuadro 12. Propiedades Fisicoquímicas y Farmacofóricas de Asbestinino 9. C 2 C 3 Propiedad Valor Fórmula Molecular C Peso molecular (umas) Calor de Formación (Kcal/Mol) clogp TPSA No. de Aceptores 5 No. de Donadores 0 Negativos Ionizables 0 Positivos Ionizables 0 Atomos/Enlaces 65/70 Anillos 4 Enlaces Rotables 8 Atomos Aromáticos 0 Momento Dipolar (Debyes) 5.98 Fuente: Datos experimentales. III ptimización Geométrica y Propiedades Farmacofóricas de Sarcodictina A.

35 31 Cuadro 13. Propiedades Fisicoquímicas y Farmacofóricas de Sarcodictina A. C 3 C 3 CMe Sarcodictina A Propiedad Valor Fórmula Molecular C N 2 6 Peso molecular (umas) Calor de Formación (Kcal/Mol) clogp TPSA No. de Aceptores 7 No. de Donadores 1 Negativos Ionizables 0 Positivos Ionizables 0 Atomos/Enlaces 76/80 Anillos 4 Enlaces Rotables 13 Atomos Aromáticos 5 Momento Dipolar (Debyes) 7.95 Fuente: Datos experimentales. III ptimización Geométrica y Propiedades Farmacofóricas de Sarcodictina B. Cuadro 14. Propiedades Fisicoquímicas y Farmacofóricas Sarcodictina B. C 3 N N C 3 N 3 C C 3 N C 3 CEt 3 C C 3 Propiedad Valor Fórmula Molecular C N 2 6 Peso molecular (umas) Calor de Formación (Kcal/Mol) clogp TPSA No. de Aceptores 7 No. de Donadores 1 Negativos Ionizables 0 Positivos Ionizables 0 Atomos/Enlaces 79/83 Anillos 4 Enlaces Rotables 14 Atomos Aromáticos 5 Momento Dipolar (Debyes) 7.79 Fuente: Datos experimentales.

36 32 III ptimización Geométrica y Propiedades Farmacofóricas de Eleutherobina. Cuadro 15. Propiedades Fisicoquímicas y Farmacofóricas de Eleutherobina. 3 C 3 C C 3 C 3 N N C 3 Propiedad Valor Fórmula Molecular C N 2 9 Peso molecular (umas) Calor de Formación (Kcal/Mol) clogp TPSA No. de Aceptores 11 No. de Donadores 2 Negativos Ionizables 0 Positivos Ionizables 0 Atomos/Enlaces 99/104 Anillos 5 Enlaces Rotables 19 Atomos Aromáticos 5 Momento Dipolar (Debyes) 6.24 Fuente: Datos experimentales.

37 33 III.2 Discusión de Resultados III.2.1 btención de la Muestra y Extractos rgánicos. El espécimen a trabajar fue colectado y tratado preliminarmente como lo establece la literatura relacionada con Química de Productos Naturales Marinos y publicaciones específicas sobre cembranoides 2,11-ciclizados. Los procedimientos de obtención del extracto orgánico crudo se orientaron a separar las fracciones no polares, las que se fraccionaron posteriormente utilizando Cromatografía de Exclusión de Tamaño para separar los cembranoides de peso molecular intermedio de otras moléculas orgánicas y clorofila. Los protocolos de fraccionamiento del extracto crudo y obtención de los extractos orgánicos se orientaron hacia la separación por polaridad de los distintos tipos de metabolitos secundarios, trabajándose el extracto n-hexánico por ser el más rico en cembranoides 2,11-ciclizados de acuerdo a la literatura y estudios realizados de Cromatografía en Capa Fina. El rendimiento del extracto crudo fue superior (12% vs. 9%) de lo reportado para este organismo, debiéndose principalmente al cuidado en los procedimientos de extracción y fraccionamiento, así como la experiencia previa del investigador principal en el aislamiento y separación de estos metabolitos. El rendimiento de los extractos orgánicos es ligeramente diferente a los reportados en la literatura, ya que se buscó enriquecer el extracto n-hexánico realizando más extracciones exhaustivas con dicho solvente, lo que produjo un 74 % de rendimiento, en lugar del típico cercano al 50%. Lo anterior en detrimento del extracto clorofórmico, del que se obtuvo un 14% de rendimiento en lugar del 30% aproximadamente que se reporta en la literatura. III.2.2 Síntesis, Aislamiento y Elucidación Estructural de Cembranoides 2,11- ciclizados. III Aislamiento y Elucidación Estructural de Asbestinino 9. El aislamiento de Asbestinino 9 se realiza de acuerdo a lo reportado en la literatura, utilizando PLC fase reversa con columna analítica DS como fase estacionaria y Me/ 2 como fase móvil. Sin embargo debido a la solubilidad de la muestra, se utilizó una proporción de fase móvil de 9:1 en lugar de 7:3, dando buenos resultados (40% de rendimiento del compuesto puro con relación a la fracción purificada). El compuesto se identifica fácilmente por sus señales de 1 -RMN y 13 C-RMN producidas por su doble enlace exocíclico, el éster butirato, la ausencia de señales debidas a 6 y el aparecimiento del grupo carbonilo a 206 ppm y las típicas del esqueleto de los asbestininos. El espectro de masas de impacto electrónico del compuesto muestra al ion molecular a m/z 404 y el fragmento a m/z 316 (pérdida del grupo butirato), que confirman su identidad.

38 34 Este compuesto por no poseer un grupo hidroxilo en posición 6 (carbonilo en su lugar), no se utilizó para derivatización, sin embargo se utilizará para confirmar su estructura y determinar si el grupo carbonilo se encuentra en la posición 4 o 6. III Aislamiento y Elucidación Estructural de 4-Deoxyasbestinino G. El aislamiento de 4-Deoxyasbestinino G se realiza de acuerdo a lo reportado en la literatura, utilizando Cromatografía en Columna (CC) en fase normal, con Sílica Gel G60 como fase estacionaria y n-hexano/etac (8:2) como fase móvil. Sin embargo, debido a la solubilidad de la muestra, se utilizó únicamente una columna de fase estacionaria, en lugar de el tándem 2% de Me en CCl 3 seguido de n-hexano/etac (85:15) que reporta la literatura. Se obtuvo un rendimiento aceptable del 16% del compuesto puro con relación a la fracción purificada. El compuesto se identifica inequivocamente por sus señales de 1 -RMN y 13 C- RMN producidas por su doble enlace exocíclico, el éster butirato, la presencia de señales debidas a 6 y C6 en la zona de 4 ppm y 90 ppm respectivamente y las típicas del esqueleto de los asbestininos. El espectro de masas de impacto electrónico del compuesto muestra al ion molecular a m/z 406, el fragmento a m/z 318 (pérdida del grupo butirato) y el fragmento debido a la pérdida consecutiva de butirato y agua desde el ion molecular a m/z 300, que confirman su identidad. Parte de este compuesto será derivatizado a su éster urocánico y otra para confirmar si posee un grupo hidroxilo o peroxilo en posición 6 de acuerdo a la hipótesis planteada por Rodríguez y colaboradores (Rodríguez, 2006). III Síntesis, Aislamiento y Elucidación Estructural de 6-ester urocánico de 4- Deoxyasbestinino G. La síntesis del 6-ester urocánico de 4-Deoxyasbestinino G se realiza de acuerdo al protocolo reportado en la literatura, el rendimiento de la esterificación es satisfactorio (62.5% contra un 76 % reportado para urocanización de compuestos de estructura similar). El aislamiento del compuesto se logra al rotaevaporar el solvente remanente y extraer en fase etérea al compuesto orgánico de acuerdo al protocolo reportado en la literatura. La identificación del compuesto se logra inequívocamente por sus señales de 1 - RMN a 6.0, 7.1, 7.3 y 7.6, típicos de que el grupo urocanato se enlazó a la molécula. El hecho de que 6 del compuesto derivatizado se desplazó 0.96 ppm a campo bajo con relación a 4-Deoxyasbestinino G, es indicativo de que existió esterificación en esta posición. Su espectro de masas de impacto electrónico muestra al ion molecular a m/z 526, el fragmento a m/z 438 (pérdida del grupo butirato), m/z 388 (pérdida del grupo urocanato) y m/z 300 (pérdida de los grupos butirato y urocanato) a partir del ion molecular.

39 35 No se tomó el punto de fusión del compuesto debido al riesgo de su descomposición y pérdida irreversible. III Aislamiento y Elucidación Estructural de Briarellina E. El aislamiento de Briarellina E se realiza de acuerdo a lo reportado en la literatura, utilizando PLC fase reversa con columna analítica DS como fase estacionaria y Me/ 2 (8:2) como fase móvil. Se obtuvo un muy buen rendimiento del 52% del compuesto puro con relación a la fracción purificada. El compuesto se identifica fácilmente por sus señales de 1 -RMN y 13 C-RMN producidas por su doble enlace exocíclico, el éster octanoato, la presencia de señales debidas a 6 y C6 en la zona de 4 ppm y 74 ppm respectivamente y las típicas del esqueleto de las briarellinas. Es importante señalar la presencia de las señales de 1 -RMN a 3.4 y 3.6 ppm y de 13 C-RMN a 67 ppm, que indican que no posee el grupo lactónico típico de otras briarellinas. El espectro de masas de impacto electrónico del compuesto muestra al ion molecular a m/z 478, el fragmento a m/z 334 (pérdida del grupo octanoato) y el fragmento a m/z 316 debido a la pérdida sucesiva de octanoato y agua, que confirman su identidad. Parte de este compuesto será derivatizado a su éster urocánico. III Síntesis, Aislamiento y Elucidación Estructural de 6-ester urocánico de Briarellina E. La síntesis del 6-ester urocánico de Briarellina E se realiza de acuerdo al protocolo reportado en la literatura, el rendimiento de la esterificación es satisfactorio (61% contra un 76 % reportado para urocanización de compuestos de estructura similar). El aislamiento del compuesto se logra al rotaevaporar el solvente remanente y extraer en fase etérea al compuesto orgánico de acuerdo al protocolo reportado en la literatura. La identificación del compuesto se logra inequívocamente por sus señales de 1 - RMN a 6.2, 7.2, 7.4 y 7.8, típicos de que el grupo urocanato se enlazó a la molécula. El hecho de que 6 del compuesto derivatizado se desplazó 1.06 ppm a campo bajo con relación a Briarellina E, es indicativo de que existió esterificación en esta posición. Su espectro de masas de impacto electrónico muestra al ion molecular a m/z 598, el fragmento a m/z 454 (pérdida del grupo octanoato), m/z 460 (pérdida del grupo urocanato) y m/z 316 (pérdida de los grupos octanoato y urocanato) a partir del ion molecular. No se tomó el punto de fusión del compuesto debido al riesgo de su descomposición y pérdida irreversible. III Aislamiento y Elucidación Estructural de Asbestinino 20. El aislamiento de Asbestinino 20 se realiza de acuerdo a lo reportado en la literatura, inicialmente PLC en fase reversa (columna DS y Me: 2 75:25),

40 36 seguido de Cromatografía en Columna (CC) en fase normal, con Sílica Gel G60 como fase estacionaria y n-hexano/etac (8:2) como fase móvil. Se obtuvo un rendimiento bueno del 52% del compuesto puro con relación a la fracción purificada. El compuesto se identifica inequivocamente por sus señales de 1 -RMN y 13 C- RMN producidas por su doble enlace exocíclico, el éster acetato, la presencia de señales debidas a 6 y C6 en la zona de 4 ppm y 75 ppm respectivamente y las típicas del esqueleto de los asbestininos. El espectro de masas de impacto electrónico del compuesto muestra al ion molecular a m/z 378, el fragmento a m/z 318 (pérdida del grupo acetato) y el fragmento debido a la pérdida de agua desde el ion molecular a m/z 360, que confirman su identidad. Parte de este compuesto será derivatizado a su éster urocánico. III Síntesis, Aislamiento y Elucidación Estructural de. 6-ester urocánico de Asbestinino 20. La síntesis del 6-ester urocánico de Asbestinino 20 se realiza de acuerdo al protocolo reportado en la literatura, el rendimiento de la esterificación es satisfactorio (52% contra un 76 % reportado para urocanización de compuestos de estructura similar). El aislamiento del compuesto se logra al rotaevaporar el solvente remanente y extraer en fase etérea al compuesto orgánico de acuerdo al protocolo reportado en la literatura. La identificación del compuesto se logra inequívocamente por sus señales de 1 - RMN a 6.1, 7.1, 7.5 y 7.8, típicos de que el grupo urocanato se enlazó a la molécula. El hecho de que 6 del compuesto derivatizado se desplazó 1.05 ppm a campo bajo con relación a Asbestinino 20, es indicativo de que existió esterificación en esta posición. Su espectro de masas de impacto electrónico muestra al ion molecular a m/z 498, el fragmento a m/z 438 (pérdida del grupo acetato), m/z 360 (pérdida del grupo urocanato) y m/z 300 (pérdida de los grupos acetato y urocanato) a partir del ion molecular. No se tomó el punto de fusión del compuesto debido al riesgo de su descomposición y pérdida irreversible. III Aislamiento y Elucidación Estructural de Asbestinino 7. El aislamiento de Asbestinino 7 se realiza de acuerdo a lo reportado en la literatura, utilizando PLC en fase reversa (columna DS como fase estacionaria y Me: 2 93:07 como fase móvil). Se obtuvo un buen rendimiento del 48% del compuesto puro con relación a la fracción purificada. El compuesto se identifica inequivocamente por sus señales de 1 -RMN y 13 C- RMN producidas por su doble enlace exocíclico, el éster acetato, el éster octanoato, la presencia de señales debidas a 6 y C6 en la zona de 4.5 ppm y 87 ppm respectivamente y las típicas del esqueleto de los asbestininos. El espectro de masas de impacto electrónico del compuesto muestra al ion molecular a m/z 520, los fragmentos a m/z 460 (pérdida del grupo acetato), m/z 376

41 37 (pérdida del grupo octanoato y el fragmento debido a la pérdida de agua desde el ion molecular a m/z 502, que confirman su identidad. Parte de este compuesto será derivatizado a su éster urocánico y su glucósido. III Síntesis, Aislamiento y Elucidación Estructural de 6-ester urocánico de Asbestinino 7. La síntesis del 6-ester urocánico de Asbestinino 7 se realiza de acuerdo al protocolo reportado en la literatura, el rendimiento de la esterificación es excelente (72% contra un 76 % reportado para urocanización de compuestos de estructura similar). El aislamiento del compuesto se logra al rotaevaporar el solvente remanente y extraer en fase etérea al compuesto orgánico de acuerdo al protocolo reportado en la literatura. La identificación del compuesto se logra inequívocamente por sus señales de 1 - RMN a 6.0, 7.1, 7.3 y 7.6, típicos de que el grupo urocanato se enlazó a la molécula. El hecho de que 6 del compuesto derivatizado se desplazó 0.66 ppm a campo bajo con relación a Asbestinino 7, es indicativo de que existió esterificación en esta posición. Su espectro de masas de impacto electrónico muestra al ion molecular a m/z 640, el fragmento a m/z 580 (pérdida del grupo acetato), m/z 502 (pérdida del grupo urocanato) y m/z 496 (pérdida del grupo octanoato) a partir del ion molecular. No se tomó el punto de fusión del compuesto debido al riesgo de su descomposición y pérdida irreversible. III Síntesis, Aislamiento y Elucidación Estructural de 6-glucósido de Asbestinino 7. La síntesis del 6-ester urocánico de Asbestinino 7 se realiza de acuerdo al protocolo reportado en la literatura en dos etapas; primero la benzoilación de asbestinino 7 y luego la glucosidación del asbestinino benzoilado. III Benzoilación de Asbestinino 7. El aislamiento del compuesto se logra al rotaevaporar el solvente remanente y extraer en éter dietílico al compuesto orgánico de acuerdo al protocolo reportado en la literatura, obteniéndose un buen 70% de rendimiento de reacción. La identificación del compuesto se logra inequívocamente por sus señales de 1 - RMN a 6.9, 7.1, 7.3 y dos a 7.4 ppm, correspondientes al anillo bencénico del grupo benzoato, indicativo de que este grupo se enlazó a la molécula. El hecho de que 6 del compuesto derivatizado se desplazó 0.86 ppm a campo bajo con relación a Asbestinino 7, es indicativo de que existió esterificación en esta posición. Su espectro de masas de impacto electrónico muestra al ion molecular a m/z 624, el fragmento a m/z 564 (pérdida del grupo acetato), m/z 502 (pérdida del grupo benzoato) y m/z 480 (pérdida del grupo octanoato) a partir del ion molecular.

42 38 Al tomarse el punto de fusión del compuesto puro, la muestra se descompuso alrededor de los 398 grados centígrados, por lo que se tomó la determinación de no obtener el punto de fusión de los demás derivados, al sintetizarse poca cantidad de muestra y evitar así su pérdida irreversible. III Glucosidación de Asbestinino 7-6-benzoilado. El producto de la reacción de glucosidación se purifica al extraerse con acetato de etilo y rotaevaporarse el exceso del solvente de acuerdo al protocolo establecido en la literatura. El rendimiento de la reacción (17%) puede considerarse bueno, tomando en cuenta que la reacción es multietapas y compleja para realizarse. La identificación de la molécula se logra por sus señales de 1 -RMN adicionales al de Asbstinino 7 a 3.35, 3.40, 4.47, 3.50, 3.54 y 3.62 ppm, que corresponden a los protones hidroxilados de la glucosa. Adicionalmente el protón anomérico de la glucosa se identifica por su señal de 1 -NMR a 4.6 ppm. El desplazamiento a campo bajo de la señal asignada a 6 en Asbestinino 7, por 1.3 ppm es indicativo de existió glucosidación en esta posición. Los fragmentos a m/z de 682 (ion molecular), m/z 622 (pérdida del grupo acetato), m/z 538 (pérdida del grupo octanoato) y m/z 502 (pérdida de glucosa), confirman la identidad del compuesto. Al intentar tomar el punto de fusión de este derivado, este se descompuso arriba de los 225 o C. III.2.3 Actividad Citotóxica de Cembranoides 2,11-ciclizados. III Tamizaje inicial. El resultado del tamizaje inicial de la actividad citotóxica contra nauplios de A. salina, de los cuatro cembranoides 2,11-ciclizados naturales aislados, los cuatro derivados 6-ester urocánico y el derivado 6-glucosidado, resultó en la muerte del 100 % de los nauplios en cada ensayo a una concentración de 1 mg/ml del compuesto. Este resultado esperado, debido a la citotoxicidad reportada en la literatura para los cembranoides 2,11-ciclizados, originó que se bajara la concentración de los compuestos a un rango entre 1 g/ml y 0.01 g/ml. III Tamizaje a concentraciones de entre 1 g/ml y 0.01 g/ml y determinación de la CL 50. Al analizar los resultados de CL 50 de los cembranoides 2,11-ciclizados naturales, se observa que todos ellos tienen valores en el rango nanomolar, siendo el de menor valor Asbestinino 7 (200 nm), luego Briarellina E (830 nm), Asbestinino 20 (1320 nm) y 4- deoxyasbestinino G (1480 nm). Estos valores son importantes, ya que demuestran se altamente citotóxicos y comparables a Eleutherobina (200 nm).

43 39 Realizando un análisis de la relación Estructura/CL 50 de los cembranoides naturales, se puede asumir que la presencia del ester octanoato (común en Briarellina E y Asbestinino 7) puede ser factor que determine el incremento en su citotoxicidad ante los nauplios de A. salina. Comparando entre sí los datos de CL 50 de los cembranoides 6-ester urocánico, se observa la misma tendencia en el orden de citotoxicidad que la observada en los cembranoides naturales, sin embargo es importante señalar que se incrementa la citotoxicidad entre un 15% a un 18%, siendo congruente con la hipótesis planteada de que al urocanizar estos cembranoides en la posición 6 se incrementaría su citotoxicidad. Al analizar las concentraciones letales medias a nivel nanomolar, se observa que el 6-ester urocánico de Asbestinino 7 (110 nm) y el de Briarellina E (150 nm) posen valores de CL 50 inferiores a Eleutherobina (200 nm), lo que los hace muy promisorios como probables medicamentos anticáncer, bajo el supuesto de que este último se encuentra en Fase Clínica III en el Instituto Nacional del Cáncer en Estados Unidos - NCI- como medicamento contra cierto tipo de cáncer. Los otros derivados 6-éster urocánico, presentaron valores cercanos a Eleutherobina pero superiores a ella (230 nm para Asbestinino 20 y 260 nm para 4- deoxyasbestinino G). Lo anterior no los descarta como potenciales medicamentos anticáncer. Es importante observar que la similitud estructural existente entre Asbestinino 20 y 4- deoxyasbestinino G y sus derivados 6-ester urocánico entre sí, genera citotoxicidades similares entre sí (230 nm vs. 260 nm respectivamente). La CL 50 mostrada por el 6-Glucósido de Asbestinino 7 fue baja (14,950 nm o M) fue pobre, lo que determinó que por la complejidad de la reacción multietapas de síntesis, el bajo rendimiento observado en la misma y la baja cantidad de cembranoides naturales aislados, no se sintetizaran los otros tres derivados 6- glucosidados. Es de hacer notar que los valores de CL 50 reportados en la literatura para algunos cembranoides 2,11-ciclizados se encuentra en el rango de 200 a 1,000 nm, con Asbestinino 7 presentando 288 nm (Leukemia/CCRF-CEM), sin embargo fueron calculados utilizando líneas celulares cancerosas como Breast Cancer/MCF7, Leukemia/CCRF-CEM y Colon Cancer/CT-116 entre otras, por que las comparaciones con los valores de CL 50 obtenidos contra nauplios de A. salina no pueden hacerse directamente. III.2.4 Modelaje Molecular y Propiedades Farmacofóricas de Cembranoides 2,11- ciclizados. III Conformación de Mínima Energía. Al comparar los parámetros fisicoquímicos obtenidos en la ptimización Geométrica, entendiéndola como la técnica fundamental de la modelización molecular, cuyo objetivo es obtener las conformaciones de baja energía de los compuestos estudiados, se infiere que:

44 40 Dentro de los cembranoides 2,11-ciclizados naturales, la conformación de mínima energía más alta corresponde a Asbestinino 7 ( Kcal/mol) y la más baja a Asbestinino 20 ( Kcal/mol). Dentro de los derivados éster urocánico corresponde el de valor más alto de conformación de mínima energía al derivado de Asbestinino 7 ( Kcal/mol) y el de más baja al derivado de Asbestinino 20 ( Kcal/mol). Lo anterior es congruente con que a un incremento en el peso molecular del compuesto, su valor de mínima energía conformacional es más alto. Comparando los valores de mínima energía conformacional del derivado éster urocánico de 4-deoxyasbestinino G (pm 508 umas, Kcal/mol) con los de Sarcodictina B (pm 510 umas, Kcal-mol), que poseen peso molecular comparable, se observa un menor valor en Sarcodictina B, indicando que es una molécula energéticamente más estable. Los valores de Momento Dipolar son distintos para ambos compuestos (7.75 D para Sarcodictina B y 5.49 D para éster urocánico de 4-deoxyasbestinino G), lo que indica que es una molécula más polar Sarcodictina B, debido fundamentalmente a la posición del éster urocánico en la molécula. Los valores de Mínima Energía Conformacional como de Momento Dipolar de ambos compuestos comparados, indican que Sarcodictina B pudiera acomodarse mejor en el complejo que forman con las tubulinas (su mecanismo de acción) que lo que pudiera hacer el éster urocánico de 4-deoxyasbestinino B. III Propiedades Farmacofóricas. III Topological Molecular Polar Surface Area (TPSA). Este parámetro calcula la suma de las contribuciones superficiales de los fragmentos polares de una molécula y permite predecir las propiedades de transporte de la molécula a través de la membrana celular, con menores valores de TPSA para un mejor transporte a través de la membrana celular. Comparando los valores de los cembranoides 2,11-ciclizados naturales, se infiere que el orden de mejor transporte a través de la membrana celular es Asbestinino 9 (61.83 A 2 ), Asbestinino 20 y 4-deoxyasbstinino G (64.99 A 2), Briarellina E (85.22 A 2 ) y por último Asbestinino 7 (95.29 A 2 ), lo anterior debido a que a mayor tamaño de la molécula es un poco más difícil su transporte, no obstante que Asbestinino 7 y Briarellina E poseen mayor cantidad de grupos apolares (de mayor capacidad de transporte a través de membranas celulares). Al comparar los valores de TPSA de Sarcodictina B ( A 2 ) con el éster urocánico de 4-deoxyasbestinino G ( A 2 ) y Eleutherobina ( A 2 ), se predice un mejor transporte del derivado éster urocánico incluso mejor que la molécula siendo estudiada en Fase Clínica III en el FDA como medicamento anticáncer.

45 41 III Relación de Solubilidad n-octanol/agua (clogp). Este valor (el logaritmo del coeficiente de partición n-octanol/agua) permite determinar la hidrofilicidad del compuesto. Valores altos de clogp significa bajas hidrofilicidades y pobre absorción y permeación en membranas celulares. Generalmente buenos valores se establecen debajo de 5.0 Los valores para los cembranoides 2,11-ciclizados naturales aislados se encuentran entre y 3.180, todos valores dentro del rango aceptable, con el mejor en Asbestinino 20. Los derivados éster urocánico sintetizados, muestran valores mas altos que sus moléculas predecesoras, con valores entre y 4.178, con los derivados de Briarellina E (5.633) y Asbestinino 7 (5.670) arriba de 5.0. Los valores de clogp de lo derivados éster urocánicos de Asbestinino 20 (4.178) y 4-deoxyasbestinino G (4.958) son aceptables y menores de 5.0. Al comparar el clogp del éster urocánico de 4-deoxyasbestinino G (4.958) y Asbestinino 20 (4.178) con los de Sarcodictina B (4.224) y Eleutherobina (3.055), se observa que todos están por debajo de 5.0 con un buen potencial para los derivados urocánicos sintetizados en esta investigación. Los otros parámetros farmacofóricos calculados (Número de Aceptores, Número de Donadores, Grupos Negativos Ionizables, Grupos Positivos Ionizables, Relación Átomos/Enlaces, Número de Átomos Aromáticos, Número de Anillos y Enlaces Rotables) son comparables a los compuestos que estudia el FDA como medicamentos anticáncer y se utilizan como insumos para el cálculo de TPSA y clogp.

46 42 PARTE IV. IV.1 CNCLUSINES 1. Se sintetizó un derivado 6-glucósido de cembanoide 2,11-ciclizado (6-glucósido de Asbestinino 7). 2. Se sintetizaron cuatro derivados 6-éster urocánico de cembranoides 2,11- ciclizados (6-éster urocánicos de Asbestinino 7, Asbestinino 20, 4- deoxyasbestinino G y Briarellina E). 3. Se determinó la actividad citotóxica contra nauplios de Artemia salina de los cinco cembranoides 2,11-ciclizados sintetizados. 4. Los cuatro cembranoides 2,11-ciclizados ester-urocánico sintetizados, poseen valores de CL 50 a nivel nanomolar contra nauplios de Artemia salina, comparables a Eleutherobina. 5. El cembranoide 2,11-ciclizado 6-glucósido sintetizado, posee un valor de CL 50 a nivel micromolar contra nauplios de Artemia salina, no comparable a Eleutherobina, los cembranoides naturales y derivados 6-ester urocánicos sintetizados. 6. Se aislaron cinco cembranoides 2,11-ciclizados de Briareum asbestinum, cuatro con un grupo hidroxilo sobre C6 de la molécula (Asbestinino 7, Asbestinino 20, 4-deoxyasbestinino G y Briarellina E) y uno con grupo carbonilo en dicha posición (Asbestinino 9). 7. Se determinó la actividad citotóxica contra nauplios de Artemia salina de cuatro cembranoides 2,11-ciclizados naturales aislados. 8. Los cuatro cembranoides 2,11-ciclizados naturales aislados, poseen valores de CL 50 a nivel nanomolar contra nauplios de Artemia salina, comparables a Eleutherobina. 9. Se calculó y graficó la conformación de mínima energía de la molécula de trece cembranoides 2,11-ciclizados; 5 cembranoides 2,11-ciclizados naturales (Asbestininos 7, 9, 20, 4-deoxyasbestinino G y Briarellina E), cuatro cembranoides 2,11-ciclizados 6-éster urocánico (derivados de Asbestininos 7, 20, 4-deoxyasbestinino G y Briarellina E), un derivado de cembranoide 2,11- ciclizado 6-glucósido (Asbestinino 7) y tres cembranoides 2,11-ciclizados tipo sarcodictina (Sarcodictinas A y B y Eleutherobina) para utilizar como modelos de comparación. 10. Se calculó y graficó las propiedades farmacofóricas (TPSA, clogp, Número de Aceptores, Número de Donadores, Grupos Negativos Ionizables, Grupos Positivos Ionizables, Relación Átomos/Enlaces, Número de Átomos Aromáticos, Número de Anillos y Enlaces Rotables) de la molécula de trece cembranoides 2,11-ciclizados; 5 cembranoides 2,11-ciclizados naturales (Asbestininos 7, 9, 20, 4-deoxyasbestinino G y Briarellina E), cuatro cembranoides 2,11-ciclizados 6- éster urocánico (derivados de Asbestininos 7, 20, 4-deoxyasbestinino G y Briarellina E), un derivado de cembranoide 2,11-ciclizado 6-glucósido (Asbestinino 7) y tres cembranoides 2,11-ciclizados tipo sarcodictina (Sarcodictinas A y B y Eleutherobina) para utilizar como modelos de comparación.

47 11. Se realizó extensa revisión bibliográfica sobre lo reportado en cembranoides 2,11- ciclizados, originándose una publicación en la revista Natural Product Research de Taylor & Francis Cóbar,. Survey of 2,11-cyclized cembranoids from Caribbean sources. Natural Product Research. 2009, 23 (1),

48 44 IV.2 RECMENDACINES 1. Sintetizar nuevos Cembranoides 2,11-ciclizados 6-derivados, para optimizar la ruta sintética. 2. Aislar nuevamente cembranoides 2,11-ciclizados de Briareum asbestinum, para continuar con estudios de síntesis orgánica y actividad biológica. 3. Realizar pruebas de actividad citotóxica sobre líneas celulares cancerosas para tener datos de su CL 50 más exactos y comparables con los que se estudian en el FDA de los Estados Unidos de América como medicamentos anticáncer. 4. Efectuar estudios farmacofóricos más profundos sobre los cembranoides 2,11- ciclizados naturales y sintéticos aislados y sintetizados en esta investigación.

49 45 IV.3 REFERENCIAS BIBLIGRÁFICAS Altmann, K-.; Gertsch, J. Anticancer drugs from nature; natural products as a unique source of new microtubule-stabilizing agents. Natural Product Reports, 2007, 24, Amos, L. Microtubule Structure and its Stabilisation. rganic and Biomolecular Chemistry. 2004, 2, Atta, A.; Ankerman, J.; Bayord, A.; Radnika, P. Bioactive Chemical Constituents of Cladiella Species. elvetica Chimica Acta. 2004, 87, Bayer, F. M., The Shallow Water ctocorallia of the West Indian Region. Martinus Nijhoff, The age, 1961, 373p. Bernardelli, P.; Paquette, L.A. Survey of xygenated 2,11 Cyclized Cembranoids of Marine rigin. eterocycles. 1998, 49, Blagg, J. Structure-Activity Relationships for In vitro and In vivo Toxicity. Annual Reports in Medicinal Chemistry, Vol. 41, Elsevier Inc. 2006, Blunt, J.W.; Copp, B.D.; u, W-P.; Munro, M..G.; Northcole, P.T,; Prinsep, M.R. Marine Natural Products. Natural Product Reports. 2007, 24, Boik, J. Natural Compounds in Cancer Therapy. regon Medical Press, LLC. USA. 2001, 251 p. Bowden, B. F.; Coll, J. C.; Vasilescu, I. M. Australian Journal of Chemistry. 1989, 42, Cinel, B.; Roberge, M.; Behrisch,.; van fwegen, L.; Castro, C.; Andersen, R. J. Antimitotic Diterpenes from Erithropodium caribaeorum Test Pharmacophore Models for Microtubule Stabilization. rganic Letters. 2000, 2, Cóbar,. M. The Briarellins, The First Eunicellin-Based Diterpenoids from a Caribbean Marine rganism. Revista Latinoamericana de Química. Suplemento. 2000, 28, Cóbar,.M. New Natural Products from the Caribbean Marine Invertebrates; Briareum asbestinum, Eunicea calyculata and alichondria sp. Ph.D. Dissertation, University of Puerto Rico, Cóbar,.M.; Vásquez, A.A. Síntesis y Actividad Biológica de Calyxaminas y Calyxolanos, dos Nuevas Clases de Productos Naturales Marinos. Resúmenes de Proyectos de Investigación DIGI 2004, Area Técnica y Científico Asistencial. Dirección General de Investigación, Universidad de San Carlos de Guatemala, 2004, Cóbar, S.M.; Cóbar,.M. Aislamiento y Evaluación de la Actividad Biológica de Briarienas A y B, Principales Metabolitos Secundarios del Gorgonio Caribeño briareum asbestinum. Tesis, Facultad de Ciencias Químicas y Farmacia, Universidad de San Carlos de Guatemala Cóbar,.M.; Romero, C.S. Cultivo exsitu de ecteinascidia turbinata (ascideacea: perophoridae) y Extracción de Metabolitos Secundarios con Potencial uso Farmacéutico para el Tratamiento del Cáncer. Propuesta de Investigación, Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología, Línea AGRCYT, Guatemala, Coll, J. C. The Chemistry and Chemical Ecology of ctocorals (Coelenterata, Anthozoa, ctocorallia). Chemical Reviews, 1992, 92,

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52 Wang, G..; Sheu, J..; Chiang, M. Y.; Lee, T. J. Pachyclavurariaenones A-C, Thre Novel Diterpenoids from the Soft Coral Pachyclavularia violacea. Tetrahedron Letters. 2001, 42, Wang, G..; Sheu, J..; Duh, Ch. Y.; Chiang, M. Y. Pachyclavurariaenones D-G, New Diterpenoids from the Soft Coral Pachyclavularia violacea. Journal of Natural Products. 2002, 65, Wilson, R. M.; Danishefsky, S.J. Pattern Recognition in Retrosynthetic Analysis: Snapshots in Total Synthesis. Journal of rganic Chemistry, 2007, 72, Wilson, R. M.; Danishefsky, S.J. Small Molecule Natural Products in the Discovery of Therapeutic Agents: The Synthesis Connection. Journal of rganic Chemistry, 2006, 71, Wright, A. E. Isolation of Marine Natural Products in Methods in Biotechnology. Ed. Canell, R. J. P. umana Press, Inc. 1998,

53 49 IV.4 ANEXS ANEX 1 Extracción, fraccionamiento, separación, purificación de cembranoides 2,11-ciclizados naturales y síntesis de derivados. 1.1 Briareum asbestinum seco y liofilizado. 1.2 Bomba de alto vacío utilizada en el liofilizador 1.3 Maceración de Fracciones. 1.4 Mezclador y homogenizador del extracto crudo.

54 Rotaevaporador 1.6 Fraccionamiento de Extractos 1.7 Colección de fracciones 1.8 Monitoreo de fracciones por TLC

55 Equipo para síntesis orgánica 1.10 Equipo de RMN en Universidad de Puerto Rico

56 ANEX 2. Esquema de Aislamiento de Briareum asbestinum. 52

57 53 ANEX 3 Esquema de Farmacóforos de Cembranoides 2,11-ciclizados naturales. 3.1 Esquema del Farmacóforo de Asbestinino Esquema del Farmacóforo de Asbestinino Esquema del Farmacóforo de 4-deoxyasbestinino G

58 Esquema del Farmacóforo de Asbestinino Esquema del Farmacóforo de Briarellina E

59 55 ANEX 4 Esquema de Farmacóforos de Cembranoides 2,11-ciclizados 6-ester urocánicos. 4.1 Esquema del Farmacóforo del 6-ester urocánico de Asbestinino Esquema del Farmacóforo del 6-ester urocánico de 4-deoxyasbestinino G 4.3 Esquema del Farmacóforo del 6-ester urocánico de Asbestinino 7

60 4.4 Esquema del Farmacóforo del 6-ester urocánico de Briarellina E 56

61 57 ANEX 5 Esquema de Farmacóforos de Cembranoides 2,11-cicizados 6-glucosidados 5.1 Esquema del Farmacóforo de Asbestinino 7 6-glucosidado

62 58 ANEX 6 Esquema de Farmacóforos de Cembranoides 2,11-ciclizados utilizados como comparación. 6.1 Esquema del Farmacóforo de Sarcodictina A 6.2 esquema del Farmacóforo de Sarcodictina B

63 Esquema del Farmacóforo de Eleutherobina Clave Esferas rojas y verdes: Zonas de influencia de grupos polares como Nitrógeno y xígeno que poseen pares de electrones no compartidos que pueden donar. Se diferencian en la profundidad de ubicación. Esferas amarillas: Zonas de influencia de grupos apolares (lipofílicos) Esferas cafés: Zonas de influencia de grupos lipofílicos en sitios de mayor profundidad de ubicación.