GENOTIPADO 1. MICROSATÉLITES

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1 GENOTIPADO 1. MICROSATÉLITES El uso de marcadores moleculares para la identificación de genotipos de interés mediante microsatélites es susceptible de ser analizadas a través de la instrumentación existente en la Unidad de Genómica. El servicio se encarga de la etapa final de esta técnica la cual consiste en la cuantificación del tamaño de los fragmentos de DNA proporcionados por el usuario y generados en el desarrollo de la técnica mencionada. Dicha cuantificación se realiza en relación a estándares internos que se añaden a las muestras cuando se analizan mediante electroforesis capilar. Se pueden utilizar hasta 5 marcadores fluorescentes simultáneamente (uno de ellos reservado para el marcador de tamaños moleculares) y combinar diferentes tamaños alélicos en la misma muestra por lo que por cada capilar en una misma electroforesis se pueden analizar multitud de fragmentos. La electroforesis se lleva realiza en el equipo ABI 3130XL. 1.1 Fluorocromos Una de las principales ventajas de esta metodología es la detección multicolor. A continuación, se detallan algunos aspectos de utilidad a la hora de elegir un fluorocromo u otro para marcar las parejas de primers de interés. Detección multicolor. Intensidad relativa de los fluorocromos más utilizados. Dyes Max A (nm) Max E (nm) Intensidad Rel 5-FAM FAM JOE VIC HEX NED TAMRA/TAMRA PET ROX LIZ Propiedades óptimas de los fluorocromos a. Deben tener Amax lo más diferente posible para: - Facilitar la generación de las matrices/calibración espectral b. Deben ser lo más brillante posible: - Aumentará la sensibilidad del ensayo - Regla general: Azul>Verde >Amarillo > Rojo c. Deben ser lo más estable posible - VIC es más estable que el HEX d. Su síntesis debe ser lo más fácil posible - JOE y 5-FAM son los más complicados para sintetizar - 1 -

2 1.2. Programas ¾ Si el usuario no dispone de los softwares de análisis específicos (GeneScan, Genotyper o GeneMapper), existe en la Unidad un ordenador con dichos programas y a disposición del usuario que lo solicite. Además, existen algunos visores que permiten la lectura de los datos y que se puede descargar gratuitamente en las siguientes direcciones: - Peak Scanner TM Software v1.0: software_community/free_ab_software.cfm - Genescan View 2. SNPs El análisis de polimorfismos de una sóla base (SNPs) se puede realizar mediante diversas técnicas. Según los equipos existentes en la Unidad, las posibilidades son las siguientes: 1) Análisis de SNPs mediante los kits SNaPshot (SBE/Minisecuenciación) y SNPlex de Applied Biosystems (ABI 3130xl). 2) Discriminación alélica mediante Sondas Taqman (Real-Time PCR 7500Fast de Life Technologies). 3) Screening a gran escala mediante D-HPLC (Varian) que permite detectar cualquier variación en la secuencia de DNA (SNPs, deleciones, inserciones, etc ). Las dos primeras son factibles de utilizar siempre que el SNP sea conocido. Por el contrario, la principal ventaja de la técnica de D-HPLC es que no requiere conocimiento previo de la región a estudiar. Para detectar los genotipos se puede emplear las dos primeras, la tercera solo permite detectar homocigoto/heterocigoto Primer Extension Analysis: SNaPshot kits, ddntp* = Minisecuenciación = Single Base Extensión (SBE) Se basa en el uso de cebadores específicos (sin marcar) adyacentes a la base a determinar. Primer Molde SNP Figura 1. Diseño de Primer para SNaPshot

3 Se realiza una reacción de PCR sólo con los 4 didesoxinucleótidos marcados cada uno con un fluorocromo diferente sobre el molde de DNA previamente amplificado y purificado (pueden ser uno o varios los moldes a analizar en una sola reacción de SNaPshot) Terminadores (dideoxi), cada uno marcado con un fluorocromo diferente (más la polimerasa, buffer, etc ) Molde DNAamplificadopurificado Primer AmpliTaq FS Figura 2. Reacción de Primer Extensión (Kit SNaPshot). La detección de la base incorporada revela la presencia/ausencia de polimorfismo y el genotipo. Color=Genotipo Diseño del ensayo Figura 3. Electroforesis y Análisis de Reacción de SNaPshot. El primer debe ser diseñado para que termine justo en el 5 del SNP, es decir, justo antes de la base a determinar. Tm > 50ºC (la reacción es más eficiente). Puede ser diseñado tanto en la cadena forward (directa) como en la reverse (reversa). Se recomienda chequear la secuencia en la web para ver en que dirección es más accesible el primer al SNP. Se debe chequear el primer para evitar la formación de dimeros, hairpins, etc La longitud debe estar entre nucleótidos y ser purificados mediante HPLC (sobre todo aquellos > 30 nt). PCR y Análisis: Simple o Múltiple? Tm PCR RUN POSICIONES A Distinta Simple Simple 1 B Distinta Simple Múltiple 2-10* C Igual Múltiple Múltiple 2-10* * Primers de diferente longitud - 3 -

4 Hay dos tipos de multiplex o En base al tamaño del primer o En base al color del polimorfismo (solo cuando no sean coincidentes los genotipos a distinguir) Para realizar multiplex con primers que tengan igual Tm, estos se diseñan con el mismo nº de nucleótidos y la diferencia de longitud se consigue mediante la adicción de colas inespecíficas poliat en 5. Se recomienda que los primers difieran entre si de 4 a 6 nucleótidos (Fig. 4). nnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnn A B C D (AT)4 A 24nts (AT)12 C 32nts (AT)8 B 28nts (AT)16 D 36nts Electroforesis Cola inespecífica No afecta: Hibridación Condiciones de PCR Afecta: 33 Movilidad Tamaño Locus? Color Alelo? Figura 4. Ejemplo de búsqueda de 4 SNPs en una mismo producto de PCR Para los fragmentos muy pequeños (primers menores de 36 nt) es complicado predecir la movilidad por lo que es recomendable probarlos previamente por separado antes de analizarlos junto con otros. Existe para ello el SNaPshot Primer Focus kit de Applied Biosystem. Lo que se hace es añadir las 4 posibles bases a los primers a evaluar, lanzar una carrera con ellos y ver si se solapan entre ellos. 3. GENOTIPADO A GRAN ESCALA La Unidad de Genómica cuenta con la plataforma OpenArray que permite llevar a cabo hasta 3,072 PCRs individuales en una única placa de acero inoxidable. El sistema óptico combina 6 filtros de excitación ( nm) y 6 filtros de emisión ( nm) que permiten trabajar con hasta 21 combinaciones de longitudes de onda en una sola carrera para reacciones en multiplex. Dicha plataforma se basa en la tecnología de las sondas TAqMan. El equipo disponible en la Unidad es el Quant Studio 12K Flex (Life Technologies)

5 El flujo de trabajo es el siguiente: Reunión previa con el usuario para diseñar el experimento (nº SNPs, nº muestras, ) Preparar las placas de 384 pocillos en el caso de que el usuario no traiga las muestras en el formato adecuado. Preparar la placa de genotipado TaqMan OpenArray con la ayuda del equipo Acuffil. Realizar la PCR en el equipo Quant Studio 12K Flex y obtener las imágenes de las amplificaciones Analizar los datos de las carreras, con el programa AutoCaller Software 4. INFORMACIÓN ADICIONAL El Servicio pone a disposición de los usuarios la asesoría científica-técnica necesaria para ser usuarios de este Servicio así como para la optimización de cualquier técnica compatible con la instrumentación científica disponible en la Unidad de Genómica. En caso de dudas sobre cualquier punto, pueden ponerse en contacto con la Unidad a través de nuestro teléfono o o genomica@uco.es - 5 -