Algoritmo para el diagnóstico bioquímico de la hiperglicinemia no cetósica en Cuba. Biochemical diagnosis of non-ketotic hyperglycinemia in Cuba.

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1 Rev Cubana Genet Comunit. 2016;10(1):20-25 Algoritmo para el diagnóstico bioquímico de la hiperglicinemia no cetósica en Cuba. Biochemical diagnosis of non-ketotic hyperglycinemia in Cuba. Jiovanna Contreras Roura, I Ivette Camayd Viera, II Lien Nogueras Rodríguez, III Aurelio David Padrón Díaz, IV Laritza Martínez Rey, V Lixandra Teixidor Llopiz. VI Resumen La hipergilicinemia no cetósica es un error innato del metabolismo originado por un déficit en la actividad del sistema de clivaje de la glicina. Se caracteriza por acumulación de glicina en tejidos, sangre, líquido cefalorraquídeo y orina. Los síntomas clínicos característicos son convulsiones y daño al sistema nervioso central. Existen tres variantes: la clásica, las atípicas y la transitoria. El diagnóstico bioquímico consiste en la cuantificación de glicina en plasma y líquido cefalorraquídeo, así como el análisis simultáneo de ácidos orgánicos en orina. En los casos positivos se realiza el estudio molecular y/o diagnóstico enzimático. Este trabajo se desarrolló con los objetivos de implementar un protocolo para el diagnóstico bioquímico de la hiperglicinemia no cetósica en Cuba y describir los hallazgos clínicos y bioquímicos en los pacientes con sospecha clínica de la enfermedad. Se realizó un estudio descriptivo, transversal en 139 pacientes con sospecha clínica de un EIM de los aminoácidos en el En los pacientes con resultados positivos de una hiperglicinuria y perfil normal de ácidos orgánicos se cuantificó glicina en suero y líquido cefalorraquídeo por HPLC. Dos pacientes, con cuadros convulsivos refractarios al tratamiento, presentaron niveles elevados de glicina en orina y suero, con un perfil normal de ácidos orgánicos en orina. En ambos pacientes la relación de glicina líquido cefalorraquídeo/suero fue positiva. Debido al cuadro clínico y la edad de aparición de los síntomas se diagnostica una hiperglicinemia no cetósica neonatal clásica y una variante infantil. Palabras clave: GC-MS, glicina, hiperglicinemia, HPLC, hiperglicinemia no cetósica, encefalopatía por glicina. Abstract Non-ketotic hyperglycinemia is an inborn error of glycine metabolism, due to a deficit in the glycine cleavage system. The accumulation of abnormally large quantities of glycine in tissues, blood, cerebrospinal fluid and urine is a distinctive feature of this disorder. Main clinical symptoms are seizures and the central nervous system damage. There are three variants: the classic form, the atypical variants and the transitory form. Biochemical diagnosis consists of plasma and CSF glycine quantification; simultaneous urine organic acid analysis should also be performed. The aims of this article are to implement a protocol for the biochemical diagnosis of Non-ketotik hyperglycinemia in Cuba and to describe clinical and biochemical findings from two patients with a suspicion of this diseased. A cross-sectional study was performed in 139 patients under clinical suspicion of IEM amino acids in Glycine was quantified by HPLC in blood and CFS in those patients who showed hyperglicinemia and a normal organic acids profile. Two patients with treatment refractory seizures showed high glycine levels in urine and serum and normal organic acid profiles. In both of them, the glycine CFS/plasma ratio was positive. Considering the clinical symptoms and the age of symptoms onset, a neonatal classic non-ketotik hyperglycinemia and an infantile variant were diagnosed. Keywords: GC-MS, glycine, hiperglycinemia, HPLC, non-ketotik hyperglycinemia, glycine encephalopathy. I Lic. en Ciencias Farmacéuticas, Investigador Auxiliar, Master en Farmacología experimental, Departamento de Genética Bioquímica, Centro Nacional de Genética Médica, La Habana, Cuba. II III Lic. en Bioquímica, Master en Bioinformática, Investigador agregado. Departamento de Genética Bioquímica, Centro Nacional de Genética Médica. La Habana, Cuba. Técnico de laboratorio, Departamento de Genética Bioquímica, Centro Nacional de Genética Médica. La Habana, Cuba. 20

2 Algoritmo para el diagnóstico bioquímico de la hiperglicinemia no cetósica en Cuba. Introducción La encefalopatía por glicina (GCE, MIM ), 1 o hiperglicinemia no cetósica (NKH) es un error innato del metabolismo (EIM), que se produce por un déficit en la actividad del complejo enzimático mitocondrial de clivaje de este aminoácido de la glicina. 2 La NKH se caracteriza por una acumulación de glicina en todos los tejidos, incluyendo el cerebro, y aumento en la excreción en orina, sangre y líquido cefalorraquídeo. A nivel molecular, los genes implicados en la aparición de los síntomas son GLDC, AMT y GCSH. 1 Los síntomas se deben a la acción de la glicina sobre los receptores glutaminérgicos de N-metil-D-aspartato (NMDA), lo cual favorece las convulsiones y el daño al sistema nervioso central (SNC), particularmente en el recién nacido. 3 La forma clásica es la más frecuente y los enfermos son asintomáticos al nacer, aunque ya presentan agenesia del cuerpo calloso y malformación de giros, y debutan en los primeros días de vida. En la mayoría de los casos, después de un intervalo asintomático de 48 horas como máximo presentan hipotonía, disminución del reflejo moro, convulsiones, apneas, letargia y coma. La mayoría fallece en las primeras semanas de vida y los que sobreviven quedan con grave retardo del desarrollo psicomotor. El electroencefalograma (EEG) muestra un trazado característico de estallido supresión, 4 pero cambia al mes de vida a hipsarritmia. Las convulsiones son mioclónicas o de tipo gran mal. 5, 6 La hipotonía es muy importante durante el primer mes de vida, pero luego cambia a espasticidad. En la forma de presentación tardía, durante el período neonatal el niño tiene un desarrollo normal y la sintomatología neurológica no específica aparece de forma variable a partir del primer año de vida y hasta la adolescencia. 7 Los síntomas clínicos de las variantes atípicas son menos homogéneos, en contraste con la severidad de los síntomas neurológicos de la variante clásica. Se describen tres variantes atípicas: neonatal, infantil y de aparición tardía. La presentación de la forma neonatal es similar a la clásica, pero la evolución clínica es mejor. En las variantes infantil y tardía predomina el retraso mental y trastorno del comportamiento, aunque el fenotipo en la tardía es más heterogéneo. En todas las variantes se afecta el mismo complejo enzimático, excepto en la forma tardía donde se desconoce la causa. 8 Además, se ha descrito una forma transitoria con características clínicas similares a la neonatal clásica, donde los niveles de glicina son elevados al nacer pero se normalizan entre la segunda y la octava semana de vida. 1,8 Todas las variantes descritas de NKH tienen un patrón de herencia autosómico recesivo. 1,9 Se estima que la enfermedad tiene una incidencia de 1 en 55,000 recién nacidos; 1 en Europa se estima una prevalencia de 1-9/ Algunas poblaciones tienen frecuencias superiores como el norte de Finlandia (1:12000). 1 En algunas poblaciones árabes y en Israel también se han descrito incidencias elevadas. 11 A diferencia de otras enfermedades metabólicas que cursan con hiperglicinemia, como la acidemia propiónica, en la NKH no hay cetoacidosis y glicina constituye el único marcador bioquímico en plasma, orina y líquido cefalorraquídeo (LCR). 3 Por tanto, un primer paso en el diagnóstico bioquímico de la NKH consiste en la cuantificación de glicina en plasma o suero y LCR, así como el análisis simultáneo de ácidos orgánicos en orina. Algunos autores plantean que en una variante clásica neonatal de NKH la relación de concentraciones de glicina en LCR/plasma es de superior a 0,08, mientras que en las variantes atípicas esta relación se encuentra entre 0,04 y 0,02; 3, 7 sin embargo, otros autores no han encontrado relación entre la severidad de los síntomas, el pronóstico y la relación de glicina en LCR y en plasma. 12 En los casos positivos, por lo general se realiza el estudio molecular de los genes GLDC, AMT, y GCSH. La estrategia más común consiste en realizar pruebas concurrentes en los tres genes; cuando no se detectan mutaciones por secuenciación tradicional, se buscan deleciones intragénicas, dada la elevada frecuencia de deleciones exónicas en el gen GLDC. 3 La confirmación enzimática debe realizarse en biopsia hepática; en el caso de las variantes transitorias, Jackson y colaboradores consideran que solo con una segunda biopsia hepática positiva puede confirmarse el diagnóstico. 13 También se puede realizar en cultivos IV Técnico de laboratorio, Departamento de Genética Bioquímica, Centro Nacional de Genética Médica. La Habana, Cuba. V Especialista de primer grado en Genética Clínica, Profesor asistente. Departamento de Genética Bioquímica, Centro Nacional de Genética Médica. La Habana, Cuba. VI Ing. Química Industrial. Departamento de Genética Bioquímica, Centro Nacional de Genética Médica. La Habana, Cuba. Revista Cubana de Genética Comunitaria 21

3 Jiovanna Contreras Roura. de linfocitos sometidos a infección por virus de Epstein-Barr, que inducen la actividad del complejo de clivaje de la glicina en esas células. 7 Otro ensayo consiste en una prueba de aliento con glicina 13 C, donde se evalúa el CO 2 exhalado. 14 El tratamiento consiste en restricción proteica moderada en combinación con benzoato de sodio, para reducir los niveles plasmáticos de glicina y en consecuencia la frecuencia de las convulsiones También se pueden administrar antagonistas del receptor NMDA, si el tratamiento es insuficiente para controlar las convulsiones. 18 La corrección bioquímica y la reducción en la frecuencia de las convulsiones no evitan el retraso psicomotor severo ni la tetraplejia espástica. La respiración espontánea y la reducción de la apnea, que ocurre generalmente dos o tres semanas después del tratamiento, no debe interpretarse como una buena respuesta al tratamiento o como señal de un buen pronóstico. 19 El tratamiento con valproato está contraindicado, pues eleva los niveles de glicina en sangre y LCR En Cuba no existe una estrategia a nivel de laboratorio para descartar la NKH. Dados los síntomas y formas de presentación de esta enfermedad, suele sugerirse una aminoacidemia o una aciduria orgánica en los pacientes afectados. 23 Por tanto, la posibilidad de una NKH debe descartarse en aquellos casos con hipotonía, encefalopatía y convulsiones; donde las pruebas de laboratorio especializadas no hayan demostrado la presencia de un EIM. En el siguiente trabajo se describen los hallazgos clínicos y bioquímicos obtenidos en dos pacientes con sospecha clínica de un error innato del metabolismo de los aminoácidos y se propone una metodología para el diagnóstico bioquímico. El objetivo de trabajo consistió implementar un protocolo para el diagnóstico bioquímico de la NKH en Cuba y describir los hallazgos clínicos y bioquímicos en los pacientes con sospecha clínica de NKH. Métodos Pacientes Se realizó un estudio descriptivo, transversal en muestras biológicas de 139 pacientes de ambos sexos (71 varones y 68 hembras), de edades pediátricas ( 1 año, n= 41) remitidos de las consultas de genética clínica de todo el país durante el Los pacientes estudiados tenían sospecha clínica de padecer una aciduría orgánica o una aminoacidemia (datos obtenidos de las historias clínicas o modelos de indicación de estudio metabólico). Se excluyeron los casos que referían sepsis, isquemia y hemorragias. El estudio fue aprobado por el comité de ética de investigación del Centro Nacional de Genética Médica. Muestras Para el análisis de ácidos orgánicos y de aminoácidos en orina se solicitó la primera micción de la mañana (3 ml). Para la obtención de suero se procesaron 2 ml de sangre, obtenida por venopunción en ayunas. El LCR (1 ml) se extrajo por punción lumbar. En todos los casos se solicitó el consentimiento informado a los tutores legales de los pacientes. Métodos Se analizó el perfil de aminoácidos en suero y orina por cromatografía en placa delgada (TLC), así como el perfil de ácidos orgánicos en orina por cromatografía gaseosa acoplada a espectrometría de masas (GC-MS) de los pacientes con sospecha de padecer una aciduria orgánica o aminoacidemia. En aquellos casos donde se observó una excreción marcada de glicina, con un perfil negativo de ácidos orgánicos y una historia clínica de convulsiones con respuesta desfavorable al tratamiento y alteraciones en el electroencefalograma, se solicitó de forma simultánea muestras de LCR y suero para la cuantificación de glicina en ambos fluidos por HPLC. El diagnóstico bioquímico de la NKH se realizó mediante el cálculo de la relación de los niveles de glicina en LCR/suero. Resultados El protocolo empleado en el laboratorio permitió realizar el diagnóstico bioquímico de hiperglicinemia en dos pacientes (1,44%) (Figura 1). Ambos presentaron niveles elevados de glicina en la TLC de aminoácidos en orina y suero, y refirieron un cuadro convulsivo refractario al tratamiento sugestivo de una NKH. El análisis de las muestras de LCR por TLC para aminoácidos evidenció un aumento de los niveles de glicina en un paciente. En ambos pacientes el perfil de ácidos orgánicos en orina fue negativo, mientras que la relación de glicina LCR/suero fue positiva (normal: < 0,08). 22

4 Algoritmo para el diagnóstico bioquímico de la hiperglicinemia no cetósica en Cuba. Figura 1. Protocolo para el diagnóstico bioquímico de la Hiperglicinemia no cetósica. TLC: cromatografía en placa delgada; HPLC: cromatografía líquida de alta resolución. GC-MS: Cromatografía de gases acoplado espectrometría de masa. LCR: líquido cefalorraquídeo; PL: plasma; O: orina, S: suero. El primer paciente, de sexo femenino, debutó a los 28 días de nacido, con un cuadro neurológico; hipotonía, letargia, apnea, convulsiones tipo mioclonías sospechándose de un síndrome de West, el cual se confirma por la historia clínica y un electroencefalograma con patrón de estallido-supresión en las primeras semanas e hipsarritnia típica a partir del mes de nacido. Al inicio se indicó tratamiento con valproato y gabapentina (vigabratina 60 mg/kg/ día), pero no se logró mejoría. Posteriormente, se inicia tratamiento con corticotrofina y topiramato, lográndose resolver los episodios convulsivos. Presentó excreción marcada de glicina en orina y ligero en suero, pero no se detectó aumento de glicina en LCR por TLC. La cuantificación de glicina por HPLC mostró niveles de glicina en LCR de 109 um, suero 351 um y una relación LCR/suero de 0,3 (normal: < 0,08). Al mes se recibieron muestras de la paciente obteniéndose niveles de glicina en suero de 366 um, en LCR de 130 um y una relación de 0,4. El segundo paciente, debutó con manifestaciones clínicas sugerentes de un EIM al año de edad. Los principales síntomas consistieron en un cuadro de epilepsia generalizada de difícil control, retraso mental, retraso motor y electroencefalograma patológico. El paciente se trató con valproato de sodio (750 mg/día) y clobazán (25 mg/día). Se detectaron niveles elevados de glicina en orina, suero y LCR en la TLC. La cuantificación de glicina por HPLC mostró niveles en LCR de 102 um, suero 88 um y una relación LCR/suero de 1,2. Debido a los resultados obtenidos en las pruebas de laboratorio, al cuadro clínico y la edad de aparición de la enfermedad se diagnostica una hiperglicinemia no cetósica del tipo infantil, o asociada a terapia con valproato de sodio. Se solicitó otra muestra de suero y LCR del paciente sin tratamiento con valproato; observándose una reducción en los niveles de glicina en LCR (38 um) y suero (112 um) pero mantuvo resultado positivo, aunque en menor valor, para la relación de glicina en LCR/suero (0,3). Discusión El diagnóstico de la NKH en Cuba se realiza en pacientes sintomáticos, pues no existe un programa de pesquisa neonatal para identificar esta enfermedad en Cuba. Ante la sospecha de una enfermedad de este tipo, se indica un perfil de aminoácidos en suero y orina por TLC y un perfil de ácidos orgánicos en orina por GC-MS. Esta metodología per se no permite el diagnóstico de la NKH. 14,24,25 Por otro lado, la cuantificación de glicina en LCR debe sugerirse en casos donde se detecten niveles aumentados de glicina en orina y sangre, una vez que se haya comprobado Revista Cubana de Genética Comunitaria 23

5 Jiovanna Contreras Roura. que el perfil de ácidos orgánicos es negativo, pues las acidurias orgánicas generalmente cursan con hiperglicinuria, atribuible a la supresión secundaria del sistema hepático de clivaje de glicina, por la acumulación de subproductos de los aminoácidos ramificados. 25 En ambos casos, la relación de glicina en LCR/suero se mantuvo por encima de 0,08, lo que coincide con lo que describen muchos autores para apoyar el diagnóstico de la NKH 26. En el segundo paciente, fue necesario repetir el estudio en suero y LCR debido a la terapia con valproato, que aumenta los niveles de glicina. 25 La supresión de este medicamento disminuyó la relación de glicina con respecto al valor inicial, pero no logró normalizarla. A partir de los resultados obtenidos en el laboratorio, el cuadro clínico y la edad de aparición de los síntomas, se diagnosticó una NKH en ambos pacientes. Según la edad de aparición de los síntomas, en el primer paciente se consideró una NKH neonatal clásica y una NKH del tipo infantil en el segundo. La determinación de la relación LCR/suero permitirá diagnosticar la variante clásica y la mayoría de las variantes atípicas de NKH, 1,7,9,27 si bien existen algunos casos descritos donde los estudios enzimáticos sugieren esta enfermedad sin que se vean afectadas las concentraciones de glicina en plasma y LCR, o su relación. 13 Para su aplicación, es necesario excluir los casos que refieren sepsis, isquemia y hemorragias, pues estas condiciones deben descartarse antes de indicar estudios de laboratorio para el diagnóstico de un error innato del metabolismo intermediario. 23 Asimismo, una extracción traumática de LCR, pueden incrementar los niveles de glicina por contaminación con sangre. 25 Otros aspectos que se deben descartar son la asfixia perinatal, 28 las infecciones congénitas y la medicación materna, en particular el valproato de sodio. 29 Conclusiones Los resultados obtenidos apoyan la posibilidad de que un grupo de pacientes en los que se sospecha una enfermedad del metabolismo intermediario, por un cuadro convulsivo refractario al tratamiento, presenta una NKH que se puede diagnosticar bioquímicamente por la relación de glicina en LCR/suero. Por tanto, se propone incluir la cuantificación de glicina en LCR y suero en pacientes con un cuadro clínico sugerente o característico de una NKH, donde no existan factores que aumenten la glicina en LCR; y se haya evidenciado un aumento de glicina en orina y suero. No obstante, se recomienda implementar alternativas para confirmar el diagnóstico de NKH en los pacientes con resultados positivos o en aquellos que pueden tener una variante atípica de la enfermedad con una relación glicina LCR/suero normal. Agradecimientos A todo el personal médico involucrado en la atención de los dos pacientes diagnosticados: Dr. Guillermo Montalvan Gonzalez, Dr. Marino Hereira Tarifa, Dr. Ricardo Busto Aguiar, Dra. Dayris Falcón, Dr. Iván Hernández García y la Dra. Norma de León Ojeda. Referencias bibliográficas 1. Online Mendelian Inheritance in Man, OMIM. MIM Number: Johns Hopkins University, Baltimore, MD; consultado el 24 de marzo de Disponible en: 2. Beyoglu D, Idle JR. The glycine deportation system and its pharmacological consequences. Pharmacology & therapeutics. 2012;135(2): Van Hove J, Coughlin C, Scharer G. Glycine Encephalopathy. En: Pagon RA, Adam MP, Ardinger HH, Bird TD, Dolan CR, Fong CT, et al., editores. GeneReviews(R). Seattle (WA): University of Washington, Seattle; Knaepper-Martin S, Boix H. Electroencefalograma de amplitud integrada en la hiperglicinemia no cetosica. Revista de neurologia. 2014;58(1): Dulac O. Epileptic encephalopathy with suppression-bursts and nonketotic hyperglycinemia. Handbook of clinical neurology. 2013;113: Bahi-Buisson N, Dulac O. Epilepsy in inborn errors of metabolism. Handbook of clinical neurology. 2013;111: Hamosh A, Johnston MV. Nonketotic hyperglycinemia. En: Scriver CR, Beaudet AL, Sly WS, Valle D, editores. The Metabolic and Molecular Bases of Inherited Disease. 8va edición ed: New York: McGraw-Hill p Dinopoulos A, Matsubara Y, Kure S. Atypical variants of nonketotic hyperglycinemia. Molecular genetics and metabolism. 2005;86(1-2): Verissimo C, Garcia P, Simoes M, Robalo C, Henriques R, Diogo L, et al. Nonketotic hyperglycinemia: a cause of encephalopathy in children. Journal of child neurology. 2013;28(2): Kure S. Glycine encephalopathy. Orphanet enciclopedia; última actualización: septiembre de 2012; consultado el 13 de abril de Disponible en: 24

6 Algoritmo para el diagnóstico bioquímico de la hiperglicinemia no cetósica en Cuba. 11. Boneh A, Korman SH, Sato K, Kanno J, Matsubara Y, Lerer I, et al. A single nucleotide substitution that abolishes the initiator methionine codon of the GLDC gene is prevalent among patients with glycine encephalopathy in Jerusalem. Journal of human genetics. 2005;50(5): Hennermann JB, Berger JM, Grieben U, Scharer G, Van Hove JL. Prediction of long-term outcome in glycine encephalopathy: a clinical survey. Journal of inherited metabolic disease. 2012;35(2): Jackson AH, Applegarth DA, Toone JR, Kure S, Levy HL. Atypical nonketotic hyperglycinemia with normal cerebrospinal fluid to plasma glycine ratio. Journal of child neurology. 1999;14(7): Kure S. Two novel laboratory tests facilitating diagnosis of glycine encephalopathy (nonketotic hyperglycinemia). Brain & development. 2011;33(9): Boneh A, Allan S, Mendelson D, Spriggs M, Gillam LH, Korman SH. Clinical, ethical and legal considerations in the treatment of newborns with non-ketotic hyperglycinaemia. Molecular genetics and metabolism. 2008;94(2): Suzuki Y, Kure S, Oota M, Hino H, Fukuda M. Nonketotic hyperglycinemia: proposal of a diagnostic and treatment strategy. Pediatric neurology. 2010;43(3): Van Hove JL, Vande Kerckhove K, Hennermann JB, Mahieu V, Declercq P, Mertens S, et al. Benzoate treatment and the glycine index in nonketotic hyperglycinaemia. Journal of inherited metabolic disease. 2005;28(5): Korman SH, Wexler ID, Gutman A, Rolland MO, Kanno J, Kure S. Treatment from birth of nonketotic hyperglycinemia due to a novel GLDC mutation. Annals of neurology. 2006;59(2): Applegarth DA, Toone JR. Glycine encephalopathy (nonketotic hyperglycinemia): comments and speculations. American journal of medical genetics Part A. 2006;140(2): Dhamija R, Gavrilova RH, Wirrell EC. Valproate-induced worsening of seizures: clue to underlying diagnosis. Journal of child neurology. 2011;26(10): Morrison PF, Sankar R, Shields WD. Valproate-induced chorea and encephalopathy in atypical nonketotic hyperglycinemia. Pediatric neurology. 2006;35(5): Tsuyusaki Y, Shimbo H, Wada T, Iai M, Tsuji M, Yamashita S, et al. Paradoxical increase in seizure frequency with valproate in nonketotic hyperglycinemia. Brain & development. 2012;34(1): Saudubray JM, Nassogne MC, de Lonlay P, Touati G. Clinical approach to inherited metabolic disorders in neonates: an overview. Seminars in neonatology : SN. 2002;7(1): Knupp K, Wirrell E. Progressive myoclonic epilepsies: it takes a village to make a diagnosis. Neurology. 2014;82(5): Korman SH, Gutman A. Pitfalls in the diagnosis of glycine encephalopathy (non-ketotic hyperglycinemia). Developmental medicine and child neurology. 2002;44(10): Kure S, Kato K, Dinopoulos A, Gail C, DeGrauw TJ, Christodoulou J, et al. Comprehensive mutation analysis of GLDC, AMT, and GCSH in nonketotic hyperglycinemia. Human mutation. 2006;27(4): Kazmierczuk-Skubis ME, Zatorska-Karpus M, Pac-Kozuchowska E, Bojko-Jaworska J, Furmaga-Jablonska W. Nonketotic hyperglycinemia as the cause of infant seizures--the case study. Annales Universitatis Mariae Curie-Sklodowska Sectio D: Medicina. 2004;59(1): Roldan A, Figueras-Aloy J, Deulofeu R, Jimenez R. Glycine and other neurotransmitter amino acids in cerebrospinal fluid in perinatal asphyxia and neonatal hypoxic-ischaemic encephalopathy. Acta paediatrica. 1999;88(10): Lang TF, Parr JR, Matthews EE, Gray RG, Bonham JR, Kay JD. Practical difficulties in the diagnosis of transient nonketotic hyperglycinaemia. Developmental medicine and child neurology. 2008;50(2): Revista Cubana de Genética Comunitaria 25