(ESPECTROFOTOMETRÍA UV-VIS) PROF. MARLENE MORA 2013
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- Gonzalo Maidana Rivas
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1 (ESPECTROFOTOMETRÍA UV-VIS) PROF. MARLENE MORA 2013 MM 2013
2 LONGITUD DE ONDA La distancia entre dos picos (o dos valles) de una onda se llama longitud de onda (λ = lambda). λ MM 2013
3 Las longitudes de onda mas largas que las del rojo se les conoce como infrarrojas y las mas cortas que el violeta, ultravioletas. Ultravioleta Luz visible Infrarrojo ~ UV Violeta Azul Verde Amarillo Naranja Rojo IR 4000 A Espectro Visible 7500 A MM 2013
4 Cuanto más larga la longitud de onda de la luz visible tanto más rojo el color. Asimismo las longitudes de onda corta están en la zona violeta del espectro.
5 La luz blanca está compuesta de ondas de diversas frecuencias. Cuando un rayo de luz blanca pasa por un prisma se separa en sus componentes de acuerdo a la longitud de onda
6 Cómo se puede medir la radiación que emiten o absorben los cuerpos?. Un aparato capaz de obtener el espectro de una radiación, es decir, de separar la radiación en sus componentes, se llama un espectroscopio. Si el aparato es capaz de fotografiarla se llama un espectrógrafo, y Si es capaz de medirla diremos que se trata de un espectrómetro. Cuando es capaz de medir también la intensidad de la radiación, se llama espectrofotómetro.
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9 COMPONENTES DE LOS INSTRUMENTOS ESPECTROSCÓPICOS Los instrumentos usados para estudiar la absorción o la emisión de la radiación electromagnética en función de la λ son conocidos como ESPECTROFOTÓMETROS y constan de 5 elementos básicos : 1. Fuente estable de energía radiante. 2. Dispositivo que aísle una determinada región del espectro. 3. Recipiente transparente a la radiación para contener la muestra. 4. Detector de radiación que convierte a la energía radiante en una señal de medida. 5. Indicador de señal : sistema de procesamiento y lectura de la señal
10 ESPECTROFOTOMETRO
11 1º Fuente de luz La misma ilumina la muestra. Debe cumplir con las condiciones de estabilidad, direccionabilidad, distribución de energía espectral continua y larga vida. Las fuentes empleadas son lámpara de tungsteno y lámpara de arco de xenón.
12 FUENTES DE RADIACIÓN Y DETECTORES En la Figura se resumen los diferentes sistemas de detección de la señal así como las fuentes usadas en función de la λ (región espectral).
13 CONTINUAS 1.- FUENTES DE RADIACIÓN UV Visible/IR Arco de Xenón Lámpara de Deuterio Lámpara de Wolframio
14 1.- FUENTES DE RADIACIÓN Su misión es la generación de un haz de radiación con suficiente potencia de salida y estabilidad para que se detecte y se mida con facilidad. Pueden ser CONTINUAS, que emiten radiación que varia su intensidad en un amplio Δλ y DISCONTINUAS O DE LÍNEAS, que emiten un número limitado de líneas o bandas de radiación, cada una de las cuales abarca un limitado Δλ. CONTINUAS DE LINEAS FUENTES USADAS EN ESPECTROSCOPÍA FUENTE Δλ (nm) TIPO DE ESPECTROSCOPIA Lámpara de Xenón Fluorescencia molecular y Raman Lámpara de Hidrogeno/Deuterio Absorción molecular (UV) Lámpara de Wolframio Absorción molecular (Visible/IR cercano) Lámpara de Absorción molecular (UV/Visible/IR Wolframio/Halógeno cercano) Lámpara de Nicrom Absorción molecular (IR) Lámpara de Nernst Absorción molecular (IR) Fuente Globar Absorción molecular (IR) Lámpara de Cátodo hueco UV-Visible Absorción y fluorescencia atómica Lámpara de descarga sin electrodos UV-Visible Absorción y fluorescencia atómica Lámpara de vapor Absorción atómica, Fluorescencia molecular UV-Visible metálico y Raman Lámpara LASER UV-Visible-IR Absorción molecular, Fluorescencia molecular y Raman
15 2.- Monocromador Para obtener luz monocromática, constituído por las rendijas de entrada y salida, colimadores y el elemento de dispersión. El monocromador aísla las radiaciones de longitud de onda deseada que inciden o se reflejan desde el conjunto. 3.- Fotodetectores En los instrumentos modernos se encuentra una serie de 16 fotodetectores para percibir la señal en forma simultánea en 16 longitudes de onda, cubriendo el espectro visible. Esto reduce el tiempo de medida, y minimiza las partes móvils del equipo.
16 TEMA 3.- COMPONENTES DE LOS INSTRUMENTOS ESPECTROSCÓPICOS COMPONENTES Y TIPOS DE MONOCROMADORES MONOCROMADORES Dispersan la radiación separando espacialmente las distintas λ de la luz policromática proporcionando bandas de anchura pequeña. Varían de forma continua y en un amplio Δλ y al mismo tiempo aíslan una pequeña banda de la luz policromática. COMPONENTES: 1. Rendija de entrada 2. Lente colimadora o espejo cóncavo que produce un haz paralelo de radiación 3. Elemento que dispersa la radiación en sus longitudes de onda individuales: prisma o red 4. Elemento de enfoque de salida 5. Rendija de salida
17 TEMA 3.- COMPONENTES DE LOS INSTRUMENTOS ESPECTROSCÓPICOS
18 MATERIALES DE LOS COMPONENTES OPTICOS En la Figura se muestran que tipo de material se emplea en función de la λ (región espectral) para cubetas, ventanas, lentes, prismas y selectores de λ.
19 celda de 5uL La muestra se coloca en una cubeta* de forma prismática
20 TEMA 3.- COMPONENTES DE LOS INSTRUMENTOS ESPECTROSCÓPICOS RECIPIENTES PARA LAS MUESTRAS Todos los métodos espectroscópicos, excepto los atómicos emplean un recipiente que contenga a la muestra. Reciben el nombre de celda o cubeta y se fabrican de : plástico o vidrio (para la región Visible) sílice fundido (cuarzo) (para la región Visible y UV por debajo de 350 nm e IR hasta 3000 nm ) vidrio de silicato para medidas entre 375 y 2000 nm (V e IR) NaCl para la región del IR La longitud mas común en la trayectoria de las cubetas para Visible y UV, suele ser de 1 cm, aunque las puede haber menores o mayores. Hay cubetas acopladas a los sistemas de medidas continuas (FIA o HPLC), a través de las cuales pasa el flujo de muestra.
21 TEMA 3.- COMPONENTES DE LOS INSTRUMENTOS ESPECTROSCÓPICOS RECIPIENTES PARA LAS MUESTRAS Portacubetas Cubeta: disolución de medida Refrigerante: baño termostático, Peltier cooler
22 Se asume que el tubo, celda o cubeta en la cual se vierte la solución a leer no debe desviar la trayectoria de la luz como requisito para el cumplimiento de la ley de Beer
23 Como el cuarzo aparte de ser muy transparente presenta un comportamiento constante ante la variación de la longitud de onda es común que las celdas del espectrofotómetro o colorímetro sean de este material.
24 RELACIÓN ENTRE ABSORBANCIA Y CONCENTRACIÓN: LEY DE BEER Ley de Lambert-Beer: muestra cómo la absorbancia es directamente proporcional a la longitud b de la trayectoria a través de la solución y a la concentración c del analito o especie absorbente. A a b c A b c a: cte de proporcionalidad llamada absortividad. (unidades L cm -1 g -1, si c=g/l) b: longitud del camino que recorre la radiación a través del medio absorbente. c: concentración expresada en g/l (mg/l,...) Cuando en la ecuación la concentración viene expresada en mol/l, la cte de proporcionalidad se denomina absortividad molar y se representa por (unidades L cm -1 mol -1. ) -Disoluciones que contienen más de una clase de especies absorbentes: Como A = b c A = A 1 + A A n A = 1 b c b c n b c n Siendo 1, 2,, n los componentes absorbentes.
25 Cuando un rayo de luz monocromática con una intensidad I 0 pasa a través de una solución, parte de la luz es absorbida resultando que la luz emergente I es menor que I 0 Luz incidente (I 0 ) Luz absorbida Luz emergente (I) a a = absortividad I 0 I b Longitud del medio absorbente o ancho de la celda c = concentración. (número de partículas por cm3)
26 TRANSMITANCIA Transmitancia: fracción de radiación incidente transmitida por la disolución. T P P T O ABSORBANCIA A log T log La absorbancia de una disolución aumenta a medida que aumenta la atenuación del haz. potencia del haz de radiación transmitida. P T P P O T
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28 Cada compuesto (de complejo a simple) presenta un espectro de absorción característico Absorbancia l Las longitudes de onda con mayor absorción (picos) corresponderán de forma general a aquellas con las que se leerá la muestra para determinar su concentración Absorbancia La relación entre la absorbancia por una sustancia a una l determinada y su concentración es directamente proporcional es decir: a mayor concentración mayor proporción de luz absorbida. l Absorbancia Conc.
29 Así, el espectro de absorción de la clorofila es:
30 8.4.- LIMITACIONES DE APLICABILIDAD DE LA LEY DE BEER La atenuación de una radiación es cuantitativamente proporcional a ala concentración de la especie absorbente La proporcionalidad directa entre absorbancia y concentración cuando b es cte presenta desviaciones: A) Limitaciones reales de la ley B) Limitaciones Químicas C) Limitaciones Instrumentales
31 8.4.- LIMITACIONES DE APLICABILIDAD DE LA LEY DE BEER A) Limitaciones reales de la ley -Disoluciones de concentración elevada (c > 0.01 M) dan malos resultados. -La absortividad a y la absortividad molar dependen del índice de refracción de la muestra. B) Limitaciones Químicas Se produce cuando el analito se disocia, asocia o reacciona con el disolvente para dar productos que presentan propiedades de absorción diferentes de las del analito. HIn H + + In - Color 1 Color 2
32 8.4.- LIMITACIONES DE APLICABILIDAD DE LA LEY DE BEER C) Limitaciones Instrumentales El cumplimiento estricto de la Ley de Beer sólo se observa para radiaciones monocromáticas (radiación formada por una sola longitud de onda) y éstas en la práctica no se consiguen, ya que con los dispositivos disponibles (filtros, monocromadores) se obtienen una banda de longitudes de onda más o menos simétrica entorno a la deseada. Otra desviación: Presencia de radiación parásita o dispersa.
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34 8.6.- ESPECIES ABSORBENTES A) Absorción por compuestos orgánicos Dos tipos de e - son responsables de que las moléculas absorban radiación UV-Vis: - e - compartidos que participan directamente en la formación de enlaces y que están asociados a más de un átomo. - e - externos no compartidos, localizados preferentemente entorno a átomos como O, S, N y halógenos.(e situados en orbitales no enlazantes n) l a la que absorbe una molécula depende de la fuerza con que retiene a sus distintos e -. Enlaces sencillos C-C o C-H: l de la región del UV de vacío (l<180 nm) Enlaces dobles o triples: l de la región del UV Compuestos orgánicos que contienen S, Br y I: absorben en la región UV
35 ESPECIES ABSORBENTES A) Absorción por compuestos orgánicos con grupos cromóforos n orbitales no enlazantes presentes en compuestos con heteroatomos de O, S y halógenos.
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37 8.7.- APLICACIONES CARACTERÍSTICAS DE LOS MÉTODOS ESPECTROFOTOMÉTRICOS - Amplia aplicabilidad. - Elevada sensibilidad: los límites detección 10-4 a 10-5 M. - Selectividad de moderada a alta. - Buena exactitud: errores de concentración 1-5% o incluso menores. - Facilidad y comodidad en las medidas espectrofotométricas. - Se prestan a una fácil automatización. CAMPO DE APLICACIÓN - Especies absorbentes: compuestos orgánicos que contengan grupos cromóforos y especies inorgánicas como son los metales de transición. - Especies no absorbentes: los analitos reaccionan con un reactivo para producir un compuesto absorbente.
38 8.7.- APLICACIONES APLICACIONES MEDIOAMBIENTALES
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41 Existen en la actualidad diversos tipos de aparatos con los mismos principios los hay mecánicos y digitales; unos miden solo la luz visible, otros son más precisos y miden también luz U.V., Infrarroja, de absorción atómica (AA), flurescencia de rayos-x de emisión de plasma (ICP),, multipropósitos (para medir directamente la solución con suspensión, muestras sólidas y biológicas), acoplado a masas,etc..
42 Para medir Luz Visible MCI MCI Para medir Luz Visible y U.V. MCI Para medir Luz Visible y U.V. Diferentes tipos de espectrofotómetros
43 Spectronic 20 D Spectrónic 20
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46 Aplicaciones Estándar con Espectrofotómetro UV Mini Modo fotométrico para longitud de onda fija Con el modo fotométrico, Ud. puede medir la absorbancia o la transmitancia en la longitud de onda fija. Análisis cuantitativo fijo usando el método Factor-K puede también ser usado. Resultados son automáticamente impresos o son mandados a la puerta RS-232C. Con varios posicionadores de celda opcionales o con configuración sipper/auto-muestra, medidas continuas de muestras también es posible. Modo espectro para barrido de longitud de onda Con ese modo estándar, Ud. puede lograr espectro UV-Visible completo de muestras de 190nm a 1100nm. Barrido repetido le permite a Ud. medir automáticamente cualquier cambio espectral en todo el rango. También disponible en la configuración estándar, la función de procesamiento de datos espectral como plotar gráfico y detección de picos / valles. Modo cuantificación para análisis de longitud simple Este modo le permite a Ud. preparar curva de calibración para determinaciones fáciles de concentraciones de muestras desconocidas. Están disponibles modos de uno, dos o tres longitudes de onda. Métodos cuantitativos posibles de seleccionar incluyendo factor-k, curva de calibración de un punto o multi-puntos. Ajuste de primero, segundo o tercero orden también son posibles de seleccionar.
47 El TU1800/1800S es el más popular espectofotómetro de P-General. Su óptica adopta el sistema de medición SPLIT-BEAN con un detector formado por dos fotodiodos de estado sólido de alta sensibilidad. Las operaciones del instrumento estan controladas a través de un microchip interno en conjunto con una pantalla de cristal líquido (LCD) y un teclado Soft-Touch con salida para impresora. Su compartimiento es para 8 celdas y además posee una fuente de luz accesible. El TU1800/1800S efectúa mediciones fotométricas, mediciones espectrales y cuantitativas, es fácilmente operable con características sobresalientes, Escaneo de longitudes de onda automático entre nm., chequea automáticamente la linea de base.
48 Las muestras no deben tener burbujas, encontrarse turbias o con precipitados. El volumen de la muestra en la cubeta, no debe ser excesivo para evitar que se desborde, en caso de que sucediera, se debe limpiar con un paño limpio o papel absorbente suave, para evitar rayarla. La cubeta se sujeta por los lados opacos. La cantidad a adicionar es, máximo, hasta ¾ partes de la cubeta No se deben derramar líquidos, sobre todo solventes, ácidos o álcalis; dentro del contenedor de la cubeta, se puede dañar parte del mecanismo Se debe mantener, el espectrofotómetro, limpio y libre de humedad
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