El tipo de alteración observada también proporciona gran información:

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1 TEMA 5: ENZIMOLOGÍA CLÍNICA 1. Valor diagnóstico de las enzimas en el plasma. 2. Principios del análisis de enzimas 3. Análisis de isoenzimas. 4. Determinación enzimática de sustratos. 1. Valor diagnóstico de las enzimas en el plasma La enzimología clínica es la aplicación del conocimiento de las enzimas (proteínas especializadas en la catálisis de reacciones orgánicas) al diagnóstico, tratamiento y pronóstico de la enfermedad. Aunque son raras las enzimas exclusivas de un tejido, la alteración de la concentración sérica de un enzima determinada orienta sobre los tejidos más probablemente afectados. Además, muchas enzimas muestras distintas formas moleculares (isoenzimas) características de distintos tejidos. El análisis isoenzimático de la enzima cuya concentración sérica se encuentra alterada a menudo aporta información adicional sobre las causas de dicha alteración. Muy frecuentemente la información deseada se obtiene examinando dos o más enzimas séricas ej. una elevación en?-glutamil-transferasa indicará, con gran probabilidad, colestasis si aparece aumentada la fosfatasa alcalina sérica. El tipo de alteración observada también proporciona gran información: Lo más frecuente es encontrar elevaciones debidas a aumentos de permeabilidad celular daño tisular. Es posible detectar disminuciones debidas a enfermedades crónicas que originan disfunción celular. El grado de alteración de la concentración catalítica puede ser orientativo de determinadas alteraciones ej. las aminotransferasas séricas muestran aumentos más importantes en hepatitis agudas que en hepatitis crónicas. Dependiendo del grado de permeabilidad y de la distancia entre células y capilares existirá un mayor o menor desfase entre el momento de detección del aumento de actividad enzimática y el momento de daño tisular. 2. Principios del análisis de enzimas La concentración de enzimas en suero es muy baja, sin embargo, dada su eleva capacidad catalítica, es posible determinar su actividad y presuponer que ésta es proporcional a su concentración. Por tanto, el estudio de las enzimas en el laboratorio se basa en la demostración in vitro de la actividad catalítica. Se puede determinar la actividad enzimática analizando: La aparición de algún producto La desaparición del sustrato 1

2 La variación de un cofactor o de algún componente de la reacción En definitiva, la actividad de una enzima se mide mediante la determinación de la cantidad de sustrato formado por unidad de tiempo, en condiciones exactamente definidas (ph, Tª ) y estrictamente controladas. La actividad enzimática se expresa Unidades Internacionales (UI) por unidad de volumen (UI/ml, UI/L ) siendo una UI la cantidad de enzima que transforma un micromol de sustrato por minuto en condiciones estándar previamente establecidas. En una reacción enzimática podemos diferenciar 3 fases: fase de retardo, fase lineal y fase de agotamiento de sustrato. La fase de retardo tiene lugar inmediatamente después de mezclar los reactivos con la muestra biológica. Es una fase de encuentro y acoplamiento de sustrato y enzima. Su duración es muy variable (segundos a minutos). Al finalizar esta fase comienza la fase lineal en la que la formación de producto permanece constante, siendo la concentración de enzima de la muestra es el único factor limitante. Por último, a medida que va transcurriendo la reacción, llega un momento en que el sustrato u otro reactivo se van agotando (fase de agotamiento de sustrato) y la velocidad de reacción disminuye hasta anularse. Para que una determinación enzimática sea válida es necesario realizarla en la fase lineal donde el único factor limitante es la concentración de la propia enzima y las condiciones de reacción son las óptimas (exceso de sustrato y otros reactivos ). Para ello se suele trabajar con una concentración de sustrato superior a la K m. Así, en un ensayo enzimático, el límite de linealidad es la actividad enzimática más alta que se puede medir 2

3 con exactitud. Por encima de ese valor habrá que diluir el suero con solución salina y multiplicar el resultado obtenido por el factor de dilución. 2.2 Cómo se obtiene en el laboratorio clínico el valor numérico de actividad enzimática? Generalmente la actividad enzimática se evalúa mediante ensayos espectrofotométricos, por tanto necesitamos seguir la evolución de alguno de los elementos que participan en la reacción y que, por supuesto, deben absorber luz a una determinada longitud de onda así: Si el producto absorbe luz a una longitud de onda determinada podemos evaluar la aparición del producto analizando el incremento de absorbancia a dicha longitud de onda. Si el sustrato absorbe luz a una longitud de onda determinada podemos evaluar la desaparición del sustrato analizando la disminución de absorbancia a dicha longitud de onda. De igual modo podemos analizar la variación de un cofactor o de algún componente de la reacción. Ej. es muy frecuente utilizar la aparición o desaparición de NADH o NADPH, así NAD + NADP + NADH NADPH NADH NAD + NADPH NADP + Aumenta la absorbancia a 340nm Disminuye la absorbancia a 340nm De cualquiera de estas maneras podremos: analizar como evoluciona la absorbancia, es decir la reacción, a lo largo del tiempo y obtener un valor de?a/min En ocasiones ninguno de los elementos que participan directamente en la reacción absorben luz, en cuyo caso es necesario acoplar una segunda reacción en la que alguno de los reactivos o productos presenten un máximo de absorción. Analizando esta segunda reacción podremos evaluar la actividad enzimática de la primera. Los métodos analíticos para determinar la actividad enzimática y por tanto el?a/min pueden ser: Métodos a punto final Métodos cinéticos 3

4 En definitiva, ya sabemos la fase en la que hemos de trabajar, que parámetro obtenemos experimentalmente y como lo obtenemos pero cómo convertimos?a/min en UI/L? Para obtener el valor definitivo de actividad enzimática aplicamos la siguiente fórmula: Donde: e es el coeficiente de extinción molar de aquel compuesto cuya absorbancia estamos siguiendo en el espectrofotómetro. d es el espesor de la cubeta V F es el volumen total de reacción V I es el volumen de muestra en el ensayo Para un determinado ensayo todos los parámetros que aparecen en rojo son constantes por tanto podemos la fórmula anterior queda como: UI/L=?A/min cte 4

5 2.3. Aspectos prácticos No utilizar muestras que hayan sido congeladas y descongeladas varias veces. Separar lo antes posible el coágulo del suero y evitar trabajar con muestras bemolizadas Evitar la estasis venosa prolongada durante la extracción Evitar el envejecimiento de las muestras El transporte de las muestras debe realizarse en frío sin congelar, salvo que se vaya a prolongar mucho tiempo. 3. Análisis de isoenzimas. Las isoenzimas son formas múltiples de un enzima que catalizan la misma reacción. Las isoenzimas de una familia pueden diferir en sus propiedades fisicoquímicas, tamaño, carga, termoestabilidad, K m, especificidad por distintos sustratos, capacidad de ser reconocidas por agentes específicos o inmunorreactividad. Estas diferencias son utilizadas como base de los ensayos que permiten diferenciar isoenzimas concretas. Así: Las diferencias de carga hacen que las distintas isoenzimas se puedan separar por ejemplo mediante electroforesis o mediante cromatrografía de intercambio iónico. Ej. separación electroforética de las isoenzimas de la LDH y posterior visualización por reacción con lactato, NADH y NBT. Ej. separación electroforética o por cromatografía de las isoenzimas de CK (lo veremos cuando estudiemos el infarto de miocardio). La distinta termoestabilidad permite inactivar selectivamente algunas isoenzimas ej. Tras un infarto de miocardio aumenta la concentración de LDH-1, esta isoenzima es bastante termoestable. Esta característica explica que si extraemos suero de un paciente sano y lo calentamos a 60ºC durante 30 min sólo se preserve el 20-40% de la actividad. Sin embargo, si realizamos el mismo tratamiento a un suero que un paciente que ha sufrido un infarto de miocardio, se preserva más del 45%. La diferente capacidad de cada isoenzima para fijar ihnibidores permite utilizar técnicas de inhibición catalítica (inhibición selectiva de isoenzimas). En ocasiones cada isoenzima puede posee un sustrato específico lo que permite utilizar técnicas de especificidad de sustrato ej. LDH-1 puede utilizar ß-hidroxibutirato como sustrato específico. Por ultimo, otras técnicas aprovechan las diferencias inmunológicas y utilizan anticuerpos que reaccionan exclusivamente con determinadas isoenzimas ej. RIA, inmunoinhibición. 5

6 4. Determinación enzimática de sustratos. En el laboratorio no sólo se puede determinar la actividad de enzimas de interés clínico, también es muy frecuente utilizar enzimas en la determinación de sustratos ej. métodos enzimáticos (GOD/POD o de la hexoquinasa) para determinar la concentración de glucosa de una muestra. Bibliografía D'Ocon Navaza MC, García-Saavedra MJ, Vicente García JC. (1999). Análisis de Muestras Biológicas. Madrid. Ed. Paraninfo. Salve ML, Amich S, Prieto S, Casas A. (1994). Laboratorio Clínico. Madrid. Ed. Interameericana McGraw-Hill Anderson SC, Cockayne S. (1995). Química Clínica. Méjico. Ed. Interameericana McGraw-Hill.? KAPLAN. Clinical Chemistry. Interpretation and Techniques. Buenos Aires. Ed. Panamericana. Preguntas de revisión 1. Cómo se define una UI de actividad enzimática? Cómo se expresa la actividad enzimática en clínica? 2. La actividad enzimática se debe medir en: a. la fase lineal b. la fase de agotamiento de sustrato c. la fase de retardo d. cualquiera de las respuestas anteriores es válida 3. Razone la respuesta que ha dado a la pregunta anterior. 4. Qué parámetro debe determinar experimentalmente para calcular la actividad enzimática? Cómo se lleva a cabo dicha determinación en el laboratorio? 5. Si evaluáramos la aparición de NADPH a qué longitud de onda deberíamos trabajar? Tendríamos que utilizar cubetas de cuarzo? 6. En el caso anterior la absorbancia aumentaría o disminuiría? 7. La determinación de la actividad se lleva a cabo generalmente por métodos cinéticos por qué? 8. Suponga que partiera de una muestra de suero (ej. de un paciente con infarto) y quisera llevar a cabo un análisis isoenzimático de una determinada actividad enzimática (ej. LDH) cómo podría hacerlo? 9. En prácticas se analizó la actividad enzimática de la fosfatasa alcalina en una muestra de suero. Considerando los resultados de absorbancia obtenidos podría identificar el compuesto cuya absorbancia estaba analizando? 6

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