NOEMÍ COLOMBO Instituto de Genética CICVyA, INTA

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1 PROTOCOLOS DE LABORATORIO PARA LA APLICACIÓN DE MARCADORES MOLECULARES EN LA OBTENCIÓN DE LÍNEAS DE CEBOLLA ANDROESTÉRILES, MANTENEDORAS Y RESTAURADORAS NOEMÍ COLOMBO Instituto de Genética CICVyA, INTA PNHFYA : Desarrollo de plataformas tecnológicas y comerciales especializadas, para incrementar la competitividad y la sostenibilidad de hortalizas pesadas diferenciadas 2018

2 PROTOCOLOS DE LABORATORIO PARA LA APLICACIÓN DE MARCADORES MOLECULARES EN LA OBTENCIÓN DE LÍNEAS DE CEBOLLA ANDROESTÉRILES, MANTENEDORAS Y RESTAURADORAS 1) Identificación de tipo de citoplasma Introducción La producción de semilla híbrida de cebolla es una actividad sólo resulta económicamente viable a partir de la incorporación de sistemas de androesterilidad génico-citoplásmica. El programa de mejoramiento de cebolla del INTA desarrolla híbridos con el citoplasma androestéril S, el que interactúa con un gen nuclear - Ms- restaurador de la fertilidad (Jones y Clarke, 1943). La determinación del tipo de citoplasma de cebolla por cruzamientos demanda entre 4 y 8 años, lo que retrasa la obtención de líneas mantenedoras. Para superar esta limitación se han desarrollado marcadores moleculares basados en la amplificación por PCR de polimorfismos de ADN cloroplástico y mitocondrial que permiten una rápida y confiable identificación de los distintos tipos de citoplasma. Se ajustó este protocolo para la amplificación de la región intergénica trnt-trnl del ADN cloroplástico, la que presenta un polimorfismo entre el citoplasma androestéril (S) y el normal (N), consistente en una inserción de unas 100 pb en este último (Havey, 1995). Materiales y Métodos -ADN genómico: 20ng -Buffer de reacción: 10 mm Tris-HCl ph 8,8 50 mm KCl 3mM Cl 2 Mg 0,2 mm de cada dntp 1µM de cada primer A: 5'-CATTACAAATGCGATGCTCT-3' B: 5'-TCTACCGATTTCGCCATATC-3' 1 U de Taq ADN polimerasa (Fermentas) 1

3 -Volumen de reacción: 25 µl -Programa de ciclado 94º C por 3 min 35 ciclos: 94º C por 1 min, 57º C por 30 seg 72ª C por 1 min 72ª C por 10 min -Visualización de productos de PCR Se resuelven los productos de PCR por electroforesis en geles de agarosa al 1,5% en buffer 0,5X TBE (0,045M Tris borato ph 8,0; 0,001M EDTA) a voltaje constante (80V) con bromuro de etidio (10 mg/ml) bajo luz UV. El tamaño de los amplicones se estableció por comparación con un marcador de peso molecular (1 kb ladder, Axygen). Resultados Los tamaños de los productos esperados son de 1,1 kb y 1 kb en el citoplasma normal (N) y androestéril (S), respectivamente (Figura 1). Figura 1. Marcador molecular asociado al tipo de citoplasma en cebolla: Normal (N) y androestéril (S). Referencias Havey MJ (1995) Identification of cytoplasms using the polymerase chain reaction to aid in the extraction of maintainer lines from open-pollinated populations of onion. Theoretical and. Applied Genetics 90: Jones H y Clarke A (1943) Inheritance of male sterility in the onion and the production of hybrid seed. Proceedings of the American Society of Horticultural Science 43:

4 2) Amplificación de marcadores moleculares asociados con el gen de restauración de la fertilidad Ms Introducción El uso de marcadores moleculares asociados al gen restaurador de la fertilidad Ms permite aumentar la eficiencia de la selección de plantas mantenedoras y restauradoras y determinar asimismo la pureza de los stocks de las líneas parentales de los hibridos (Bang et al. 2011, Yang et al. 2013, Havey, 2013, Huo et al. 2015, Kim et al. 2015). En este protocolo se ajustaron las condiciones para amplificar por PCR los marcadores codominantes OPT y PsaO, ligados al gen Ms a 1,5 y 6,4 cm, repectivamente (Bang et al., 2011). Materiales y Métodos -ADN genómico: 50 ng -Buffer de reacción: 10 mm Tris-HCl ph 8,8 50 mm KCl 2 mm Cl 2 Mg 0,2 mm de cada dntp 0,2 µm de cada primer OPT-F: 5'- CCTTGGAAAGGCGCAACTAAAGATTTGA-3' OPT-R: 5 -TGTGGCCCAATAATACAAACAAGCAGGA-3' PSAO-F: 5 -CCTCATGCTTGCTTGGTCTT-3' PSAO-R: 5 -AAGCGTGATCGATTGTAGGTCCTTT-3' 1 U de Taq ADN polimerasa (Fermentas) -Volumen de reacción: 10 µl -Programa de ciclado OPT 95º C por 5 min 40 ciclos de 94º C por 30 seg, 68º C por 1 min 72ª C por 1 min 72ª C por 10 min 3

5 PsaO 95º C por 5 min 10 ciclos de 95º C por 30 seg 65º C por 30 seg (-0,8 C/ciclo) 72ª C por 2 min 30 ciclos de 95 C por 30 seg 57 por 30 seg 72ª C por 2 min 72 C por 7 min -Visualización de productos de PCR Se resuelven los productos de PCR por electroforesis en geles de agarosa al 2 % en buffer 0,5X TBE (0,045M Tris borato ph 8,0; 0,001M EDTA) a voltaje constante (80V) con bromuro de etidio (10 mg/ml) bajo luz UV. El tamaño de los amplicones se estableció por comparación con un marcador de peso molecular (100 pb ladder, Axygen). Resultados OPT Alelo asociado al alelo Ms: 659 pb Alelo asociado al alelo ms: 526 pb 4

6 PsaO Alelo asociado al alelo Ms: 490 pb Alelo asociado al alelo ms: 437 pb Referencias Bang H, Cho DY, Yoo KS, Yoon MK, Patil BS y Kim S (2011) Development of simple PCR-based markers linked to the Ms locus, a restorer-of-fertility gene in onion (Allium cepa L.). Euphytica 179: Havey MJ (2013) Single nucleotide polymorphisms in linkage disequilibrium with the male-fertility restoration (Ms) locus of onion. Journal of the American Society of Horticultural Science 138: Huo,Y, Liu MBJ, Yang YY, Miao J, Gao LM, Kong SP, Wang ZB, Kitano H y Wu X (2015) AcSKP1, a multiplex PCR based co-dominant marker in complete linkage disequilibrium with the male fertility restoration (Ms) locus and its application in open-pollinated populations of onion. Euphytica 204: Kim S, Kim CW, Park M y Choi D (2015) Identification of candidate genes associated with fertility restoration of cytoplasmic male sterility in onion (Allium cepa L.) using a combination of bulked segregant analysis and RNA-seq. Theoretical and Applied Genetics128: Yang Y, Huo Y, Miao J, Liu B, Kong S, Gao L, Liu C, Wang Z, Tahara Y, Kitano H y Wu X (2013) Identification of two SCAR markers co-segregated with the dominant Ms and recessive ms alleles in onion (Allium cepa L.). Euphytica 190: