Conceptos y Técnicas de Biotecnología I, CTBT. Bloque BASH (Biotecnología Animal y en Salud Humana) VACUNAS SANDRA RUZAL

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1 Conceptos y Técnicas de Biotecnología I, CTBT Bloque BASH (Biotecnología Animal y en Salud Humana) VACUNAS SANDRA RUZAL 1

2 VACUNAS origen siglo XVIII, exposición voluntaria a agente infeccioso era beneficiosa. Generaba Protección a reinfección Inmunidad: respuesta del sistema inmunológico memoria inmunológica Edward Jenner (médico británico) inventó en 1796 la primera vacuna contra la viruela. El experimento consistió en inyectar a un niño de 8 años la vacuna procedente de una pústula del brazo de una ordeñadora (contagiada x VACA) a través de dos cortes superficiales en el brazo, consiguiendo inmunizar al niño ante la viruela humana. 2

3 Aparición principales vacunas de uso humano: : Vacunación contra la viruela : Vacuna contra la rabia Pasteur : Toxoide diftérico, Toxoide tetánico y tos combulsa : Vacuna contra la fiebre amarilla : Vacuna contra influenza : Vacuna inactivada contra virus polio : Vacuna viva atenuada contra virus polio : Vacuna contra el sarampión : Vacuna contra la rubeóla : Vacuna contra hepatitis B subunidades : Viruela erradicada : Primera vacuna recombinante (hepatitis B) : Vacuna contra H. influenzae B conjugada cultivo celular y desarrollo de virus humanos fuera del organismo vivo Edad de oro 3

4 Vacunas: Inmunización: procedimiento para generar inmunidad adquirida: Especificidad y Memoria Antígeno: molécula Inmunogénica, se aisla del agente patógeno identificar antígenos responsables y eliminar componentes patogénicos Inmunogénica: molécula capaz de despertar una respuesta en el sistema inmune y producir memoria inmunológica Qué son las vacunas: Preparados de antígenos que introducidos en el organismos son capaces de estimular el sistema inmunitario e inducir una respuesta protectora Objetivo: PROTECCIÓN POR PREVENCIÓN 4

5 5

6 Respuesta primaria 5-10 días Menor Intensidad IgM>IgG Respuesta secundaria 1-3 días Mayor Intensidad IgG, IgA, IgE Mayor Afinidad de los Ac Inmunnógeno Sólo proteínas 6

7 Respuestas inmunes que confieren protección: Microorganismos extracelulares con una fase en sangre crucial para la patogénesis (viremia o bacteriemia): Respuesta Humoral Microorganismos que ingresan por mucosas: Producción de IgA secretoria neutralizante Microorganismo intracelulares: Respuesta celular y humoral. 7

8 Que tipos de vacunas existen? modificados para que no puedan generar enfermedad Patógenos muertos Sólo componentes 8

9 Ventajas vacunas vivas atenuadas vs. muertos o subunidades? imitan a la infección, son baratos de producir y administrar vía oral menor número de dosis requeridas persisten en el organismo, hay una inmunización mantenida que pasa progresivamente de vacunación primaria a secundaria. Desventajas costos de almacenamiento y conservación, deben mantener a 4 C, riesgo afecte al personal riesgo potencial que revierta 9

10 VACUNAS Atenuadas o Vivas: Microorganismos vivos que multiplican con reducida patogenicidad (infección leve) inmunidad humoral y celular 10

11 BCG Una gran cantidad de estudios demuestran que NO induce Ac pero sí una rta T CD4+ productora de IFN-. También CD8+ y CD1. 11

12 VACUNAS Inactivadas o Muertas: Microorganismos enteros muertos no multiplican tratamientos físicos o químicos eliminan infectividad, manteniendo capacidad inmunogénica Inmunidad generada sólo humoral, Requiere grandes cantidades del Ag y/o mayor número de dosis 12

13 Subunidades procedimientos de fermentación y purificación que han permitido la producción de vacunas a base de subunidades o antígenos purificadas Pertussis acelular, subcomponentes proteicos purificados, Salmonella typhi, polisacárido capsular Vi, N. meningitidis grupos A y C, polisacáridos capsulares, Streptococcus pneumoniae (23-valente), polisacáridos capsulares, Haemophilus influenzae tipo b conjugada, inmunogenicidad polisacárido incrementada unida a proteína transportadora, N. meningitidis grupos A y C conjugadas Polisacaridos capsulares conjugados con proteínas antigénicas (meningococo, neumococo) TOXOIDES: toxinas inactivadas con formol (tetánica, difterica) 13

14 Vacunas acelulares, vacunas con toxoides y vacunas conjugadas, son débilmente inmunogénicas Adyuvantes 14

15 Monovalentes: una única especie un antígeno Polivalentes: única especie de distintos antígenos Combinadas: varias especies Doble bacteriana (dt): difteria + tétanos. Triple bacteriana celular y acelular (DTP/Pa): difteria + tétanos +pertussis. Cuádruple celular y acelular (DTP/Pa + Hib): difteria + tétanos + pertussis + Haemophilus influenzae b. Quíntuple celular y acelular (cuádruple + IPV): DTP/Pa + Hib + poliomelitis inactivada. Quíntuple celular (cuádruple + HB): DTP + Hib + hepatitis B. 15

16 Instalaciones de producción 1) Debe limpiarse fácilmente y completamente; 2) Tienen ventilación adecuada y aire filtrado; 3) tienen abundante agua limpia caliente y fría y drenaje eficaz 4) tienen vestuarios y otras instalaciones para el personal que es accesible sin pasar a través de áreas de preparación de productos biológicos. 5) tienen diseño que evita contaminación ambiental. Material utilizado en producción tiene que hacerse seguro antes de salir de la instalación. 16

17 Los virus se cultivan tanto en las células primarias, tales como huevos de gallina (xej influenza), o en líneas celulares continuas, tales como cultivos de células humanas (x ej hepatitis A). Las bacterias son cultivadas en biorreactores 17

18 Disposición ANMAT 705/2005 Requisitos para la inscripción de vacunas. 1. Investigación pre-clínica se prueban pureza y seguridad en animales 2. Estudios clínicos en humanos: Fase I: pequeño grupo de voluntarios que habitan fuera del área endémica. evalúa la seguridad y potencia de la vacuna. Fase II: análisis de la respuesta inmune de los voluntarios. Fase III: son pruebas de campo, se realizan con comunidades que habitan en áreas endémicas. Seguimiento clínico de los individuos vacunados. 3. Período de licencia procedimientos legales y administrativos a partir de los resultados obtenidos en las etapas anteriores para la aprobación (licencia) y registro de la vacuna. 4. Relevamiento post-licencia evalúa la vacuna durante algunos años. Se estudian los cambios en la incidencia de la enfermedad y en la transmisión y se registran los casos de reacciones indeseables. Sólo después de esta etapa se considera o no la inclusión de la vacuna en los 18 planes de vacunación de la región.

19 inoculo semilla biorreactor centrifugación estabilizador liofilizada molienda encapsulado las bacterias deriva de lote de semillas de trabajo son inoculadas en frasco de cultivo, seguido por el crecimiento en medio en biorreactores a gran escala. Las bacterias son cosechadas por centrifugación. Para el procesamiento las bacterias se mezclan con un estabilizador, liofilizadas y encapsuladas a concentración de 2 10 x 10 9 bacterias 19

20 Bondades de una vacuna ideal Precio competitivo. Inocuidad. Estabilidad física y genética. Posible inmunización simultánea contra múltiples componentes protectores de diversos patógenos. Protección de larga duración con 1 sola dosis Vía Oral Inducción de inmunidad mucosas en máximo 2 semanas. Estimulación de respuesta inmune humoral y celular a nivel sistémico. 20

21 El papel de la biotecnología en el desarrollo de vacunas Problemas i) no todos los agentes infecciosos son fáciles de crecer en las condiciones normales de cultivo ii) el trabajar con los agentes infecciosos requiere de medidas de seguridad muy elevadas iii) no todas las enfermedades infecciosas son prevenibles por este tipo de vacunas; iv) los agentes infecciosos usados en la producción de la vacuna pueden estar insuficientemente atenuados o muertos y por lo tanto pueden introducir la virulencia a la vacuna; v) componentes tóxicos de los agentes pueden no estar completamente inactivados y mantener la toxicidad en la vacuna final 21

22 22

23 vacunas recombinantes 23

24 El papel de la biotecnología en el desarrollo de vacunas Soluciones a) identificar genes de virulencia y por lo tanto facilitar su deleción en los agentes infecciosos creando clones avirulentos pero que mantienen su habilidad de estimular la respuesta inmune; b) crear sistemas vivos no-patogénicos que acarreen los determinantes antigénicos de un patógeno específico o de varios; c) para aquellos agentes de difícil crecimiento, se pueden aislar los genes de las proteínas que contienen los determinantes antigénicos críticos para la inmunidad y expresarlos en otro huésped de mas fácil crecimiento (bacteria) 24

25 Recombinantes: Se utiliza la manipulación genética para producir alguno de los componentes del patógeno 4 subtipos 25

26 Las vacunas recombinantes de tipo subunidad producto del gen expresado en bacteria, es cosechado, purificado y administrado como una vacuna Ej: lipoproteína superficie externa OspA de Borrelia burgdorferi 26

27 proteínas L1 (capside mayor) recombinantes forman partículas tipo-virus (VLPs, virus-like particles), carentes del genoma viral, y por lo tanto no infectivas Segunda generación XBio-Leloir 27

28 Las vacunas recombinantes de gen deletado vacunas con genes deletados asociados con la virulencia o patogenicidad de una bacteria patógeno; Ej: ensayos clínicos vacuna de cepas estables del agente del cólera (Vibrio cholerae). 28

29 Las vacunas recombinantes vectoriales consisten de organismos no patogénicos o de gen deletado en el que se inserta un material genético específico de otro patógeno Utilizan virus o bacterias vivos como vectores 29

30 Ej: Salmonella, Mycobacterium HIV, Helicobacter La Salmonella entérica viva atenuada es útil como portadora de antígenos heterólogos para la vacunación, capacidad de invadir células de mucosa la eficacia fue demostrada con experimentos de vacunación usando antígenos protectores con Listeria monocytogenes. Multiplicación si es en intracelular puede integrarse en el genoma recombinación genética 30

31 Cumplir normativa sobre ecotoxicidad (Directiva 2001/82/CE y 2001/18/EC -Annex II- ): Estudio de virulencia en situaciones de riesgo en diferentes especies Estudio de posible transmisión horizontal y recombinación potencial del vector vacunal o de parte de él. Estudio de especificidad de especie Estudio de la posible instalación en el ambiente. Método validado para poder distinguir entre vacuna y microorganismo salvaje, especialmente en situaciones de planes de control y erradicación de la enfermedad. Utilización de datos obtenidos de ensayos realizados con el mismo vector pero acompañado de otras secuencias. 31

32 Differentiating Infected From Vaccinated Animals Problema: Recombinantes 32

33 Vacunas de ADN desnudo: El gen que codifica para el antígeno es introducido en el organismo a ser vacunado y él mismo produce el antígeno a partir de ese gen inyectado directamente en las células, in vivo, donde luego es traducido y expresado induciendo la respuesta inmune Efecto adyuvante 5 -purina-purina-cgpirimidina-pirimidina-3 > Frecuencia en bacterias Metilados en C vertebrados Experimental 33

34 Gene-gun Inmunización Transcutánea intramuscular 34

35 Existen riesgos asociados: Integración potencial del plásmido en el genoma de las células hospedadoras. Inducción potencial de anticuerpos contra ADN del plásmido inyectado. Problema de conformación no nativa de proteinas bacterianas en vacunas con ADN inoculadas en animales. Liberación accidental de las construcciones de ADN desnudo pueden favorecer transferencia horizontal de genes Existen beneficios asociados: Efectivas en modelos animales sin necesidad de adyuvantes o sistemas de administración. Solo expresan genes que inducen inmunidad. Las produce el mismo animal, siguiendo las instrucciones del gen insertado en el plásmido de expresión. Menor dependencia de la cadena de frío que las vacunas con proteínas. Bajo Costo 35

36 36

37 Vacunas comestibles. a partir de plantas modificadas genéticamente que actúan como bioreactores de antígenos Experimental 37

38 38

39 VACUNAS COMESTIBLES Vacunas orales Vehículos: células enteras LAB o esporas Bacillus sobrevivir aparato gastrointestinal retención de 2 a 3 días Vehículo de baja inmunogenicidad propiedades adyuvantes Sistemas genéticos (Food-Grade) No necesita aislamiento y purificación del antígeno producción IgA administración fácil, evita uso agujas 39

40 Por qué aún no es posible? 40

41 Por qué aún no es posible? Transferencia Horizontal con bacterias intestinales 41

42 42

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44 44

45 La vacunología reversa consiste en una búsqueda de secuencias de genoma para la identificación de putativos antígenos proteicos de superficie que podrían utilizarse como candidatos para vacunas 45

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