DIVERSIDAD MOLECULAR DE Candidatus Liberibacter asiaticus EN CÍTRICOS DEL PACÍFICO CENTRO DE MÉXICO MEDIANTE MARCADORES SSR.
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- María Dolores Claudia Calderón Rey
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1 DIVERSIDAD MOLECULAR DE Candidatus Liberibacter asiaticus EN CÍTRICOS DEL PACÍFICO CENTRO DE MÉXICO MEDIANTE MARCADORES SSR. Gilberto Manzo-Sánchez 1, Fernando Romero-Parra 1, Marco Tulio Buenrostro-Nava 1, Salvador Gúzman-González 1, José Joaquín Velázquez-Monreal 2. 1 Universidad de Colima, FCBA, 2 INIFAP, Campo Experimental Tecomán. gilberto_manzo@yahoo.com Palabras clave: Huanglongbing, Diaphorina citri, marcadores SSR. Resumen: La enfermedad conocida como Huanglongbing (HLB) está asociada a una bacteria Gram-negativa, perteneciente a Candidatus Liberibacter asiaticus ( Ca. L. asiaticus ). El HLB representa una seria amenaza para 539,957 has de cítricos distribuidas en 23 estados de la República Mexicana, lo que representa un riesgo a la producción de 7, ton anuales, con un valor superior de 8 mil millones de pesos. El objetivo de este estudio fue determinar la diversidad genética de 85 cepas de Ca. L. asiaticus de los estados de Nayarit, Jalisco, Colima y Michoacán, mediante marcadores SSR. Primeramente, se llevó a cabo la recolecta de hojas con síntomas visuales del HLB de árboles de limón mexicano, limón persa, naranja y mandarina. El ADN de las diferentes muestras fue analizado con 7 loci de SSR. Los resultados demostraron que el locus 077 amplifico 4 alelos, mientras que el locus 005 amplificó 3 alelos y el resto de los loci dieron solamente 1 alelo por locus, produciendo un total de 15 alelos. Estos resultados muestran la existencia de poca variabilidad genética entre aislados de Ca. L. asiaticus de la región pacífico centro de México, esto debido probablemente al poco tiempo de existencia del HLB en México.
2 Introducción: La enfermedad conocida como Huanglongbing (HLB) está asociada a u n a b a c t e r i a G r a m - n e g a t i v a, perteneciente a Candidatus Liberibacter spp ( Ca. L. asiaticus ) (Hartung et al., 2009). El HLB representa una seria amenaza para 539,957 has de cítricos distribuidas en 23 estados de la Republica Mexicana, lo que representa un riesgo a la producción de 7, toneladas anuales, con un valor superior de 8 mil millones de pesos (FAO, 2010). La diversidad genética en bacterias se puede atribuir a diversos factores ambientales que pueden determinar su crecimiento, y en consecuencia afectar su capacidad de ejercer un efecto benéfico o destructivo en las plantas. Dichos factores incluyen el clima, temperatura, humedad, características del suelo, composición o actividad de microbiana del suelo (Bent, 2001). El objetivo de este estudio fue determinar la diversidad genética de 85 cepas de Ca. L. asiaticus de los Estados de Nayarit, Jalisco, Colima y Michoacán mediante marcadores SSR. Metodología: Se recolectaron durante el periodo de Noviembre Mayo 2012, muestras de tejido foliar de árboles de limón mexicano (Citrus aurantifolia Swingle), limón persa (C. latifolia Tanaka), naranja dulce (C. sinensis (L.) Osbeck), Mandarina (C. reticulata Blanco), Toronja (C. paradisi (Masfad) y Lima dulce (C. limetta Risso) de huertos comerciales con síntomas típicos del HLB de los Estados de Colima, Jalisco, Michoacán y Nayarit la región Pacífico Centro de México, y como controles externos se utilizaron muestras de los Estados de Sinaloa y Yucatán. Cada muestra se colocó dentro de una bolsa de papel, se etiquetó con los datos correspondientes y se almacenaron en hielo seco para su conservación en el Laboratorio de Biotecnología de la Universidad de Colima. Posteriormente se Figura 1.Gel de agarosa al 2% con los productos de la PCR empleando el locus SSR005 en cepas de Ca. L. asiaticus de los estados de Yucatán, Sinaloa y Colima. El tamaño de los alelos fue para 1: 703 pb; 2: 600 pb; 3: 550 pb y 4: 600 pb. Sinaloa y Colima. El tamaño de los alelos fue para 1: 703 pb; 2: 600 pb; 3: 550 pb y 4: 600 pb.
3 Figura 2. Dendrograma de consenso estricto obtenido mediante el índice de similitud desarrollado por Dice (1945) y adaptado por Nei (1978) y el método de agrupamiento UPGMA a partir del análisis de 13 alelos de marcadores SSR en 85 cepas de Ca. L. asiaticus provenientes de los estados de Nayarit (4), Jalisco (17), Colima (31), Michoacán (28), Yucatán (4) y Sinaloa (1).
4 llevó a cabo la extracción de ADN median el método de CTAB. Resultados y Discusión: Se obtuvieron 85 cepas de Ca. L. asiaticus de los diferentes Estados. En este estudio, los resultados demostraron que el locus SSR005 amplificó 4 alelos, al igual que el locus SSR077 con 4 alelos y el resto de los loci dieron solamente 1 alelo por locus, produciendo un total de 13 alelos. Estos resultados concuerdan con los obtenidos por Katoh et al. (2012), en 24 árboles de diferentes plantaciones, e m p l e a n d o 2 5 p a r e s d e l o c u s demostrando que estos locus (SSR005 y SSR077), son altamente polimórficos. El peso de del estado de Colima presentaron la mayor cantidad de alelos, cuatro alelos mientras que los estados de Sinaloa y Jalisco con un alelo y Yucatán con dos alelos. Para el locus SSR077, el peso de los alelos fue de entre 500 y 600 pb, el cual, el estado de Colima presentó la mayor cantidad de alelos, tres alelos, Nayarit y Sinaloa con un solo alelo. Mientras que los locus SSR001, SSR002, SSR006, SSR010 y SSR014 presentaron un solo alelo. El dendrograma muestra agrupamientos entre las cepas del mismo origen geográfico (Figura 2). Se encontraron dos grupos principales, el grupo I y grupo II. En el grupo I se incluyó a las cepas del estado de Michoacán (28 cepas), Colima (22 cepas) y Jalisco (15 cepas), las cuales fueron idénticas, ya que mostraron una similitud genética de acuerdo al índice de Nei de 1.0. En el grupo II, se encontró diversas cepas (SMHJal1, CasCJal, ColCol1, TecCol1, TecCol10, TecCol7, TecCol3, TecCol14, TecCol5, TecCol6, TecCol8, TepNay1, IslaPSin y MocYuc1) que presentaron variabilidad genética. Conclusiones: El análisis de 85 cepas de Ca. L. asiaticus de los estados de Nayarit, Jalisco, Colima, Michoacán, Yucatán y Sinaloa, mediante marcadores SSR se demostró la existencia de diversidad genética en el Pacifico Centro de México. Agradecimientos: Al Fondo Institucional de Fomento Regional para el Desarrollo Científico, Tecnológico y de Innovación
5 (FORDECyT-CONACyT), por haber financiado el proyecto No Bibliografía. Bent E Alterations in plant growth and in root hormone levels of lodgepole pines inoculated with rhizobacteria. Canadian Journal of Microbiology 47: Hartung J. S., Levy L. y Wenbin L Quantitative distribution of Ca. L. asiaticus in citrus plants with citrus huanglongbing. Phytopathology 99: FAO Consultado el 27 de Agosto. DesktopDefault.aspx?PageID=567#ancor. Katoh H., Davis R., Smith M. W., Weinert M. y Iwanami T Differentiation of Indian, East Timorese, Papuan and Floridian Ca. L. asiaticus Isolates on the basis of simple sequence repeat and single nucleotide polymorphism profiles at 25 loci. Annals of Applied Biology. 7.
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