RIDASCREEN Malaria Ab-Screening K8341

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1 RIDASCREEN Malaria Ab-Screening K8341 R-Biopharm AG, An der neuen Bergstraße 17, Darmstadt, Alemania Tel.: +49 (0) / Fax: +49 (0)

2 1. Uso previsto Para diagnóstico in vitro. La prueba RIDASCREEN Malaria Ab-Screening es un inmunoensayo enzimático para la detección cualitativa de los anticuerpos IgG o IgM contra Plasmodium spp. en suero o plasma humanos. Este ensayo está indicado para su uso en los casos en que hay sospecha de infección por Plasmodium. 2. Resumen y descripción del ensayo La malaria es una enfermedad potencialmente mortal causada por el protozoo Plasmodium spp. El mosquito Anopheles es su principal transmisor. Las infecciones pueden producirse también a través de una transfusión sanguínea. Existen cuatro especies de parásitos que pueden infectar a los seres humanos: P. falciparum, P. vivax, P. ovale y P. malariae. Plasmodium falciparum causa casos de infección por malaria potencialmente mortales y es el tipo más común, junto con P. vivax. Esta enfermedad se produce principalmente en regiones tropicales y subtropicales. Como resultado de la respuesta del sistema inmunitario, el cuerpo genera anticuerpos específicos frente al patógeno tras producirse la infección por Plasmodium. Estos anticuerpos pueden detectarse en el suero por medio de métodos inmunológicos. La elección del antígeno específico frente al patógeno que se va a utilizar y el método de ensayo que se va a aplicar son primordiales para la validez de este último. La detección del anticuerpo es más sensible que la detección directa del patógeno, es decir, por medio de microscopía, y es independiente del estado de parasitemia. Para la detección se utilizan los antígenos recombinantes de P. falciparum y P. vivax. Dada la similitud antigénica entre las especies de parásitos Plasmodium, P. ovale y P. malariae también deberían poder detectarse mediante reactividad cruzada. 3. Principio del ensayo Los antígenos recombinantes están unidos en una placa de microtitulación. Los anticuerpos en las muestras del paciente se unen a los antígenos y, en un segundo paso, se detectan con un conjugado de anticuerpos anti-humanos marcados con una enzima Conjugate. La enzima cambia el substrato incoloro (H 2 O 2 /TMB) en un producto final de color azul. La reacción enzimática es interrumpida por la adición de ácido sulfúrico. Esta adición hace que el color cambie de azul a amarillo. La medición final se realiza en un fotómetro a 450 nm (longitud de onda de referencia de 620 nm) RIDASCREEN Malaria Ab-Screening

3 4. Reactivos suministrados Tabla 1: Reactivos suministrados (los reactivos del kit son suficientes para 96 ensayos). K8341 Plate 96 ensayos Placa de pocillos; 12 tiras de pocillos (divisibles) en el soporte; recubiertas con antígenos de plasmodium recombinantes (P. falciparum, P. vivax) Diluent 100 ml Diluyente de muestras, listo para su uso; con fosfato y de color amarillo Wash 50 ml Búfer de lavado, concentración 20x; con fosfato Control + Tapa roja 2 ml Control positivo, listo para su uso; suero o plasma humanos diluidos; color amarillo Control Tapa azul 2 ml Control negativo, listo para su uso; suero o plasma humanos diluidos; color amarillo Cut-off Tapa verde 3 ml Control de corte, listo para su uso; suero o plasma humanos diluidos; color amarillo Conjugate Tapa negra 20 ml Conjugado de anti IgG/anti IgM humana, listo para su uso; Conjugado peroxidasa y anticuerpos, color azul Substrate Tapa amarilla 15 ml Substrato, listo para su uso; H 2 O 2 /tetrametilbenzidina; listo para su uso Stop Tapa roja 15 ml Reactivo de parada 0,2 mol/l de ácido sulfúrico; listo para su uso La información sobre sustancias peligrosas cumple con los requisitos del etiquetado. Para más información, consultar las hojas de datos de seguridad (SDS) en 5. Instrucciones de almacenamiento El kit de ensayo puede utilizarse hasta la fecha de caducidad impresa en la etiqueta cuando se almacena a 2-8 C. El búfer de lavado diluido tiene una vida útil de cuatro semanas cuando se almacena a 2-8 C, y de cinco días cuando se almacena a temperatura ambiente (20-25 C). Una vez alcanzada la fecha de caducidad, no es posible garantizar la calidad. Abrir la bolsa de aluminio que contiene la placa de microtitulación sin que se rompa el precinto de seguridad. Almacenar las tiras de microtitulación que no se necesiten en la bolsa de aluminio cerrada. Evitar la contaminación de los reactivos y proteger el substrato incoloro de la luz directa. RIDASCREEN Malaria Ab-Screening

4 6. Reactivos necesarios no suministrados 6.1. Reactivos Agua destilada o desionizada 6.2. Accesorios Viales de muestras Incubadora a 37 C Mezclador de vórtice Micropipetas para volúmenes de µl y µl Probeta graduada (1000 ml) Equipo de limpieza para placas de microtitulación o pipetas multicanal Fotómetro para placas de microtitulación (450 nm, filtro de referencia 620 nm) Papel de filtro (toallitas de laboratorio) Recipiente para residuos con solución de hipoclorito al 0,5 % 7. Advertencias y precauciones para los usuarios Para diagnóstico in vitro exclusivamente. Este ensayo solo debe llevarlo a cabo personal de laboratorio capacitado. Respetar las directrices para el trabajo en laboratorios médicos. Deben seguirse estrictamente las instrucciones de uso para realizar este ensayo. No pipetear las muestras ni los reactivos con la boca. Evitar el contacto con heridas de la piel o membranas mucosas. Llevar equipo de protección personal (guantes, bata de laboratorio, gafas de protección adecuados) al manipular los reactivos y las muestras, y lavarse las manos después de finalizar el ensayo. No fumar, comer ni beber en las zonas donde se manipulen las muestras. Para más información, consultar las hojas de datos de seguridad (SDS) en Los sueros de control presentes en el kit (control positivo, control de corte y control negativo) se analizaron para detección del anticuerpo del VIH, el anticuerpo del VHC y el antígeno de superficie de la hepatitis B, y dieron resultado negativo. Aún así, deberían tratarse como potencialmente infecciosos, al igual que las muestras del paciente y todos los materiales que toque, y deben manipularse de acuerdo con lo establecido en las normativas de seguridad nacionales correspondientes. Los usuarios son responsables de desechar de forma correcta todos los reactivos y los materiales después del uso. Se debe cumplir la normativa nacional aplicable a la hora de desecharlos RIDASCREEN Malaria Ab-Screening

5 8. Recogida y almacenamiento de muestras Este ensayo se ha diseñado para analizar las muestras de suero y plasma humanos. Tras la recogida de sangre, el suero debe separarse del coágulo lo antes posible para evitar hemólisis. Las muestras deben conservarse en frío o congeladas hasta el momento de realizar el ensayo. No congelar y descongelar la muestra repetidamente, para evitar la contaminación microbiana. El uso de muestras termoinactivadas, lipémicas, hemolíticas, ictéricas o turbias puede dar lugar a resultados falsos. Tabla 2: Almacenamiento de muestras Suero o plasma sin diluir Suero o plasma diluidos 2-8 C -20 C 2-8 C 1 semana > 1 semana 7 horas 9. Procedimiento de ensayo 9.1. Información general Antes del uso, todos los reactivos y las tiras de microtitulación deben alcanzar la temperatura ambiente (20-25 C). Una vez que hayan alcanzado la temperatura ambiente, extraer las tiras de microtitulación de la bolsa de aluminio. Mezclar bien los reactivos inmediatamente antes del uso. Tras el uso, almacenar rápidamente el kit a 2-8 C de nuevo. Utilizar solo los reactivos necesarios para realizar el ensayo. No devolver el reactivo restante al envase, ya que esto puede provocar contaminación. Las tiras de microtitulación no pueden usarse más de una vez. No utilizar reactivos ni tiras de microtitulación si el envase está dañado o los recipientes no se han cerrado herméticamente Preparación del búfer de lavado Mezclar 1 parte de búfer de lavado concentrado Wash con 19 partes de agua destilada. Para ello, añadir 50 ml de concentrado a una probeta de 1000 ml y llenar hasta 1000 ml con agua destilada. Calentar previamente el concentrado (baño maría a 37 C) para disolver los posibles cristales presentes. El búfer de lavado diluido se conserva durante cinco días cuando se almacena a temperatura ambiente (20-25 C). RIDASCREEN Malaria Ab-Screening

6 9.3. Preparación de la muestra Las muestras de suero o plasma que vayan a analizarse deben diluirse con el diluyente de muestras Diluent antes de iniciar el ensayo. Por ejemplo, 10 µl de suero + 1 ml de diluyente Diluent Atención! El control de corte, el control negativo y el control positivo están listos para su uso y no deben diluirse Primera incubación Insertar un número suficiente de cavidades en el soporte y, a continuación, pipetear 100 ml de cada uno de los sueros diluidos y los controles Control -, Control + y de corte Cut-off listos para su uso en los pocillos correspondientes, excepto a A1 (valor de blanco del substrato). Se recomienda realizar el control de corte Cut-off por duplicado. La placa se incubará en una incubadora durante 60 minutos a 37 C. La base de los pocillos no debe entrar en contacto con materiales capaces de conducir el calor fácilmente. La placa de microtitulación debe cubrirse con la lámina protectora suministrada durante la incubación. A1 B1 C1 D1 E1 Valor de blanco del substrato Control negativo Control de corte Control de corte Control positivo F1, G1 Suero del paciente 1, 2, etc. Atención! No coloque la placa de microtitulación en un recipiente de incubación frío que no se vaya a calentar a 37 C hasta que se esté realizando la incubación. El recipiente debe adaptarse a 37 C previamente Lavado Vaciar los pocillos en un recipiente para residuos que tenga una solución de hipoclorito para desinfección. A continuación, dar golpecitos a la placa sobre papel absorbente para eliminar la humedad residual. Después, lavar la placa tres veces con 300 µl de búfer de lavado cada vez. Tras cada lavado, dar golpecitos a la placa sobre una sección del papel no utilizada para garantizar un vaciado completo. Cuando se utilice una máquina de lavado, asegurarse de que la máquina esté correctamente configurada para el tipo de placa. Tras el lavado, dar golpecitos a la placa sobre papel absorbente limpio para eliminar la humedad residual RIDASCREEN Malaria Ab-Screening

7 9.6. Segunda incubación Añadir 100 µl de conjugado Conjugate a todos los pocillos, excepto a A1 (valor de blanco del substrato). A continuación, incubar la placa durante 30 minutos a temperatura ambiente (20-25 C). La placa de microtitulación debe cubrirse con la lámina protectora suministrada durante la incubación Lavado Lavar tres veces como se describe en el punto Tercera incubación Añadir 100 µl de substrato Substrate a todos los pocillos, incluido A1 (valor de blanco del substrato). A continuación, incubar la placa durante 15 minutos a temperatura ambiente (20-25 C) a oscuras. Después, añadir 100 µl de reactivo de parada Stop a todos los pocillos para detener la reacción, lo que hace que el color cambie de azul a amarillo. Tras mezclar cuidadosamente la placa (dando golpecitos suaves en un extremo de la placa), la extinción se medirá en un fotómetro para placas a 450 nm (longitud de onda de referencia 620 nm). La comparación del valor nulo se efectúa con el valor de blanco del substrato (posición A1). 10. Control de calidad: indicación de inestabilidad o deterioro de los reactivos A efectos de control de calidad, deben realizarse los controles positivo, negativo y de corte cada vez que se efectúe el ensayo. El control de corte se realiza por duplicado y el valor promedio se determina a partir de dos mediciones individuales. El ensayo se ha realizado correctamente cuando los valores de extinción (DO) de los controles cumplen los siguientes criterios: Tabla 3: Criterios para control de calidad DO Valor de blanco del substrato < 0,100 Control negativo Control de corte 0,150-1,300 Control positivo < 0,200 y < valor de corte > valor de corte Una desviación de los valores previstos, así como la turbiedad o coloración azul del substrato incoloro antes de la adición a los pocillos, pueden ser un indicador de un reactivo caducado. RIDASCREEN Malaria Ab-Screening

8 Si los valores especificados no se cumplen, comprobar lo siguiente antes de repetir el ensayo: Fecha de caducidad de los reactivos utilizados Rendimiento funcional de los equipos utilizados (p. ej., calibración) Ejecución correcta del ensayo Control visual de los componentes del kit para detectar contaminación o pérdidas. Las soluciones de substrato de color azul ya no deben utilizarse. Si, tras repetir el ensayo, las condiciones siguen sin cumplirse, se deberá contactar al fabricante. 11. Evaluación e interpretación Cálculo del índice de la muestra 1. Se calcula el valor de extinción promedio del control de corte. 2. Dividir la extinción de la muestra del paciente por el valor de extinción promedio calculado para el control de corte. Por ejemplo: Control de corte 1 DO = 0,440 Control de corte 2 DO = 0,420 Valor promedio: = 0,430 Muestras DO = 1,591 Índice de la muestra = 1,591 x10 = 37 0,430 Tabla 4: Análisis del índice de la muestra Negativo Límite Positivo Índice de la muestra < > Limitaciones del método RIDASCREEN Malaria Ab-Screening Elisa detecta los anticuerpos IgG e IgM contra Plasmodium spp. No se puede establecer una conexión entre la cantidad del valor de extinción medido y la presencia o intensidad de los síntomas clínicos. Los resultados obtenidos deben interpretarse siempre en combinación con el cuadro y los síntomas clínicos. Un resultado negativo no permite descartar la existencia de infección. Durante la primera etapa de la infección, la producción de anticuerpos puede ser todavía tan baja que la prueba de anticuerpos dará negativo. Por tanto, si existe sospecha clínica, debe ensayarse una muestra de suero de seguimiento RIDASCREEN Malaria Ab-Screening

9 Por norma general, en las pruebas serológicas deben analizarse dos sueros consecutivos del paciente para mejorar la validez del diagnóstico. Para la interpretación de un resultado es muy importante la evolución del título. Un resultado positivo no permite descartar la presencia de otro patógeno infeccioso como causa de una enfermedad. No pueden excluirse reactividades cruzadas con anticuerpos contra otros protozoos, como Trypanosoma, Leishmania y Toxoplasma. 13. Características de rendimiento Tabla 5: Varianza interensayo (n = 12) Varianza interensayo U/ml CV Suero 1 26,2 5,1 % Suero 2 22,7 7,2 % Suero 3 6,2 11,5 % Tabla 6: Varianza intraensayo (n = 24) Varianza intraensayo DO CV Suero 1 0,456 10,2 % Suero 2 1,072 2,7 % Suero 3 0,931 4,5 % Tabla 7: Sensibilidad y especificidad Sensibilidad 95,9 % Especificidad 97,5 % RIDASCREEN Malaria Ab-Screening

10 14. Historial de versiones Número de versión Capítulo y designación Versión de lanzamiento Control de calidad: indicación de inestabilidad o deterioro de los reactivos 15. Explicación de los símbolos Símbolos generales Para el diagnóstico in vitro Consulte las instrucciones de uso Número de lote Caducidad Temperatura de almacenaje Número de producto Número de ensayos Fecha de fabricación Fabricante Símbolos específicos del ensayo Plate Diluent Wash Control + Control - Cut-off Conjugate Substrate Stop Placa de pocillos Diluyente de muestras Búfer de lavado Control positivo Control negativo Control de corte Conjugado de anti IgG/anti IgM humana Substrato Reactivo de parada RIDASCREEN Malaria Ab-Screening

11 16. Bibliografía 1. Bruce-Chwatt, L. J. (1982): Transfusion malaria revisited. In Tropical diseases bulletin 79 (10), pp Chiodini, P. L.; Hartley, S.; Hewitt, P. E.; Barbara, J.A.; Lalloo, K.; Bligh, J. Voller, A. (1997): Evaluation of a malaria antibody ELISA and its value in reducing potential wastage of red cell donations from blood donors exposed to malaria, with a note on a case of transfusion-transmitted malaria. In Vox sanguinis 73 (3), pp Dodd, R. Y. (1998): Transmission of parasites by blood transfusion. In Vox sanguinis 74 Suppl 2, pp Doderer, C.; Heschung, A.; Guntz, P.; Cazenave, J-P.; Hansmann, Y.; Senegas, A. et al. (2007): A new ELISA kit which used a combination of Plasmoid falciparum extract and recombinant Plasmodium vivax antigens as an alternative to IFAT for detection of malaria antibodies. In Malaria journal 6, p.19. DOI: / Hoffmann, S. L.; Campell, C.; White, N. J. (2006): Malaria. In Richard L. Guerrant, David H. Walker, Peter F. Weller (Eds.): Tropical infectious diseases. Principles, pathogens & practice. 2 nd ed. Philadelphia: Churchill Livingstone, pp RIDASCREEN Malaria Ab-Screening