Epidemiología y diagnóstico

Epidemiología y diagnóstico de la tuberculosis bovina J. Álvarez, L. de Juan, B. Romero, E. Castellanos, J. Bezos, S. Rodríguez, A. Aranaz, A. Mateos, L. Domínguez Laboratorio Vigilancia Sanitaria (VISAVET) Departamento de Sanidad Animal Facultad de Veterinaria Universidad Complutense de Madrid

Género Mycobacterium > 50 especies bacterianas M.a.p

- Ambientales (suelo, agua) - Patógenas: rango de hospedadores Animales homeotermos y poiquilotermos Tuberculosis, lepra, paratuberculosis, peces, tortugas, t serpientes, etc.

Complejo Mycobacterium tuberculosis: M. bovis M. caprae M. tuberculosis M. africanum M. pinnipedii M. Microti M. bovis BCG Tuberculosis bovina Enfermedad en los bovinos causada por cualquiera de las especies incluidas dentro del complejo M. tuberculosis Complejo Mycobacterium avium (MAC): M. a. paratuberculosis Paratuberculosis M. a. avium Tuberculosis aviar M. a. silvaticum M. a. hominissuis M. intracellulare

Tuberculosis y Paratuberculosis - Enfermedades de curso crónico - Parásitos intracelulares - Transmisión: -Fecal-oral (PTB) / Aerógena (TBC) -Otras: leche, semen, vertical, ambiente Diagnóstico: 1. Clínico 2. Inmunológico - Base celular: IDTB, γ-ifn - Base humoral: serología 3. Anatomopatológico (matadero) 4. Microbiológico

1) Diagnóstico clínico Enfermedad consuntiva Emaciación ió Diarrea (variable)

Lesiones Tuberculosis (granulomas)

Lesiones Paratuberculosis Hipertrofia linfonodos Granulomas caseosos/calcificados Linfangiectasia

2) Diagnóstico inmunológico Re espuest ta inmu une Ba acilos Inmunidad celular Inmunidad d humoral Ba acilos Tiempo - Inmunidad de base celular - Intradermotuberculinización (IDTB): simple / comparada - Técnica de gamma-interferon - Inmunidad de base humoral: Detección de anticuerpos

21 2.1. IDTB simple Calidad de la tuberculina contrastación t Buena praxis sensibilidad individual Interpretación standard Imprescindible para clasificar rebaños Resultado Medida (mm) Signos clínicos Negativo 2 NO Dudoso >2 y <4 NO Positivo 4 y/o SÍ En ciertas circunstancias los animales dudosos se consideran positivos Especificidad falsos positivos exposición a micobacterias no tuberculosas (ej. Complejo M. avium). Solución IDTB comparada

2.2. IDTB comparada - Técnica de aplicación - Lectura - Interpretación standard: Resultado Negativo Dudoso Positivo Interpretación Reacción negativa a la tuberculina bovina o reacción positiva o dudosa a la tuberculina bovina pero igual o inferior a una reacción positiva o dudosa a la tuberculina aviar, con ausencia de signos clínicos. Reacción a la tuberculina bovina positiva o dudosa y superior en 1 a 4 mm a la reacción a la tuberculina aviar, con ausencia de signos clínicos. Reacción a la tuberculina bovina superior en más de 4 mm a la reacción a la tuberculina aviar o presencia de signos clínicos. En ciertas circunstancias los animales dudosos se consideran positivos - Permite discriminar paratuberculosis u otras micobacterias en rebaños sin tuberculosis - Ojo! En rebaños con infección mixta disminuye la sensibilidad

Factores que interfieren en la detección de animales enfermos: 1. Mala realización de la prueba: - incorrecta dosis de inoculación - errores en medida de piel pre y post-inyección - fallos en identificación de animales - tuberculinas en mal estado - repeticiones del test, ) 2. Animales en estado prealérgico. 3. Animales en estado de anergia. 4. Coinfecciones con otras enfermedades que depriman el sistema inmune. 5. Tratamientos con inmunosupresores. 6. Vacunación frente a la paratuberculosis.

7. Infección con micobacterias del complejo M. avium. Tuberculosis + Paratuberculosis (M. bovis + M.a.paratuberculosis) respuesta inmune anergia inmunitaria Interferencia en el rendimiento de la IDTB comparada (no reacción más intensa con la PPD aviar)

2.3. Técnica de gamma-interferon Fun ndame ento de la téc cnica GIFN linfocito T macrófago Cultivo in vitro de la sangre Plasma * EIA

Dispensar sangre γ-ifn: Bovigam Estimular sangre PPDbov PPDaviar Incubar sangre PBS PBS Recoger plasma Positivo: (PPD bov PBS) 0,05; PPD bov > PPD aviar Reactor aviar: PPD av PBS) 0,100; PPD aviar > PPD bovina

γ-ifn: Bovigam - Prueba complementaria - Recomendado por la Task Force en situaciones de alta prevalencia Ventajas de la técnica: - Detecta animales en una fase de infección más temprana detecta una mayor proporción de animales. - Interpretación menos subjetiva e influenciable por causas que interfieren con la IDTB. - Obtención de valor numérico (definición de punto de corte).

Puntos críticos de γ-interferon γ-ifn: Bovigam - Efecto de la potencia de las PPDs - Calidad de la sangre - Transporte de la sangre - Tiempo entre extracción y estimulación - Duplicados - Mitógenos - Tiempo transcurrido desde la última tuberculinización - Estado fisiológico de los animales - Fenol Hay que estandarizar la técnica!!!

6. Detección de anticuerpos Técnica de ELISA

3) Diagnóstico postmortem en matadero - En algunas CCAA 50% de casos nuevos se detectan en matadero

4) Diagnóstico microbiológico - Imprescindible confirmar la infección mediante cultivo - Cultivo más sensible que lesiones (lesión-, cultivo+) - Permite estudios epidemiológicos Ziehl-Neelsen Auramina

- Homogeneización de la muestra Cultivo - Medios de cultivo: TBC: Coletsos, Löwenstein-Jensen - Descontaminación HPC PTB: HEYM, Middlebrook 7H11, LJ TBC 0,75% 1h / PTB 1,5% 18h (+ micobactina)

M. bovis M.a.p PCR Múltiplel Identificación Género Mycobacterium Complejo Mycobacterium tuberculosis p j y Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis

Caracterización molecular: DVR-spoligotyping M. bovis spb-4 spb-13 spb-23 M. tuberculosis spt-1 M. caprae spc-3 spc-2 spc-3

Tbc Epidemiología Investigación tradicional + tipificación molecular Spc Spc Spb Spb Spc Spb Spb Spb

Convenio de colaboración Estudio y aplicación de nuevas técnicas de diagnóstico como apoyo a los programas nacionales de erradicación de enfermedades de los animales y su estudio y caracterización en fauna silvestre Ministerio de Agricultura, Pesca y Alimentación Dirección General de Ganadería Subdirección General de Sanidad Animal Junta de Castilla y León Consejería de Agricultura y Ganadería Universidad Complutense de Madrid Laboratorio de Vigilancia Sanitaria

Convenio MAPYA-UCM Desarrollo convenio Asesoría científica y técnica Asesoramiento Ministerio & CCAA. Formación F de personal. Conferencias de formación. Asesoría a explotaciones ganaderas bovinas y caprinas. Envío de cepas de micobacterias para la puesta a punto de la técnica de PCR/DVR-spoligotyping. Interpretación de resultados obtenidos mediante pruebas inmunológicas. Recogida de muestras biológicas en mataderos autorizados.

Evolución Castilla y León Prevalencia rebaño (%)

8 7 5 5,35 Incidencia en animales 4,57 Prevalencia en rebaño 6 4 3 2 1 138 1,38 126 1,26 3,44 2,49 2,81 2,11 2,24 Campaña de saneamiento falsos negativos sensibilidad de pruebas 2,14 1,8 1,52 1,78 0,89 0,75 0,66 0,58 0,52 0,47 0,4 0,31 0,42 0 1996 1997 1998 1999 2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006

Diagnóstico en 4 situaciones posibles: TBC 1. Explotación con tuberculosis y paratuberculosis. PTB 2. Explotación con paratuberculosis y sin tuberculosis. PTB TBC 3. Explotación con tuberculosis y sin paratuberculosis. 4. Explotación sin tuberculosis y sin paratuberculosis.

TBC PTB Tuberculosis y paratuberculosis Pruebas diagnósticas in-vivo Tuberculosis IDTB comparada 17+ 201- Detección de IFN-γ 118+ 100- Paratuberculosis Parachek 102+ 116- n= 218 Análisis post-mortem Inspección macroscópica 32+ 186- Cultivo microbiológico de M. bovis 48+ 170-

TBC PTB Sensibilidad y especificidad de las pruebas diagnósticas: IDTB comp. Sensibilidad = 18,7% (9/48) Especificidad = 95,3% Sensibilidad = 77,1% (85,4% sin aviar) IFN-γ γ (0,05) Especificidad = 67,1% (54,7% sin aviar) IDTB comp + IFN-γ (0,05) Sensibilidad = 81,2% (87,5% ) Especificidad = 64,7% (52,4%) Interpretación severa IDTB

TBC PTB Animales TBC+/PTB- (n=30) Animales TBC+/PTB+ (n=18) IDTB comp. S = 26,7% IDTB comp. S = 5,5% IFN-γ γ S = 90% (93,3%) IFN-γ γ S = 55,6% (72,2%) IDTB comp+ifn-γ S=96,7% (96,7%) IDTB comp+ifn-γ S=55,6% (72,2%) En zonas endémicas de tuberculosis y paratuberculosis la aplicación de pruebas comparadas disminuyei la sensibilidad d de las pruebas. Progreso lento de erradicación de la tuberculosis. Calificación de rebaños infectados fuente de infección.

PTB Paratuberculosis sin tuberculosis 2 saneamientos separados por 6 meses (IDTBs y IFN-γ) Primer saneamiento: 627 animales analizados IDTB: Interpretación IDTB Positivo Dudoso Negativo Standard Simple 4 17 606 Comparada 1 16 610 Severa Simple 21 606 Comparada 17 610 IFN-γ: 66+ (121+ sin PPD aviar) Cultivo: 21 animales sacrificados C.tbc: Neg! C.ptb: 1+

PTB Paratuberculosis sin tuberculosis 2 saneamientos separados por 6 meses (IDTBs y IFN-γ) Segundo saneamiento: 555 animales analizados IDTB: IDTB simple: 3+ IDTB comp: 1d IFN-γ: 47+ (137+ sin PPD aviar) Cultivo: 10 animales sacrificados C.tbc: Neg! C.ptb: Neg Imprescindible realizar técnicas comparadas y cultivo!!!

Diagnóstico en un rebaño con una infección mixta de tuberculosis y paratuberculosis Tabla 1. Resultados de cultivo (n=163) Resultados de cultivo Map + Map - Total M. caprae + 24 107 131 M. caprae - 6 26 32 Total 30 133 163

Animales con tuberculosis (n=131) IDTB simple Vs. IDTB comparada IDTB COMP+ IDTB COMP - Total IDBT SIMPLE+ 50 32 82 (S=82.6%) IDTB SIMPLE- 0 49 49 Total 50 (S=38.2%) 81 N=131 Animales TBC+/PTB- (n=61) IDTB COMP+ IDTB COMP - Total IDBT SIMPLE+ 27 17 44 (S=72.1%) IDTB SIMPLE- 0 17 17 Total 27 (S=44.2%) 34 N=61 Animales TBC+/PTB+ (n=24) IDTB COMP+ IDTB COMP - Total IDBT SIMPLE+ 6 5 11 (S=45.8%) IDTB SIMPLE- 0 13 13 Total 6 (S=25%) 18 N=24

IDTB simple Vs. IDTB comparada Animales con tuberculosis (n=131) Dif. Bov. 18 16 14 12 10 8 6 No detectados mediante IDTB comparada!!! 4 2 0 Detectados por IDTB simple + IFNγ 0 2 4 6 8 10 12 14 16 Dif. Aviar. Detectados por IDTB simple!!!

Tabla 2. Sensibilidad de las pruebas y falsos positivos (n=163) Prueba diagnóstica Positivos Sensibillidad Falsos positivos TP a % FP b % IDTB simple (interpretación severa) 105 82 62.66 23 71,9 IDTB comparada (interpretación severa) 63 50 38.2 13 40,6 IDTB comparada (interpretación ultra-severa) 92 72 55,0 20 62,5 Standard IFN-γ (punto corte: 0,1) 86 76 58 10 31,2 Standard IFN-γ (no avian PPD) c 90 79 60,3 11 34,44 Severa IFN-γ (punto corte: 0,05) 109 93 71 16 50 Severa IFN-γ γ (no avian PPD) c 114 96 73,3 18 56,2 Parachek d 75 24 e 70,6 51 f 53,1 a Animales cultivo positivo de M. caprae. b Animales cultivo negativo de M. caprae. c Resultados obtenidos sin tener en cuenta los resultados de la estimulación con PPD aviar. d Valores calculados sin incluir los animales con cultivo contaminado. e Animales cultivo positivo de M.a.p. f Animales cultivo negativo de M.a.p.

Table 3. Sensibilidad y falsos positivos combinando las pruebas diagnósticas Pruebas diagnósticas en paralelo Positivos Sensibilidad Falsos positivos TP a % FP b % IDTB simple severa + Standard IFN-γ 138 113 86,2 25 78,1 IDTB simple severa + Standard IFN-γ (no av PPD) c 140 114 87 26 81,2 IDTB simple severa + Severa IFN-γ 145 117 89,3 28 87,0 IDTB simple severa + Severa IFN-γ (no av PPD) c 147 118 90,1 29 90,6 IDTB comparada severa + Standard IFN-γ 117 98 74,8 19 59,4 IDTB comparada severa + Standard IFN-γ (no av PPD) c 120 100 76,3 20 62,5 IDTB comparada severa + Severa IFN-γ 130 107 81,7 23 71,9 IDTB comparada severa + Severa IFN-γ (no avian PPD) c 133 109 83,2 24 75 IDTB comparada ultra-severa + Standard IFN-γ 133 110 84 23 71,9 IDTB comparada ultra-severa + Standard IFN-γ (no av PPD) c 135 111 84,7 24 75 IDTB comparada ultra-severa + Severa IFN-γ 143 116 88,5 27 84,4 IDTB comparada ultra-severa + Severa IFN-γ (no av PPD) c 145 117 89,3 28 87,5 a Animales cultivo positivo de M. caprae. b Animales cultivo negativo de M. caprae. c Resultados obtenidos sin tener en cuenta los resultados de la estimulación con PPD aviar.

Tabla 4. Cultivo microbiológico: sensibilidad y falsos positivos. Tbc+/Ptb- Tbc+/Ptb+ Prueba diagnóstica (n=61) (n=24) IDTB simple severa S = 0,72 S = 0,46 IDTB comparada severa S = 0,44 S = 0,25 IDTB comparada ultra-severa S = 0,62 S = 0,42 Standard IFN-γ (0,1) S = 0,47 S = 0,58 Severa IFN-γ (0,05) S = 0,72 S = 0,67 IDTB simple severa + Standard IFN-γ S = 0,88 S = 0,75 IDTB simple severa + Severa IFN-γ S = 0,93 S = 0,79 IDTB comparada severa + Standard IFN-γ γ S = 0,72 S = 0,71 IDTB comparada severa + Severa IFN-γ S = 0,85 S = 0,75 IDTB comparada ultra-severa + Standard IFN-γ γ S = 0,85 S = 0,75 IDTB comparada ultra-severa + Severa IFN-γ S = 0,93 S = 0,79 Parachek FP = 0,59 S = 0,71

Programa de control - Factores a tener en cuenta -Estado de infección del rebaño -Técnicas sensibles de diagnóstico para detectar todos los animales infectados - Animales salvajes. - Otros reservorios -Vacunación de paratuberculosis. - Vías de transmisión de la enfermedad y etapa más susceptible. - Interferencia diagnóstica por otras micobacterias: infecciones mixtas. - Características de la explotación - Colaboración activa del ganadero/trabajadores.

Bases del programa de control en cabras 1. Instauración de pautas estrictas de control y manejo. 2. Análisis periódico de todo el rebaño mediante pruebas inmunológicas: Intradermotuberculinización t i ió gamma-interferon serología paratuberculosis 3. Separación física de animales positivos y negativos. 4. Estudio microbiológico. 5. Separación de los animales recién nacidos.

Muchas gracias VISAVET Fac. Veterinaria U.C.M. visavet@vet.ucm.es (+ 34) 913944083 (+ 34) 913943795