TIPADO DE VPH: EXPERIENCIA EN ARAGÓN Dr. Dr. Rafael Benito Ruesca. Departamento de Microbiología. Facultad de Medicina. Servicio de Microbiología. Hospital Clínico Universitario Lozano Blesa. Zaragoza. El cáncer de cérvix es la consecuencia a largo plazo de una ITS no resuelta producida por ciertos tipos de VPH. La infección por VPH es muy frecuente, subclínica de corta duración y se pueden producir reinfecciones. El VPH es causa necesaria pero no suficiente de este tipo de cáncer. Los tipos de VPH por su relación con cáncer anogenital se Dr. R. Benito clasifican en (1): De alto riesgo (AR) (22): 16, 18, 26, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 53, 56, 58, 59, 66, 67, 68, 69, 70, 73, 82, 85. Y de bajo riesgo (BR) (20): 6, 11, 32, 40, 42, 44, 54, 55, 61, 62, 64, 71, 72, 74, 81, 83, 84, 87, 89, 91. Son varios los métodos de diagnóstico microbiológico de VPH (2): Cribado basado en la detección de ADN de VPH AR: Hibridación. PCR. LAMP. Tecnología con sondas invader. Cribado por detección de ADN de VPH AR y tipos 16 y 18. Genotipado por detección de ADN de VPH: PCR y LAMP Hibridación reversa en line-blot. Microarray. Array en suspensión. PCR. Secuenciación. Cribado por detección de ARNm de E6/E7 de VPH AR: NASBA.
La técnica básica usada por el autor es la siguiente: Muestra Extracción y purificación Amplificación del ADN Visualización Extracción y purificación de ADN Citología medio líquido Hisopo Tejido en parafina Hibridación de ADN con primers específicos. Enzimas de restricción y electroforesis en gel. Hibridación sondas específicas: placa, array, tira. Secuenciación. Dentro de las PCR, el autor utiliza la PCR en matrices (array) de Genómica - CLART HPV2-, que detecta 20 genotipos de alto riesgo y 15 de bajo riesgo: Microarray con 120 improntas con sondas de cadn. Adición del amplicón (marcado con biotina durante la PCR) al microarray. Hibridación del amplicón marcado con las sondas del microarray. Adición de conjugado estreptavidinaperoxidasa. Este se une a los amplicones por la reacción entre estreptavidinabiotina. Reacción de la peroxidasa del conjugado con TMB y aparición de un producto insoluble que precipita en los sitios de hibridización del array.
Esta técnica de Genómica emplea PCR multiplex y posterior visualización mediante tecnología CLART, basada en arrays de baja densidad. Permite, además, detectar infecciones múltiples en una única muestra lo que facilita el seguimiento de las pacientes a largo plazo. El test validado para la detección de los diferentes genotipos de papiloma presentes en las siguientes muestras: Citología líquida. Torunda. Tejido incluido en parafina. Detecta los siguientes genotipos: Alto Riesgo (AR) (20): 16, 18, 26, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 53, 56, 58, 59, 66, 67, 68, 69, 70, 73, 82 y 85. Bajo Riesgo (BR) (15): 6, 11, 32, 40, 42, 43, 44, 54, 55, 61, 62, 64, 71, 72, 74, 81, 83, 84, 87, 89 y 91. Utilidad del genotipado del VPH. Sirve para: Pronóstico: Algunos tipos tienen > riesgo oncológico y mortalidad. Diagnosticar persistencia. Diferenciar persistencia de reinfección. Diagnóstico de infecciones mixtas. Estudios epidemiológicos. Evaluar el potencial oncológico de los distintos genotipos. Detectar tipos de VPH BR en carcinomas. Evaluación de eficacia de vacunas profiláctica. Evaluación de la eficacia terapéutica. Caracterización de poblaciones en ensayos con vacunas.
El VPH en Aragón Características de la población: Periodo de estudio: 2003-2013 Muestras: 8088 Mujeres: 7901 (97,69%) Muestras cervicales: 7647 (94,55%) Origen: España: 6671 (82,49%) Otros países: 1417 (17,51%) Edad: 11-25 a: 1426 26-35 a: 2701 36-45 a: 2039 46-55 a: 1238 56-65 a: 306 > 65 a: 80 Desconocida 298 Distribución por países País nº País nº País nº País nº Alemania 2 Colombia 95 Honduras 7 Noruega 1 Angola 2 Costa Marfil 2 Hungría 2 Pakistán 2 Argelia 26 Cuba 5 Indonesia 1 Palestina 1 Argentina 9 Dominica 1 Israel 1 Paragua 4 Bélgica 1 Ecuador 143 Italia 4 Perú 24 Bielorusia 1 EEUU 2 Jordania 1 Polonoa 15 Bolivia 9 Eslovenia 5 Liberia 1 Portugal 14 Brasil 40 Francia 9 Lituania 3 R.Dominicana 32 Bulgaria 51 Gambia 10 Mali 1 Rumanía 575 Burkina Faso 2 Georgia 1 Marruecos 77 Rusia 26 Cabo verde 1 Ghana 12 Méjico 9 Senegal 8 Camerún 6 G. Btrtaña 5 Moldavia 3 Suiza 3 Chequia 4 Guninea B. 2 Mozambiqe 1 Ugrania 15 Chile 9 Guinea B. 3 Nicaragua 40 Uruguay 5 China 13 Guinea E. 21 Nigeria 11 Venezuela 23 Resultados de infección Muestras totales (8088) Número % Positivas 2649 32,75 Infecciones tipo Gardasil 1448 54,66 Infecciones tipo Cervarix 891 33,63 Infecciones múltiples 1041 39,30 Infecciones múltiples tipo no Gardasil 450 16,98 Infecciones España 31,34 Infecciones no España 39,65
Tipos de VPH en Aragón (2003-2013) Tipo Número Tipo Número 9 49 56 83 11 138 1449/2649 58 223 16 716 (57,70%) 59 100 18 175 61 202 26 15 62 110 31 252 66 236 33 124 68 148 35 60 70 108 39 51 71 16 40 20 72 21 42 56 73 4 43 0 81 78 44 32 82 100 45 45 83 55 51 325 84 108 52 199 85 13 53 258 89 4 54 49 Total HPV 4543 Evolución temporal de los tipos incorporados en las vacunas Años 2003-2007 2003-2009 2003-2010 2003-2013 Tipo Nº % Nº % Nº % Nº % 6 137 244 275 419 11 40 79,73 84 67,20 98 62,52 138 54,66 16 210 347 439 716 18 77 118 129 175 Influencia de los datos demográficos Periodo/años 2003-2007 2003-2009 2003-2010 2003-2013 Total casos 1569 3465 4448 8088 Edad <25 228 548 717 1426 26-35 449 1008 1348 2701 36-45 465 899 1165 2039 46-55 282 634 789 1238 56-65 81 145 175 306 <65 22 34 44 80 Desconocida 42 157 230 298 Sexo Varón 40 (2,55%) 98 (2,82%) 144 (2,56%) 187 (2,31%) Origen No España 191 (12,17%) 483 (13,92% 681 (15,31%) 1416 (17,50%)
Carga de trabajo de microbiología En conclusión: El tipado de VPH es importante desde los puntos de vista: Clínico y Epidemiológico. Bibliografía (1) Dunne E et al. Prevalence of HPV infection among females in the United States. JAMA 2007; 297: 813-819. (2) Rodríguez-Iglesias M. Diagnóstico molecular del papilomavirus humano: nuevos desafíos en un escenario diferente. Enferm Infecc Microbiol Clin 2012; 30: 223-224.