20% Euro-SA West Africa Ea st Africa SEA Ca thay ME-S A 20 18 16 14 12 10 8 6 4 Percentage nucleotide diff erence - complete VP 1 (639 nt) UPGMA tree 2 O/ALG/1/99 O/G HA/5/93 O/KEN/83/79 O/UGA/5/96 O /B HU/ 1/ 98 O/IRN/16/2 000 O/IRQ/30/2 000 O/SAU/38/98 O/CAM/2/2 000 O/JPN/2 000 O/TAW/2/99 O/LAO/2/2 000 O/IRN/9/99 PanAsia O/ SKR/ 1/2 000 O/1734/Ussuri ysk/rus/2 000 O/ SAR/ 1/2 000 O/UKG/12/2 001 O/UKG/10/2 001 O/UKG/11/2 001 O/MOG/2000 O/MAY/2/2000 O /T AI/1/2 000 O1/Manisa/T UR/69 O/CAM/6/99 O/VIT/2/97 O /T AI/2/2 000 O/T AI/4/99 O/HKN/1/99 O/PHI/7/96 O/T AW/81/97 O/VIT/3/97 O1/Kaufbeuren/FRG/66 O3/VEN/51 O1/Lombardy/ITL/46 O2/Brescia/ITL/47 0 N. J. Know le s, P.R. Da vi es a nd A. R. Sa muel, 2 1 February 2001 CENTROS DE REFERENCIA DE ENFERMEDADES INFECCIOSAS CENTRO DE REFERENCIA PARA LA OIE CENTRO DE REFERENCIA PARA LA FAO L.J. Romero Coordinador RASVE. MAPA ljromero@mapya.es Santander, 25-26 de febrero de 2004 LABORATORIO COMUNITARIO DE REFERENCIA LABORATORIO NACIONAL DE REFERENCIA PARA LA UE FUNCIONES DE LOS LABORATORIOS NACIONALES DE REFERENCIA (I) FUNCIONES DE LOS LABORATORIOS NACIONALES DE REFERENCIA (II) COORDINAR NORMAS Y MÉTODOS DE DIAGNÓSTICO ENSAYOS INTERLABORATORIALES EVALUACIÓN DE TÉCNICAS Y VACUNAS CONFIRMACIÓN DE RESULTADOS DIAGNÓSTICO ETIOLÓGICO AGCCAT ACGA TCGGTA TGCT Preliminary genetic analysis of three foot-and-mouth disease type O virus isolates from Essex, UK FUNCIONES DE LOS LABORATORIOS NACIONALES DE REFERENCIA (III) FUNCIONES DE LOS LABORATORIOS NACIONALES DE REFERENCIA (IV) Proteínas recombinantes
FUNCIONES DE LOS LABORATORIOS NACIONALES DE REFERENCIA (V) FUNCIONES DE LOS LABORATORIOS NACIONALES DE REFERENCIA (VI) Laboratorio Central de Veterinaria de Algete (MAPA) Laboratorio Central de Veterinaria de Santa Fe (MAPA) Centro de Investigación en Sanidad Animal (CISA-MCyT) Departamento de Patología Animal de la Facultad de Veterinaria de Zaragoza (Univ. Zaragoza) Instituto de Investigaciones Marinas de Vigo Laboratorio Arbitral Agroalimentario Centro Nacional de Alimentación y Nutrición (MSyC) Centro Nacional de Microbiología del Instituto de Salud Carlos III - Peste Equina Africana (OIE, UE y Nacional) - Influenza Aviar - Enfermedad de Newcastle - Septicemia Hemorrágica vírica - Necrosis Hematopoyética Infecciosa - Anemia Infecciosa del Salmón - Leucosis Enzoótica Bovina - Enfermedad de Aujeszky -Salmonelosis - ETTs (pruebas rápidas) - Residuos: antitiroideos y tranquilizantes -PerineumoníaContagiosa Bovina -Tuberculosis -Brucelosis -Rabia - Residuos: antihelmínticos, anticoccidianos, carbamatos y piretroides, AINS y otros -Fiebre Aftosa - Estomatitis Vesicular - Enfermedad Vesicular del Cerdo -Peste bovina - Peste de Pequeños Rumiantes - Viruela Ovina y Caprina - Dermatosis Nodular Contagiosa - Fiebre del Valle del Rift - Lengua Azul - Peste Equina Africana - Peste Porcina Africana - Peste Porcina Clásica
Mayenne Anexo I y Anexo II de la Dec. de la Comisión de 28 de marzo (Medidas hasta el 12 de abril) Anexo I de la Dec. 2001/223/CE Anexo II de la Dec. 2001/223/CE Localización de los focos de fiebre aftosa Oise Cher Seine-et-Marne Departamentos serología + Noord-Brabant Rhone Flevoland OOSTERWOLDE (2) r TONGEREN Overijssel OENE(2) r r OLST r rwelsum KOOTWIJKERBROEK r NIJBROEK Gelderland - ETTs: Inmunohistoquímica e histopatología - Enfermedades de moluscos Residuos: - Compuestos organoclorados - Compuestos organofosforados - Elementos químicos (excepto acuicultura) Residuos: - Estilbenos -Esteroides - Resorcylic Acid Lactones -B-agonistas - Sustancias antibacterianas - Elementos químicos (sólo acuicultura) - Micotoxinas - Colorantes INSTITUTO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y TECNOLOGÍA A AGRARIA Y ALIMENTARIA. FIEBRE AFTOSA SOSPECHA CLÍNICA. DIAGNÓSTICO DIFERENCIAL r Localización de los focos r r SOSPECHAS EPIDEMIOLÓGICA r r r
Febrero 2001 Declaración de FA ESTRATEGIA FIEBRE AFTOSA Sospechas clínicas -PCR -3ABC ELISA - ELISA-FL - + -SN -AV Tipo de Muestras recibidas para diagnóstico de FA Sueros Sangre-EDTA Muestras de epitelios Hisopos Saliva 28.000 3.100 12 9 15 MUESTRAS RECIBIDAS FA-2001 8862 BOVINO OVINO 4000 Distribución n de sueros por especies animales PORCINO 15000 APLICACIÓN NUEVAS TECNOLOGÍAS FA INSTITUTO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y TECNOLOGÍA A AGRARIA Y ALIMENTARIA. -muy sensible - específico -rápido - determinación del origen de un foco - diferenciación de animales vacunados e infectados -test único para los 7 serotipos 14/06/01 (19 focos) 07/12/01 (20 focos) Provincia Nº Focos año Nº Focos Fecha Fecha Nº cerdos 2001 año 2002 primer foco último foco sacrific. Lérida 19 0 14/06/01 19/09/01 17.679 11/07/01 ( 2 focos) 18/06/01 ( 1 foco) 11/07/01 (7 focos) Castellón 1 0 18/06/01-755 Valencia 7 0 11/07/01 09/08/01 10.492 Cuenca 2 0 11/07/01 19/07/01 1.325 Barcelona 4 16 07/12/01 6/5/02 43.902 SITUACIÓN N DE LA PPC EN ESPAÑA 2001-2002 2002 TOTAL 33 16 14/06/01 06/05/02 74.153
AISLADOS DE PESTE PORCINA CLÁSICA Secuenciación de las regiones 5 NTR, NS5B y E2 Grupo 1: 1.1 1.2 Grupo 2: 2.1 2.2 2.3 Epidem. Molecular: Estudios filogenéticos E2 AGCCATACGA TCGGTATGCT VPPC: RT-PCR ARN Transcripción ADNc RT POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR) 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 M 10-4 10-6 10-1 10-2 10-3 10-5 M PCR AMPLIFICACIÓN PRIMERS dntps Taq-polimerasa ADN E2 308 bp- PPC-A/D 156 bp- Pesti-3/D x N Estudio de sensibilidad usando cepa España-2001 (10 5,6 TCID 50 /ml), en dilluciones 10 en suero. Sensibilidad primers PPC-A/D: 0,32 TCID 50 /PCR. Sensibilidad primers Pesti-3/D: 0,032 TCID 50 /PCR. 28 2dpi C+ C- C- C- 2dpi 2dpi C- C+ 2dpi 10-1 M 10-1 ELISA-Ag (Bommeli; IDEXX) 4$/muestra 308 bp- -156 bp RT-PCR Convencional (Pestivrus and CSFV primers) 5$/PCR PPC-A/D Pesti-3/D RT-PCR Capilar (Light Cycler) 7$/PCR 29 Aislamiento vírico (PK-15) 30
TARRAGONA LÉRIDA ANO IA Berguedá Bagés Ripollés Garrotxa Osona VALLÈS OCCIDENTAL Vallés Orienta l ALT PENED ÈS BARCELON ES BAIX LLOBREGAT GARR AF Selva GERONA BARCELONA COMUNIDAD AUTÓNOMA DE CATALUÑA Regionalización 06/05/2002 * Los primers Pesti-3/D tienen mayor sensibilidad. * Pooles con 10 muestras * Las muestras positivas por PCR deben ser confirmadas mediante un nuevo PCR con primers PPC-A/D y/o aislamiento * La PCR resulta más barata, sensible y * Abrir los pooles en muestras individuales y realizar nueva PCR * Análisis del amplicon por enzimas endonucleasas de restricción Hae III * Estudio de la secuencia del amplicon * Otras técnicas: PCR capilar y aislamiento vírico específica que el ELISA-Ag 31 32 >E2 Barcelona 2001 CACCACTACCTGGAAAGAATATAGCCACGGCTTGCATCTGGATGACGGGACCGTTAAGGCCGTCTGCACTGCAGGG TCCTTTAAAGTCACAGCACTTAACGTGGTTAGTAGGAGGTATCTAGCATCATTACACAAGAGGGCTTTACCCACCT CAGTGACATTTGAGCTCCTATTTGACGGGACCAACCCA >E2 Barcelona 2001, frame+2, 63 bases, 257E checksum. TTTWKEYSHGLHLDDGTVKAVCTAGSFKVTALNVVSRRYLASLHKRALPT SVTFELLFDGTNP >E2 ESPAÑA 2001 CACCACTACCTGGAAAGAATATAGCCACGGCTTGCATCTGGATGACGGAACCGTTAAGGCCGTCTGCACTGCAGGG TCCTTTAAAGTCACAGCACTTAACGTGGTTAGTAGGAGGTATCTAGCATCATTACACAAGAGGGCTTTACCCACCT CAGTGACATTTGAGCTCCTATTTGACGGGACCAACCCA >E2 ESPAÑA 2001, frame+2, 63 bases, 257E checksum. TTTWKEYSHGLHLDDGTVKAVCTAGSFKVTALNVVSRRYLASLHKRALPT SVTFELLFDGTNP MARESME PESTE ESTE PORCINA CLÁSICA VACUNAS CLÁSICAS Lapinizadas (China) Atenuadas por pases en cultivos celulares (Thiverval). DE SUBUNIDADES DE VIRUS RECOMBINANTES 33 VACUNAS CLÁSICAS PESTE PORCINA CLÁSICA UTILIZACIÓN DE VACUNAS MARCADAS Respuesta de anticuerpos VACUNA VIRUS VACUNA convencional VIRUS ENFERMEDAD VACUNA MARCADA E2 ANTICUERPOS NO DIFERENCIALES ANTICUERPOS NO DIFERENCIALES Anticuerpos no nodiferenciables E1 E2
E2 E2 DIAGNÓSTICO DIFERENCIAL VACUNADO - Erns INFECTADO VPPC VBVD VBD ELISA-Ac (Ceditest; IDEXX) Cepas Alfort-187 NADL F, Moredum, 137/4 Screening + confirmación 38 Conjugado-HRPO Muestra de suero Proteína recomb. E2 (PPC/BD) España (Año 2000) Francia (Año 2000) Italia (Año 2000) Bulgaria (Año 1999) Turquía (Año 1999) Grecia (Año 1998) Nº de focos por municipio 0 1-10 11-30 31-50 > 50 MALLORCA Ferreries MENORCA Ciutadella Mahón Alaior Es Migjorn Gran Alcudia Pollença Sta Sant LLuis Margalida Artá Capdepera Son Servera Sant Llorenç Manacor Felanitx Campos IBIZA 9 DE OCTUBRE 2000 Santany Argelia (Año 2000) Túnez (Año 1999) FORMENTERA
1400 1200 1000 Sueros Sangre-EDTA BALEARES VALENCIA ARAGÓN 1.804 6.578 6.263 101 214 14 PCR POSITIVOS (4 virus vacunal) 800 600 400 BOVINO CAPRINO OVINO 200 0 ENERO FEBRERO MARZO ABRIL MAYO JUNIO JULIO AGOSTO SEPTIEMBRE OCTUBRE* LENGUA AZUL Proteína VP7: Análisis filogenético 274bp - RT-PCR en un paso 2 4 Bal 9 Vac 11 16 20 1 M V VP7 274bp - 206bp - 68bp - Análisis de restricción con HpaII de productos amplificados TATCAC TG T A G T A G G T CT AT A AG G T C T A G T A 130 140 150 160 Baculovirus VP7 Construcción del baculovirus recombinante Bac-VP7 Recombinación homóloga Infección Baculovirus recombinantes 10 PFU/Célula Células H5 EXPRESION Y PURIFICACION DE LA PROTEINA VP7 Incubación 72-96h/28ºC De brís celular Centrifugación: 10.000g 10 min Sobrenada nte MW Cels. H5 Baculovirus Bac-VP7 VP7 Plásmido Precipitación 20% sulfato amónico Gradiente sacarosa CISA - INIA Bac-VP7 CISA - INIA VP7
Proteína VP7: Antígeno en ELISA Proteína G-HRPO Sueros a ensayar (ovino, bovino) Proteína VP7 recombinante CISA - INIA CISA - INIA. cc4pa203 C. imicola Europa. PROABILIDAD DE PRESENCIA ROJO: BAJA, VERDE :ALTA Common co-variance matrix, maximising minimum MD between groups CISA - INIA CISA - INIA