Facultad de Química, UNAM Dogma Central de la Biología Molecular. Flujo de la Información Genética Replicación 1630 Genética y Biología Molecular Transcripción y Procesamiento del RNA Transcripción. Síntesis de RNA Traducción Síntesis de Proteínas Unidad 6 SÍNTESIS DE RNA o TRANSCRIPCIÓN Es el proceso mediante el cual se sintetiza RNA a partir de DNA. El RNA que se sintetiza puede ser el ribosomal, el de transferencia o el mensajero Se requiere el DNA porque de su secuencia se sintetiza la del RNA, la cual es complementaria Producto de la transcripción: RNA de transferencia Región aceptora Se requieren: La enzima RNA polimerasa. Cadena molde 3-5 DNA Señales de iniciación (promotor) y de terminación Ribonucleótidos (trifosfatados) ATP, GTP, CTP, UTP. Asa anticodón Proteínas o factores de transcripción. Tamaño: 75 80 nucleótidos 1
Estructura y Función del RNAt Los RNAt son las moléculas adaptadoras (traductoras) que decodifican la información en el RNAm acarreando al aminoácido correspondiente. Los RNAt se sintetizan como precursores que son procesados para generar moléculas de 75 a 80 nts de longitud. Generalmente tienen bases modificadas como: Ribotimidina Dihidrouridina Pseudouridina Inosina Producto de transcripción: RNA ribosomal PROCARIONTES: RNAr 23S: 2,904 nts. RNAr 16S: 1,542 nts. EUCARIONTES: RNAr 28S: 4,718 nts. RNAr 18S: 1,874 nts. Inosina Producto de la transcripción: RNA mensajero El proceso de transcripción es la síntesis de RNA siguiendo un molde de DNA El tamaño de los RNAs mensajeros es variable y depende del tamaño del gen que se transcribe. La estructura de los RNAm es variable y depende de la secuencia. Micrografía electrónica de la síntesis de RNA ribosomal 2
A diferencia de la replicación del DNA, en la transcripción... Solamente un fragmento de DNA, que corresponde a un gen, es copiado en RNA. Una de las dos cadenas de DNA es copiada a RNA. Solamente un fragmento de DNA, que corresponde a un gen, es copiado a RNA. Una de las dos cadenas de DNA es copiada a RNA. Cómo sabe la RNA polimerasa cuál de las dos cadenas usará como molde? DNA Cadena codificante: 5 -ATTCCGATGTACGAGG-3 DNA Cadena molde: 3 -TAAGGCTACATGCTCC-5 RNA 5 -AUUCCGAUGUACGAGG-3 La secuencia de la molécula de RNA que se sintetiza es complementaria y antiparalela a la cadena molde. La molécula de RNA que se sintetiza tiene la misma dirección y secuencia (U -> T) que la cadena codificante. Cómo sabe la RNA polimerasa dónde comenzar a sintetizar? Cómo sabe la RNA polimerasa donde terminar de sintetizar? Quíen abre la doble hélice de DNA? La enzima que sintetiza RNA es la RNA POLIMERASA La enzima de E. coli está formada por 4 subunidades La subunidad α sirve como nodo para ensamblar la RNA polimerasa holoenzima y esta función reside en el dominio N- terminal de la proteína. Subunidad α: ensamblaje de las unidades y unión al promotor Subunidad β: Sitio catalítico Subunidad β : Se une al DNA y parte de la subunidad catalítica Subunidad σ: Reconocimiento del promotor específico El domino C-terminal de la subunidad α interactúa con la región UP de los promotores que la tengan. 3
La estequiometría de subunidades en la holoenzima es α 2 ββ'σ Estructura de los promotores procariontes. Secuencias que se encuentran corriente arriba del sitio de inicio de la transcripción. Hay secuencias muy conservadas en los promotores procariontes. 5 8 pb Núcleo de la enzima Cuando la subunidad σ se asocia al núcleo se forma la holoenzima Secuencia -10 o caja Pribnow TATAAT Apertura de la cadena. Secuencia 35 TTGTCA Es la región de reconocimiento e interacción con el factor σ de la RNA polimerasa. Modelo de la RNA polimerasa de E. coli a partir de los datos cristalográficos Núcleo RNA pol Holoenzima Formación del complejo RNA pol - DNA El factor sigma permite la iniciación de la transcripción permitiendo que la RNA polimerasa se una fuertemente al promotor. Esta unión depende de la apertura de la doble hélice en esa región para formar un complejo del promotor accesible a la enzima. Núcleo de la enzima α 2 ββ Holoenzima α 2 ββσ Complejo de elongación. El factor sigma se disocia de este complejo. La RNA polimerasa tiene un canal abierto al cual se une el DNA. Una vez que se unen al DNA, los dedos de la enzima se cierran alrededor del DNA. 4
Las funciones de la subunidad σ El factor sigma selecciona los genes a transcribirse al facilitar la unión entre la RNA polimerasa y el promotor. Esta unión depende de la denaturalización local del DNA que permite la formación de un complejo de promotor abierto SÍNTESIS Y ESTRUCTURA DE UNA CADENA DE RNA El factor σ se recicla, i.e. cuando se disocia puede ser usado por otra RNA polimerasa. Al unirse al promotor, la RNA polimerasa causa la apertura de al menos 10-17 pb de la doble cadena de DNA. Esta burbuja de transcripción se mueve con la polimerasa exponiendo la cadena molde, de tal manera que puede ser transcrita. Se añaden ribonucleótidos polimerizándose la cadena a través de enlaces fosfodiéster La cadena se sintetiza en dirección 5 > 3 σ Elongación. Terminación: 1. Mecanismo dependiente de la proteína Rho Rebobinado 3 5 Hebra molde Hélice híbrida RNA - DNA RNA polimerasa Hebra codificadora 3 Punto de elongación 5 Desenrollado 3 La proteína rho es un hexámero que hidroliza ATP en presencia de RNA. Se une al RNA que se está sintetizando y se mueve en dirección al sitio de síntesis. Desestabiliza al híbrido DNA RNA, facilitando así la terminación de la transcripción. 5 ppp RNA naciente Desplazamiento de la polimerasa 4.- La burbuja de transcripción va avanzando, por un lado se abre el DNA duplex y por el otro se re-bobina. 5.- El RNA sintetizado va formando un híbrido (transitorio), con la cadena 3 5 del DNA Proteína Rho RNA polimerasa 5
2. Mecanismo independiente de la proteína Rho La secuencia al final del gen contiene repeticiones invertidas que son complementarias y que permiten la formación de una estructura de horquilla en el RNA. Hay una región rica en Adeninas, de tal forma que el híbrido DNA-RNA que se forma es débil y se disocia. Inhibición de la transcripción en procariontes. La rifampicina bloque la transición de iniciación-elongación. Se une a la subunidad β en el complejo RNApolimerasa promotor una vez que se han incorporado dos o tres nucleótidos a la cadena de RNA. La rifampicina es producida por Streptomyces sp. La estreptolidigina inhibe a la RNA polimerasa durante la elongación. RNA polimerasa Transcripción en eucariontes. Hay tres actividades de RNA polimerasas Las RNA polimerasas eucariontes sintetizan distintos RNAs y difieren en su sensibilidad a inhibidores. Actividad de RNA polimerasa RNA polimerasas eucariontes purificadas en una columna de DEAE-Sephadex. RNA pol I, RNA pol II y RNA pol III 6
INHIBIDORES DE LA TRANSCRIPCIÓN α-amanitina La RNA polimerasa II eucarionte está formada por 12 subunidades. (P.M. aproximado de 550 kda) La α amanitina inhibe a la RNA polimerasa II (Kd =10 nm) y un poco a la III. Inhibe la fase de elongación de la Transcripción Tres de estas subunidades son homólogas a las subunidades de la RNA polimerasa procarionte. Rpb1 =>β Rpb2 =>β Rpb3 =>α Amanita phaloides, hongo venenoso que contiene α - amanitina Los promotores de los genes eucariontes son más complejos que los procariontes. Muestran menor conservación en los elementos de reconocimiento de las RNA polimerasas. Inicio de la transcripción 18-25 nts La caja TATA funciona como señal para la unión de la proteína TBP (TATA-binding protein). La unión de TBP al DNA causa una torsión de éste, facilitando la apertura de la doble hélice. El factor de transcripción IID (TFIID) se une a promotores que contienen la caja TATA a través de la proteína TBP. Se forma un complejo multiproteíco en el promotor que permite la asociación de proteínas que están unidas a otras regiones en el promotor. Caja TATA: TATA(A/T)A(A/T) *URE (Elementos regulatorios río arriba ). Son sitios de unión de otras proteínas (factores de transcripción) que facilitan la unión de la RNA polimerasa y la transcripción de ese gen. De 100 a 200 pb del inicio. Enhancers (Sec. Intensificadoras). Regiones en el DNA que están alejadas por más de 1000 pb del sitio de inicio y que activan al promotor para que ocurra una transcripción más eficiente. 7
Cada tipo de RNA sufre una forma diferente de PROCESAMIENTO POST-TRANSCRIPCIONAL o MADURACIÓN Modificaciones posttranscripcionales de RNAs eucariontes PROCESAMIENTO o MADURACIÓN RNAt RNAm Euc. Remoción de los extremos Modificación de la ribosa Modificación de las bases Empalme o splicing Adición del CAP en el extremo 5 Adición del polia en el extremo 3 RNAr Metilación de la ribosa Remoción de partes intermedias de un pre-rnar largo que origina varios RNAr más cortos RNA ribosomales. Son sintetizados por la RNA pol I. Los RNA ribosomales 28S, 18S, y 5.8S se sintetizan como un transcrito largo de 13,000 nucleótidos que es procesado para generar los RNAr maduros. Los RNA de transferencia también son procesados La RNAsa P hace un corte y genera el extremo 5 -OH PreRNA 45S 18S 5.8S 28S Metilación en el 2 -OH de la ribosa 18S 5.8S 28S corte RNAr maduros La RNAsa P es un ribozima. Contiena una subunidad de proteína y otra de RNA. RNAr18S RNAr 5.8S RNAr 28S 8
RNAm Eucarionte: Adición del CAP RNAm eucarionte: Adición de la cola de polia Residuo 7-metil guanosina, añadida por una guanililtransferasa Puente 5-5 trifosfato El capuchón o capping puede estar metilada en O(2 ) (1 o dos nucleósidos terminales) o no (cap- 0). Secuencias consenso PABP Señal de corte Hidrólisis por una endonucleasa específica Adición de adeninas (50-300) por una poli-a polimerasa RNAm poliadenilado RNAm eucarionte: Corte y empalme/ splicing RNAm eucarionte: Corte y empalme o splicing Transcripción Procesamiento: eliminación de intrones. DNA RNAm heteronuclear Las dos últimas bases del intron son AG Empalme de exones RNAm maduro Sitio de ramificación Las dos primeras bases del intron son GU 9
RNAm eucarionte: Corte y empalme o splicing RNAm eucarionte: Corte y empalme o splicing El splicing del RNAm es catalizado por snrnp (small nuclear RiboNuclear Particles) snrnp: Moléculas de RNA ricas en uracilo asociadas a proteínas. U1, U2, U4, U5, U6. La subunidad de RNA forma puentes de hidrógeno con las bases en los sitios de reconocimiento de los intrones (3, 5 y la rama). Spliceosome = espliceosoma Splicing alternativo. Los RNAhn de algunos genes pueden ser procesados (splicing) de manera diferencial generando dos RNAm maduros distintos. Splicing alternativo RNA autocatalítico. Algunos intrones se pueden eliminar de transcritos heteronucleares sin el requerimiento de proteínas. En este mecanismo hay un ataque en el sitio 5 de splicing y la ruptura, y no se forma el lazo (lariat). Traducción Proteína A Proteína B Por lo general, el resultado del splicing alternativo son proteínas relacionadas estructuralmente. Generalmente se obtienen isoformas de una proteína. A partir de un gen, se produce más de una proteína. 10
Comparación de la expresión génica entre eucariontes y procariontes Eucariontes Procariontes 11