INSTITUTO UNIVERSITARIO DEL AGUA Y DE LAS CIENCIAS AMBIENTALES. Trabajo Fin de Máster

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1 INSTITUTO UNIVERSITARIO DEL AGUA Y DE LAS CIENCIAS AMBIENTALES Trabajo Fin de Máster Bioindicación para el control del proceso de tratamiento biológico de aguas residuales industriales en la EDARi de Helados Alacant. Estudio comparativo entre esta biofauna y la del MBR piloto de Rincón de Autor: Luis Alfredo Sánchez Bello Tutor: Dr. Ing. Arturo Trapote Jaume Alicante España Julio 2013

2 INDICE GENERAL 1. RESUMEN INTRODUCCION OBJETO Y ALCANCE DEL TRABAJO OBJETIVO GENERAL OBJETIVOS ESPECIFICOS MATERIALES Y METODOS DESCRIPCION DE MATERIALES METODOLOGIA EVALUACION DE LA CALIDAD DEL FANGO ACTIVO ESTIMACION DE LA CANTIDAD DE MICROORGANISMOS FILAMENTOSOS EN FANGOS ACTIVOS IDENTIFICACION DE MICROORGANISMOS FILAMENTOSOS RESULTADOS Y DISCUSION EVALUACION DE LA CALIDAD DEL FANGO RESULTADOS DE LAS MUESTRAS DEL MBR DE HELADOS ALACANT RESULTADOS DE LAS MUESTRAS DEL MBR PILOTO DE RINCON DE LEON EVALUACION CUALITATIVA Y CUANTITATIVA DE BACTERIAS FILAMENTOSAS RESULTADOS DE LAS MUESTRAS DEL MBR DE HELADOS ALACANT RESULTADOS DE LAS MUESTRAS PILOTO DE RINCON DE LEON DESCRIPCION DE BACTERIAS FILAMENTOSAS ENCONTRADAS EVALUACION CUANTITATIVA Y CUALITATIVA DE PROTOZOOS Y METAZOOS RESULTADOS DE LAS MUESTRAS DEL MBR DE HELADOS ALACANT RESULTADOS DE LAS MUESTRAS DEL MBR PILOTO DE RINCON DE LEON DESCRIPCION DE ORGANISMOS REPRESENTATIVOS ENCONTRADOS ESTUDIO COMPARATIVO Y CORRELACION DE DATOS CONCLUSIONES BIBLIOGRAFIA ANEXOS Luis Alfredo Sánchez Bello Página 2

3 INDICE DE FIGURAS FIGURA 2.1. DIAGRAMA DEL FLUJO DEL PROCESO DEPURADORA H.A FIGURA 2.2. DIAGRAMA DE FLUJO ESQUEMÁTICO DE LA PLANTA PILOTO MBR RINCÓN DE LEÓN FIGURA 2.3. TANQUE DE MEMBRANAS FIGURA 2.4. TANQUE DE MEMBRANAS DE FIBRA HUECA FIGURA 5.1. NOSTOCOIDA LIMICOLA I. 1000X, CAMPO CLARO. REPUESTA GRAM FIGURA 5.2. TIPO X, CAMPO CLARO. RESPUESTA GRAM FIGURA 5.3. NOSTOCOIDA LIMICOLA II. 1000X, CAMPO CLARO RESPUESTA GRAM FIGURA 5.4. TIPO X, CAMPO CLARO. RESPUESTA GRAM FIGURA 5.5. MICROTHRIX PARVICELLA. 1000X, CAMPO CLARO. RESPUESTA GRAM FIGURA 5.6. ARCELLA SP. 400X, CAMPO CLARO FIGURA 5.7. CARCHESIUM POLYPINUM. 200X, CAMPO CLARO FIGURA 5.8. EPISTYLIS SP. 400X, CAMPO CLARO FIGURA 5.9. ASPIDISCA CICADA. 400X, CAMPO CLARO FIGURA ROTARIA SP. 100X, CAMPO CLARO FIGURA LECANE SP. 200X, CAMPO CLARO FIGURA 5.12: NEMATODOS. 100X, CAMPO CLARO FIGURA 5.13: ANÉLIDO. 100X, CAMPO CLARO FIGURA 5.14: REPARTO PORCENTUAL PROTOZOOS Y METAZOOS MBR HELADOS ALACANT ERROR! MARCADOR NO DEFINIDO. FIGURA 5.15: REPARTO PORCENTUAL PROTOZOOS Y METAZOOS MBR RINCÓN DE LEÓN Luis Alfredo Sánchez Bello Página 3

4 INDICE DE TABLAS TABLA 4. 1: VALORACIÓN DEL ÍNDICE DE FANGO TABLA 4. 2: CATEGORÍAS DE ÍNDICE DE FANGOS TABLA 4.3: CARACTERÍSTICAS MORFOLÓGICAS IDENTIFICATIVAS PARA BACTERIAS FILAMENTOSAS TABLA 4.4: CARACTERÍSTICAS APLICABLES A TINCIONES PARA IDENTIFICACIÓN DE BACTERIAS FILAMENTOSAS TABLA 4.5: CLAVE IDENTIFICATIVA PARA BACTERIAS MOVILES TABLA 4.6 A: CLAVE IDENTIFICATIVA PARA BACTERIAS CREADORAS DE TURBIDEZ TABLA 4.6 B: CLAVE IDENTIFICATIVA PARA BACTERIAS CREADORAS DE TURBIDEZ TABLA 4.7 A. CLAVE IDENTIFICATIVA PARA BACTERIAS CON DIÁMETRO DEL TRICOMA SUPERIOR A 1 µm TABLA 4.7 B: CLAVE IDENTIFICATIVA PARA BACTERIAS CON DIÁMETRO DEL TRICOMA SUPERIOR A 1 µm TABLA 4.8 A: CLAVE IDENTIFICATIVA PARA BACTERIAS CON DIÁMETRO DEL TRICOMA INFERIOR A 1 µm TABLA 4.8 B: CLAVE IDENTIFICATIVA PARA BACTERIAS CON DIÁMETRO DE TRICOMA INFERIOR A 1 µm TABLA 4.8 C: CLAVE IDENTIFICATIVA PARA BACTERIAS CON DIÁMETRO DEL TRICOMA INFERIOR A 1 µm TABLA 4.8 D: CLAVE IDENTIFICATIVA PARA BACTERIAS CON DIÁMETRO DEL TRICOMA INFERIOR A 1 µm TABLA 4.9: CLAVE IDENTIFICATIVA PARA BACTERIAS DE ASPECTO RAMIFICADO TABLA 4.10: CLAVE IDENTIFICATIVA PARA BACTERIAS QUE NORMALMENTE ACUMULAN GRÁNULOS DE AZUFRE TABLA 5.1: CARACTERISTICAS MACROSCÓPICAS H.A. PONDERACIÓN ASIGNADA TABLA 5.2 A: CARACTERÍSTICAS MICROSCÓPICAS H.A. PONDERACIÓN ASIGNADA TABLA 5.2 B: CARACTERÍSTICAS MICROSCÓPICAS H.A. PONDERACIÓN ASIGNADA TABLA 5.3 : CARACTERÍSTICAS MACROSCÓPICAS R.L. PONDERACIÓN ASIGNADA TABLA 5.4 A: CARACTERÍSTICAS MICROSCÓPICAS R.L. PONDERACIÓN ASIGNADA TABLA 5.4 B: CARACTERÍSTICAS MICROSCÓPICAS R.L. PONDERACIÓN ASIGNADA TABLA 5.5: BACTERIAS FILAMENTOSAS MBR H.A TABLA 5.6: BACTERIAS FILAMENTOSAS MBR R.L TABLA 5.7: PROTOZOOS Y METAZOOS MBR H.A TABLA 5.8. PROTOZOOS Y METAZOOS MBR R.L TABLA 5.9: COMPARACIÓN DE DATOS ANALÍTICOS CON LAS CATEGORÍAS OBTENIDAS MBR HELADOS ALACANT TABLA 5.10: COMPARACIÓN DE DATOS ANALÍTICOS CON LAS CATEGORÍAS OBTENIDAS MBR PILOTO RINCÓN DE LEÓN Luis Alfredo Sánchez Bello Página 4

5 1. RESUMEN En el presente trabajo se describen actividades realizadas para aplicar la bioindicación para el e proceso de tratamiento biológico de aguas residuales en la EDARi de Helados Alacant, y en el MBR Piloto de Rincón de, para su posterior comparación. Para aplicar ésta técnica de control, se realizó una valoración de la calidad del fango, aplicando el Índice de Fangos, el cual categoriza la calidad del fango a través de la observación de las características macroscópicas y microscópicas del mismo en cada una de las observaciones. Posteriormente, se realizó un análisis cualitativo y cuantitativo de bacterias filamentosas, así como también de protozoos y metazoos presentes en las muestras. Para conseguir este objetivo, se utilizaron diferentes métodos y técnicas para el conteo e identificación de los microorganismos, como la observación microscópica a diferentes aumentos y campos (a campo claro y contraste de fase); la técnica aplicada de conteo de filamentosas, descrita por Estévez et al; la aplicación de una tinción diferencial, como la de Gram para este caso; el conteo de protozoos y metazoos en cámaras de conteo Neubauer. La toma de muestras y posterior análisis microbiológico se llevó a cabo en un intervalo de tiempo de 6 semanas, con una frecuencia de muestreo de 3 tomas por semana, para el caso del MBR de Helados Alacant, y una por semana para el caso del MBR Piloto de Rincón de. Al finalizar el estudio, se puede constatar que los resultados obtenidos, poseen una fiabilidad alta, debido a que se correlacionan directamente de forma coherente con las condiciones generales de trabajo en cada una de las plantas, lo que nos permite concluir que la bioindicación es una herramienta sencilla y de fácil aplicabilidad, apta para realizar un control complementario en estaciones depuradoras, tanto industriales como urbanas. Luis Alfredo Sánchez Bello Página 5

6 2. INTRODUCCION El estudio de los microorganismos implicados en la depuración biológica de aguas residuales comienza en el momento que se definen equipos para este fin. La concentración de microorganismos dentro de un recinto de aireación, para que realicen la degradación de la materia orgánica presente en el agua residual, mediante su metabolismo, implica el desarrollo de comunidades y cadenas tróficas complejas. Los primeros estudios profundos de identificación de estos microorganismos, (bacterias y protozoos fundamentalmente), datan de la década de los 60, (Curds en protozoos y Eikelboom en bacterias) y desde entonces estos estudios se han ido desarrollando, tanto a nivel de taxocenosis como de significación ecológica aplicable al control de los mecanismos depuradores. Sin embargo, el conocimiento de estas técnicas se encuentra reducido a una elite de profesionales, pero no son de divulgación general entre los técnicos encargados de la explotación de estaciones depuradoras de aguas residuales. El uso generalizado de este tipo de análisis en las estaciones depuradoras con tratamiento biológico, permitirá una optimización de los procesos, así como un mejor control del vertido, lo cual repercutirá en la mejora del medio ambiente, tanto a nivel de ahorro energético, como de mejora sustancial de la calidad del agua tratada en las estaciones de tratamiento de aguas residuales (Técnicas de bioindicación en depuradoras de aguas residuales, 2002). Los biorreactores de membrana (BRM) (reactor biológico + MF/UF) se incluyen en las denominadas tecnologías de membrana, las cuales han experimentado un gran desarrollo en la última década. La aplicación de estas tecnologías permite la separación del licor de mezcla (fango) y el agua depurada mediante membranas, obteniendo ventajas importantes frente a los procesos convencionales de depuración de aguas residuales, tales como mayor calidad del agua tratada, posibilidad de operar con altas concentraciones de biomasa, baja producción de fangos, (inhibición del crecimiento de bacterias Luis Alfredo Sánchez Bello Página 6

7 filamentosas que tampoco serían un problema ya que no hay etapa de decantación) y tamaño compacto de la planta. El aumento de la demanda de agua unido a la escasez de la misma, ha impulsado la implantación de estos sistemas, empleándose tanto para aguas residuales industriales como para aguas urbanas, especialmente en aquellos casos en que se plantea la posibilidad de reutilización de agua (Moro, 1998). Helados Alacant La depuradora de Helados Alacant está diseñada para tratar un caudal de agua de 400 m3/día. Consta de las siguientes etapas que se detallan a continuación: Pozo de bombeo. Punto donde recibe el agua de proceso a la planta. Está situado en el patio exterior. En él se encuentran las bombas que impulsan el agua hacia la depuradora y consta de: cesta de gruesos y reja de gruesos. Pretratamiento. Consta de un tamiz rotativo y un separador de grasas Homogeneización. Se regula el ph del agua de entrada, además de mezclar el agua, el depósito está aireado. DAF. Es un flotador de aire por difusión basado en la inserción de micro burbujas de aire. Reactor biológico. Se trata de un depósito aireado con la presencia de una zona anóxica, dispone de agitador y de bombas de recirculación. MBR. Consta de membranas, bombas de aspiración, soplante y equipo de limpieza. Línea de fangos. En la línea de fangos tenemos el siguiente proceso: acumulación y estabilización química en el depósito, espesador de fangos, centrífuga y tolva. Luis Alfredo Sánchez Bello Página 7

8 Figura 2.1. Diagrama del Flujo del Proceso Depuradora H.A. Línea de Agua del proceso de la EDARI Helados Alacant Pozo de bombeo El pozo de bombeo recibe el agua procedente del procesado de elaboración del helado de la planta y las aguas grises y negras procedentes de los sanitarios de la planta. En el pozo de bombeo se distinguen dos cámaras; la primera recibe toda el agua procedente de la fábrica, y en la segunda se halla un sistema de bombas, mandando el agua bombeada al tamizado y al desengrasador. El pozo dispone de rebose de seguridad que debe evitar usarse en todo momento, pues conduce el agua residual directamente a vertido sin pasar por el proceso depurativo. El pozo está equipado con unas rejas de desbaste situadas entre las dos cámaras, y de una cesta sumergida cuya finalidad es recoger los sólidos flotantes de gran tamaño que quedan atascados en la reja de desbaste y que podrían dañar las bombas del pretratamiento. Pretratamiento - Rototamiz El agua de entrada a la planta tiene unos niveles altos de contaminación aproximadamente (DQO mg/l, DBO mg/l), dicha materia Luis Alfredo Sánchez Bello Página 8

9 se encuentra en suspensión, por lo que un proceso de separación físico como es el rototamiz es de gran efectividad en estos casos. Este proceso de tamizado tiene como finalidad retirar gruesos pero sobretodo es un desbaste de finos con paso de < 1 mm del agua de aporte al proceso de depuración propiamente dicho. Los sólidos separados por el rototamiz caen desde el dispositivo rascador en toda la longitud del cilindro filtrante, al tornillo compactador, los residuos sólidos separados en este proceso son: almendras, coco, piña, palos de helado entre otros, estos residuos son equiparables con RSU (residuos sólidos urbanos) y son tratados como tal a través de gestores registrados dando una disposición final en vertederos autorizados - Desengrasador Esta unidad está diseñada para la eliminación de flotantes por medios mecánicos., se recibe el fluido en el desengrasador disponiéndolo de tal manera, que permite la formación de una alfombra de grasa en la superficie longitudinal del tanque. Se dispone también de dos difusores de aire en el fondo, que favorecen la suspensión de las grasas a la superficie, la cual es retirada fuera del mismo por un mecanismo barredor. El depósito ubicado en la parte posterior del tanque de retención recibe las aguas claras y las conduce al exterior, al depósito de homogeneización. Las grasas y flotantes arrastrados van a parar a un compartimento donde por gravedad caen al depósito de recogida de grasas. - Tanque de homogenización En esta cámara se homogeniza el agua y se dosifica, si fuese necesario, ácido y/o base para el control del ph, de gran importancia tanto para mantener un buen rendimiento del proceso, como para que el agua clarificada entre al reactor biológico con un ph adecuado para los microorganismos. El tanque dispone de una soplante para asegurarse la oxigenación a una razón de 50 m³/h. - DAF El DAF es un sistema de flotación para la separación de contaminantes específicos en agua de seguridad. Su funcionamiento se basa en la Flotación Luis Alfredo Sánchez Bello Página 9

10 por aire disuelto, el agua residual llega aquí desde el tanque de homogenización. El agua dentro de esta unidad es presurizada (aproximadamente 4 bares) y saturada con aire. Bajo presión el aire se disolverá en el agua, generando así el agua blanca. El agua blanca es inyectada al agua procedente de homogeneización a su entrada a la DAF. En este punto se produce la despresurización del agua (su efecto visual es el de un líquido lechoso), dando lugar a la expansión del aire; obteniendo finas burbujas que se adhieren fácilmente a los flóculos dándoles flotabilidad. El agua limpia sale por rebose al vertedero y de ahí es conducida al reactor biológico. Los flóculos flotados son arrastrados por unos brazos y descargados en el depósito de fangos. Reactor biológico El reactor biológico es el corazón de la planta, donde el objetivos que persigue es la eliminación o reducción de la contaminación orgánica mediante la intervención de microorganismos que actúan sobre la materia orgánica e inorgánica, suspendida, disuelta y coloidal existente en el agua residual, consiguiendo una separación sólido-líquido que puede separarse fácilmente, en el reactor se tiene la presencia de una parte anóxica donde se desarrollan las fases de nitrificación y des-nitrificación en paralelo, el nitrógeno debe eliminarse para evitar la eutrofización o su toxicidad a elevadas concentraciones para la vida acuática. La primera consideración a tener en cuenta es la concentración de oxígeno disuelto en el agua. Dicha concentración ha de encontrarse entre 1 y 2 mg/l. Para conseguir mantener la concentración de oxígeno constante, se emplean tres soplantes de 2300 m³/h que airean el reactor a través de 1000 difusores de aire dispuestos en dos parrillas situadas en el fondo del tanque. Para conseguir que haya una adecuada circulación y remoción de agua dentro del reactor biológico se dispone de un agitador. Este agitador evita también una decantación del licor mezcla. Cuando la concentración de sólidos en suspensión de las analíticas resultantes del biológico es mayor que 8 g/l surge la necesidad de purgar. Para ello se dispone de las bombas de purga, que aspiran el agua del fondo del reactor Luis Alfredo Sánchez Bello Página 10

11 biológico. De la corriente recirculada extraemos la cantidad de fangos en exceso que sea necesaria para que la concentración del biológico permanezca aproximadamente constante en el valor deseado. En el reactor biológico es importante tener controlado el ph y debe estar comprendido entre 6 y 9. Filtración con membranas Dentro del reactor biológico están ubicadas las membranas. Estas membranas separan el agua limpia del licor-mezcla por la acción de las bombas de succión. El MBR tiene de 4 módulos, cada módulo tiene dos element block compuesto de 100 membranas c/u, con un total de 800 membranas, el sistema funciona mediante el uso de 2 bombas de succión, el agua es filtrada a través de las membranas, y el agua obtenida, es decir el agua de permeado se envía a tratamiento terciario. El sistema funciona según un ciclo programable: las bombas están trabajando durante un tiempo, siempre 9 minutos, y descansando durante otro tiempo, normalmente 1 minuto, momento en el que se realiza una limpieza de las membranas, el sistema limpia los conductos de aire cada 12 horas. El sistema necesita un aporte continuo de aire 100 Nm³/h*módulo, que se realiza con una soplante y se regula mediante una válvula automática. Es importante mencionar los siguientes conceptos: - Caudal: de m³/h*módulo - Flujo: si SST > 8 g/l > 16 L/m²*h si SST 8 g/l > 8 L/m²*h - Permeabilidad: L/m²/h/bar, que indique cuando debe realizarse la limpieza química Para el caso del ensuciamiento de membranas identificado plenamente por el valor de turbidez elevado en el agua de permeado, podemos notarlo también debido a la presión de succión requerida dado que ésta aumenta y debido a la permeabilidad < 100 L/m²/h/bar. Para llevar a cabo la limpieza química, se llena un tanque de agua de 3 m³ de capacidad y se introducen 20 L de hipoclorito sódico, es decir por cada 3 m³ de agua de añaden 20 L de hipoclorito sódico, una vez lleno, se hace un juego de válvulas para proceder a la limpieza de un módulo de membranas de los 4 existentes, es decir la limpieza se realiza por cada element block permitiendo que la solución llegue a toda la superficie de Luis Alfredo Sánchez Bello Página 11

12 las membranas. Se espera aproximadamente una hora para que la limpieza química sea efectiva y pasado ese tiempo, se vuelven a abrir las válvulas continuando con el funcionamiento normal. Tratamiento terciario El agua que sale del proceso de la EDARI, es decir el agua procedente del proceso de permeado pasa a un tratamiento terciario destinado a eliminar la materia en suspensión del afluente secundario, mediante una filtración directa (filtro de arena), y a desinfectar completamente el efluente mediante la adición de cloro líquido. Este proceso de tratamiento constituye propiamente la fase de regeneración del agua residual de la EDARI Helados Alacant. Línea de Fangos del proceso de la EDARI Helados Alacant Estabilización El objetivo de la estabilización es reducir el contenido de la materia volátil a fin de hacer el residuo menos putrescible y más estable. Esta estabilización se la realiza en un depósito de 125 m³ de capacidad de forma química por elevación del ph mediante la adición de cal. Espesamiento El espesado tiene como objetivo fundamental reducir el volumen del fango (y por tanto aumentar su concentración) para favorecer su posterior deshidratación del 2 3 % de sequedad obtenida. Los fangos procedentes del tratamiento físico-químico, concretamente del flotador DAF, y los correspondientes a las purgas del reactor biológico son enviados a un depósito de fangos y posteriormente a un espesador rotativo. Acondicionamiento El acondicionamiento tiene como objeto desestabilizar la suspensión que forma el fango con el agua y hacer factible su secado mecánico, es decir es la adición de polielectrolito (catiónico) Desde el depósito de fangos se bombea el agua hasta un espesador rotativo. A la entrada del fango al espesador o tambor rotativo se añade polielectrolito catiónico, favoreciéndose de este modo la formación de los flóculos, La preparación de poli-electrolitos se lleva a cabo, mezclando el reactivo con agua en una máquina con un sistema de agitación y mezcla. Luis Alfredo Sánchez Bello Página 12

13 Deshidratación Los fangos ya espesados, son sometidos a una separación mediante centrífuga, obteniéndose por un lado una fase acuosa, y por otro una torta. Los fangos sólidos obtenidos, son transportados mediante un tornillo sinfín a una tolva. En esta etapa y para producir la deshidratación, se le añade a los fangos una preparación de polielectrolito catiónico. Los fangos tratados procedentes de la EDARI que previamente han reducido su masa y volumen son un producto estable y que es aprovechado, estos lodos (biosólidos) son reutilizados en aplicaciones agrícolas, forestales o degradados de los campos de Monforte, dado que es un lodo enriquecido con materia orgánica debido a su procedencia, idóneo para los suelos del sector. Helados Alacant, responsable de la gestión de los lodos lo hace a través de la empresa CESPA, empresa que prestar servicios medioambientales de recogida de residuos (Carrillo 2011). Planta piloto MBR Rincón de La figura 3 muestra un diagrama de la planta piloto empleada para la investigación. Se encuentra ubicada en la planta de tratamiento de aguas residuales (EDAR) "Rincón de ", en Alicante. La planta dispone de 4 tanques principales (desnitrificación o anóxico, reactor biológico, tanque de membranas planas y tanque de membranas de fibra hueca), cuya capacidad máxima es de litros. Consta de dos sistemas de membranas: uno de membrana plana (MP) de la empresa Kubota y otro de membrana de fibra hueca (FH) de la empresa Porous Fibers. El tanque de MP (Figura 4a) se compone de dos módulos de filtración con 10 unidades (LF10) cada uno, con un área total de 16 m 2 (0,8 m 2 /membrana) y un caudal nominal de 400 L/h. El tanque de FH (Figura 4b) está compuesto por 4 módulos de filtración (Micronet R), con un área total de 20 m 2 (5 m 2 /módulo) y un caudal nominal de filtración de 400 L/h. Las dos membranas tienen un tamaño nominal de poro de 0,4 micras. Luis Alfredo Sánchez Bello Página 13

14 La aireación en ambos tanques de membrana (burbuja gruesa) fue proporcionada mediante un sistema de aire comprimido a través de sendas parrillas de aireación colocadas en la parte inferior de las membranas. Por su parte, para suministrar el oxígeno necesario en el tanque biológico (burbuja fina) se empleó un sistema de difusores instalados en la base del tanque. El oxígeno disuelto en este depósito fue controlado con un variador de frecuencia y una sonda de oxígeno disuelto. El funcionamiento de la bomba de entrada a la planta se controló mediante un sistema de boyas de nivel en los tanques de membrana. El permeado (agua tratada) en ambas líneas se obtuvo a través de las membranas mediante una bomba de succión en cada tanque. RECIRCULACIÓN LIMPIEZA IN SITU MEMBRANA FIBRA HUECA TANQUE AIREACIÓN TANQUE DESNITRIFIC ACIÓN P U R G A PERMEADO L.M. MEMBRANA PLANA 15% 85% C.L. L. LODO DECANTADOR SECUNDARIO DECANTADOR PRIMARIO L: Tanque limpieza C.L.: Tanque contralavado L.M: Tanque limpieza de mantenimiento Figura 2.2. Diagrama de flujo esquemático de la planta piloto MBR Rincón de planas. Figura 2.3. Tanque de membranas Luis Alfredo Sánchez Bello Página 14

15 Figura 2.4. Tanque de membranas de fibra hueca Para el control y adquisición de datos de la planta se instaló un controlador lógico programable (PLC Programmable logic controller) que recogía datos de todas las variables de control del sistema, como la presión transmembrana (PTM), temperatura y oxígeno disuelto entre otras. El programa detiene la filtración cuando la PTM alcanza el valor máximo de 0,3 bar para las MP y 0,55 bar para las membranas de FH. Luis Alfredo Sánchez Bello Página 15

16 3. OBJETO Y ALCANCE DEL TRABAJO 3.1. OBJETIVO GENERAL El objetivo general de este proyecto es aplicar la bioindicación para el control del proceso biológico de tratamiento de aguas residuales en el MBR de Helados Alacant y llevar a cabo un estudio comparativo con la microfauna del MBR piloto de Rincón de OBJETIVOS ESPECIFICOS Evaluar la calidad del fango. Caracterización macroscópica y microscópica del fango activo. Índice de fangos. Identificar las diversas clases de bacterias filamentosas presentes en ambos MBRs a lo largo del estudio. Cuantificar en cada muestra el número total de bacterias filamentosas Identificar y cuantificar la población de protozoos y metazoos en el proceso de depuración biológica. Correlacionar los datos obtenidos y realizar un estudio comparativo entre ambos casos, en base a condiciones y/o parámetros conocidos durante el tiempo de estudio. Luis Alfredo Sánchez Bello Página 16

17 4. MATERIALES Y METODOS 4.1. DESCRIPCION DE MATERIALES - Microscopio óptico. Las observaciones se llevaran a cabo en un microscopio óptico Zeiss (modelo Axioscope 2), a diferentes aumentos según se precise. Las técnicas microscópicas usadas serán las de campo claro y contraste de fases, según requerimiento. - Cámara de Neubauer Para el conteo de bacterias filamentosas, se utilizará el método usado por Estévez et al., éste se basa en el conteo del número de intersecciones de los filamentos con las líneas la cuadrícula demarcada en una cámara de Neubauer. Para la cuantificación de protozoos y metazoos se realizará un conteo sobre la misma cámara, en la cual contamos con una superficie y un volumen conocido de muestra. En el retículo central, la cámara de Neubauer posee un cuadrado primario que contiene nueve cuadrados secundarios cada uno de ellos divididos a su vez en 16 cuadrados terciarios, el cuadrado central contiene 25 cuadrados, cada uno de ellos dividido a su vez en 16 cuadrados cuaternarios, éste último tiene una superficie de 1mm 2, en el cual se realiza la valoración tanto de bacterias filamentosas, como de protozoos y metazoos. - Reactivos para tinción de Gram La tinción de Gram, es una técnica de tinción diferencial que permite distinguir entre bacterias Gram + y Gram -, en función del grado de permeabilidad de las paredes celulares al disolvente aplicado durante la tinción. Los filamentos Gram + se observan de color azul violeta, y los Gram de color rosado. Los reactivos a utilizar son: Cristal de Violeta al 10% (p/v) en etanol, Lugol, Safranina al 2.5% (p/v) en etanol, y solución decolorante (acetona). - Material de laboratorio Se utilizaron materiales de uso habitual en laboratorio, como micropipetas, portaobjetos, cubreobjetos, probetas, vasos precipitados. Luis Alfredo Sánchez Bello Página 17

18 4.2. METODOLOGIA En el presente estudio se realizó la valoración del fango activo, así también se identificó y cuantificó la microfauna presente en el reactor biológico de la EDARi de Helados Alacant durante un tiempo aproximado de 6 semanas, con una frecuencia de tres tomas de muestra por semana. La toma de muestra del MBR piloto de Rincón de, se llevó a cabo semanalmente de forma simultánea EVALUACION DE LA CALIDAD DEL FANGO ACTIVO Para realizar la valoración tanto macroscópica como microscópica del fango en este estudio, se basó en lo indicado en el Manual Práctico para el Estudio de Grupos Bioindicadores en Fangos Activos, del Grupo de Bioindicación Sevilla CARACTERISTICAS MACROSCOPICAS La valoración de las características macroscópicas del fango activo se realiza a través del ensayo de la V30, que determina la cantidad de fango activado que decanta en una probeta pasados treinta minutos. Se analizaran tanto las propiedades del proceso de decantación como las características del clarificado. Se valoran las siguientes características: 1. Turbidez del clarificado - Alta: pobre visibilidad a través de la probeta - Media: media visibilidad a través de la probeta - Baja: buena visibilidad a través de la probeta 2. Flóculos en suspensión en el clarificado - Alta: abundancia de microflóculos - Media: presencia de microflóculos - Baja: prácticamente ausencia de microflóculos 3. Sedimentabilidad del fango - Alta: la mayor parte del fango decanta en los 10 primeros minutos del ensayo y el fango está muy compactado - Media: la mayor parte del fango decanta entre minutos y se observa un ligero esponjamiento Luis Alfredo Sánchez Bello Página 18

19 - Baja: la mayor parte del fango decanta después de 20 minutos y se observa un claro esponjamiento 4. Olor: Característica macroscópica del fango activado que se define como correcto o incorrecto. Por ejemplo, un olor incorrecto podría darse por un vertido puntual a la planta, o condiciones de septicidad El máximo valor obtenido por las características macroscópicas es de 30 sobre 100. La turbidez se mide, colocando un objeto detrás de la probeta y viendo si se aprecian la figura del mismo. La clasificación se determina de la siguiente manera: si el objeto se ve claramente, turbidez baja; si no se ve a detalle el objeto de referencia, la turbidez es media; y por último, si el objeto no se distingue, estamos hablando de una turbidez alta CARACTERISTICAS MICROSCOPICAS El conjunto de características microscópicas que se recogen a continuación se refieren al examen del estado morfológico y estructural del flóculo de fango activo (forma, tamaño, estructura, textura, cobertura, etc.) y al examen del componente biótico del "ecosistema fango activo", representado por las poblaciones de bacterias filamentosas y de protozoos (principalmente ciliados). La evaluación de estas características proporciona información sobre las propiedades de decantación y compactación del fango activo durante la fase de clarificación del licor mezcla, así como el nivel y estado de colonización de la microfauna, lo que se traduce indirectamente al grado de actividad biológica del proceso depurador. 1. Forma del flóculo: característica que define la morfología externa del flóculo como regular si aparece de forma redondeada e irregular si difiere de esta configuración. 2. Tamaño del flóculo: -Pequeño: tamaño menor de 150 μm -Medio: tamaño entre 150 y 500 μm (incluidos ambos valores) -Grande: tamaño mayor de 500 μm 3. Estructura del flóculo: Luis Alfredo Sánchez Bello Página 19

20 -Compacto: no existen prácticamente huecos en la estructura interna del flóculo. -Medio: se detectan algunos huecos -Abierta: existen bastantes huecos dentro del flóculo que rompen la unidad interna. 4. Textura del flóculo: característica que alude al grado de cohesión entre las partículas que forman el flóculo, estableciéndose las categorías "fuerte" y "débil" en función a la sustancia o presencia de disgregación de los flóculos, respectivamente, tras punción sobre el cubreobjetos 5. Cobertura: característica que valora si la unión de todos los flóculos presentes en el ocular de 10X cubre menos del 10% de su superficie, del 10-50% o más del 50%. 6. Filamentos en el flóculo: - Menos de 5 filamentos/flóculo - Entre 5-20 filamentos/flóculo (incluidos ambos valores) - Más de 20 filamentos/flóculo. 7. Filamentos en disolución: característica que cuantifica la existencia de filamentos libres entre los espacios interfloculares del licor mezcla. Si no son observables será, "baja" (categoría bacteriana <2), mientras que si se observan normalmente, será "alta" (categoría bacteriana >2). La categoría bacteriana > 2 se define como "abundancia de algún filamento. 8. Diversidad de protozoos: - Menos de 4 especies - De 4-7 especies (incluidos ambos valores) - Más de 7 especies La información obtenida, tanto del estudio microscópico como del ensayo de decantación (V30), dan lugar a una puntuación final del índice de fangos, como se observa en la Tabla 4.1 a continuación. Luis Alfredo Sánchez Bello Página 20

21 Tabla Valoración del Índice de Fango Características macroscópicas Alta 0 Turbidez Media 4.5 Baja 9 Alta 0 Flóculos en suspensión Media 4.5 Baja 9 Alta 9 Sedimentabilidad Media 4.5 Baja 0 Olor Correcto 3 Incorrecto 0 Características Microscópicas Forma Regular 4 Irregular 0 Grande 4 Tamaño Medio 7 Pequeño 0 Compacta 18 Estructura Media 9 Abierta 0 Textura Fuerte 4 Débil 0 Luis Alfredo Sánchez Bello Página 21

22 < 10% 0 Cobertura 10 50% 7 > 50% 3.5 > 20 0 Filamentos en flóculos < 5 14 Filamentos en disolución Alta 0 Baja 3 > 7 especies 13 Diversidad de protozoos 4 7 especies 7 < 4 especies 0 ÍNDICE DE FANGOS TOTAL Fuente: Manual Práctico para el Estudio de Grupos Bioindicadores en Fangos activos Elaboración: Propia De acuerdo a la puntuación obtenida, se clasifica luego en base a la siguiente tabla. Tabla Categorías de Índice de Fangos INDICE DE FANGOS 0 20 pésimo malo regular bueno óptimo Fuente: Manual Práctico para el Estudio de Grupos Bioindicadores en Fangos activos 2008 Elaboración: Propia Luis Alfredo Sánchez Bello Página 22

23 FORMATO DE RECOGIDA DE DATOS Para realizar el levantamiento de datos, se prepararon formatos específicos para plasmar los datos obtenidos. Los formatos utilizados se observan en el Anexo ESTIMACION DE LA CANTIDAD DE MICROORGANISMOS FILAMENTOSOS EN FANGOS ACTIVOS Esta técnica de recuento de microorganismos filamentosos del fango activo, establecida en Estévez et al, se presenta como un método de determinación de filamentos, sencillo y compatible con la explotación de una EDAR, ya que no consume mucho tiempo. Al igual que los métodos tratados con anterioridad, éste se basa una vez más en el conteo del número de intersecciones de los filamentos con las líneas de una cuadrícula. La cuadrícula utilizada es una cámara de recuento Neubauer, al ser más asequible que un ocular con una cuadrícula grabada. Sólo se van a contar las intersecciones con los cuadros de las diagonales centrales. Hay que decir, que este método fue concebido como una técnica de recuento cuantitativa de bacterias filamentosas, para optimizar el uso del hipoclorito sódico en sistemas de fangos activos, con problemática de esponjamiento de fangos. La observación de muestras se realiza in vivo, sin prensar ni teñir. El procedimiento a seguir es el que se describa a continuación. 1º Transferir un volumen conocido de muestra de fango activo bien mezclado, a la cámara de Neubauer. 2º Se cuenta el número de intersecciones con cada uno de los lados de los 20 cuadrados pequeños que forman una de las diagonales del cuadrado central. Con el objetivo de 200 aumentos y contraste de fases, realizar el recuento de la muestra in vivo. 3º El último paso es sumar el número de intersecciones observadas en todos los campos examinados, para finalmente obtener el resultado del recuento aplicando las siguientes fórmulas. Luis Alfredo Sánchez Bello Página 23

24 L = Longitud de filamentos n = número de intersecciones r = número de recuentos V = volumen de muestra (1 µl) F = 10,5 A = área del cuadrado central de la cámara de Neubauer (1 mm 2 ) l = Σ perímetros de los cuadrados de la diagonal Reemplazando los datos conocidos se resume: En el segundo cálculo, se tiene en cuenta el área total observada, longitud total de transecto sobre el que se realiza el recuento (suma de perímetros de los cuadrados pequeños) y se extrapola al número total de cuadrados pequeños del cuadrado grande central, de la cámara de Neubauer (F=10,5) IDENTIFICACION DE MICROORGANISMOS FILAMENTOSOS La clave de filamentos se ha diferenciado en función de las características físicas más notables. Es por eso que se especifican las características en las siguientes tablas. Tabla 4.3. Características morfológicas identificativas para bacterias filamentosas CARACTERISTICAS MORFOLÓGICAS Forma del Filamento Color del filamento Localización del Filamento Recto/ligeramente curvo/torcido/irregular/enrollado/micelial Transparente/ opaco/oscuro Flocular/extendiéndose desde el floculo /extraflocular Luis Alfredo Sánchez Bello Página 24

25 Crecimiento epifitico Septos celulares Constricciones celulares Dimensiones Forma celular Dimensiones celulares Detección de la aparacion y el grado Detección Detección Longitud/ diámetro Cuadrada/rectangular/oval/en tonel/discoidal/bacilar/coco Longitud y diámetro Fuente: Manual Práctico para el Estudio de Grupos Bioindicadores en Fangos activos Elaboración: Propia Tabla 4.4. Características aplicables a tinciones filamentosas para identificación de bacterias Tinción de Gram Tinción de Neisser Gránulos Neisser Granulo PHB Tinción Vaina Positiva/negativa/variable Positiva/negativa Positiva/negativa Positiva/negativa Ausencia/presencia Fuente: Manual Práctico para el Estudio de Grupos Bioindicadores en Fangos activos Elaboración: Propia Tabla 4.5. Clave identificativa para bacterias móviles Característica predominante Bacteria filamentosa MOVIL Flexibacter SP. Beggiators SP: Cianophicea Tinción Gram Tinción Neisser Tricoma Tinción Neisser gránulos Luis Alfredo Sánchez Bello Página 25

26 Test gránulos de azufre NO NO NO Otras inclusiones celulares PHB PIGMENTOS Diámetro tricoma (µm) Longitud tricoma (µm) Morfología tricoma RECTOS/POCO CURVADOS RECTOS/POCO CURVADOS RECTOS Localización tricoma Septos celulares visibles Constricciones septos celulares LIBRE LIBRE LIBRE NO SI SI NO NO SI Vaina NO NO NO Crecimiento epífito NO NO NO Ancho celular (µm) Largo celular (µm) Morfología celular RECTANGULAR CUADRADAS/R ECTAS/EN TONEL otros MOVILIDAD POR DESLIZAMIENTO S IN SITU Fuente: Manual Práctico para el Estudio de Grupos Bioindicadores en Fangos activos Elaboración: Propia Tabla 4.6 A. Clave identificativa para bacterias creadoras de turbidez Característica predominante Bacteria filamentosa CREADORAS DE TURBIDEZ Tipo 1863 Tipo 0211 Tipo 1852 Tinción Gram Tinción Neisser Tricoma Luis Alfredo Sánchez Bello Página 26

27 Tinción Neisser gránulos Test gránulos de azufre NO NO NO Otras inclusiones celulares Diámetro tricoma (µm) Longitud tricoma (µm) <150 < Morfología tricoma CADENA IRREGULAR CELULAS TORCIDO O ENROLLADOS RECTOS O TORCIDOS Localización tricoma Septos celulares visibles Constricciones septos celulares LIBRE LIBRE EXTENDIENDOS E DESDE FLOCULO SI SI SI SI SI NO Vaina NO NO NO Crecimiento epifitico NO NO NO Ancho celular (µm) Largo celular (µm) Morfología celular ESFERICAS COCOIDALES EXTREMOS REDONDEADO S RECTANGULAR ES otros CELULAS TRANSPARENTE S Fuente: Manual Práctico para el Estudio de Grupos Bioindicadores en Fangos activos Elaboración: Propia Luis Alfredo Sánchez Bello Página 27

28 Tabla 4.6 B. Clave identificativa para bacterias creadoras de turbidez Característica predominante CREADORAS DE TURBIDEZ Bacteria filamentosa Tipo 0411 STREPTOCOC CUS SP. BACILIUS SP. Tinción Gram - + +/- Tinción Neisser Tricoma Tinción Neisser gránulos Test gránulos de azufre NO NO NO Otras inclusiones celulares Diámetro tricoma (µm) Longitud tricoma (µm) < Morfología tricoma RECTOS TORCIDOS LIGERAMENTE CURVOS CADENA IRREGULAR CADENAS CELULARES Localización tricoma BORDES FLOCULARES LIBRE LIBRE Septos celulares visibles SI SI Constricciones septos celulares SI NO Vaina NO NO NO Crecimiento epifitico NO NO NO Ancho celular (µm) Largo celular (µm) Morfología celular EXTREMOS REDONDEADOS ESFERICAS EXTREMOS REDONDEADOS Luis Alfredo Sánchez Bello Página 28

29 otros Fuente: Manual Práctico para el Estudio de Grupos Bioindicadores en Fangos activos Elaboración: Propia Tabla 4.7 A. Clave identificativa para bacterias con diámetro del tricoma superior a 1 µm Característica predominante Bacteria filamentosa DIAMETRO DEL TRICOMA SUPERIOR A 1 µm Tipo 021N Tipo 0041 Tipo 0961 Tinción Gram Tinción Neisser Tricoma Tinción Neisser gránulos Test gránulos de azufre Otras inclusiones celulares Diámetro tricoma (µm) Longitud tricoma (µm) SI NO NO PHB Morfología tricoma RECTOS LIGERAMENTE CURVADOS, ENROLLADOS RECTOS, LIGERAMENTE CURVADOS RECTOS Localización tricoma EXTENDIENDOS E DESDE EL FLOCULO INTERIOR O LIBRES EXTENDIENDOS E DESDE EL FLOCULO Septos celulares visibles Constricciones septos celulares SI SI SI SI NO NO Luis Alfredo Sánchez Bello Página 29

30 Vaina NO SI NO Crecimiento epifitico NO -, ++ NO Ancho celular (µm) Largo celular (µm) Morfología celular OVALES, DESCOIDALES, CUADRADAS, RECTANULARES, EN TONEL CUADRADAS/R ECTANGULAR ES RECTANGULAR ES otros A VECES CUBIERTA N+ CELULAS TRANSPARENTE S Fuente: Manual Práctico para el Estudio de Grupos Bioindicadores en Fangos activos Elaboración: Propia Tabla 4.7 B. Clave identificativa para bacterias con diámetro del tricoma superior a 1 µm Característica predominante DIAMETRO DEL TRICOMA SUPERIOR A 1 µm Bacteria filamentosa NOSTOCOIDA L II NOSTOCOIDA L III Tinción Gram Tinción Neisser Tricoma Tinción Neisser gránulos - - Test gránulos de azufre Otras inclusiones celulares NO PHB NO PHB Diámetro tricoma (µm) Longitud tricoma (µm) Luis Alfredo Sánchez Bello Página 30

31 Morfología tricoma Localización tricoma Septos celulares visibles Constricciones septos celulares TORCIDOS O ENROLLADOS INTERIOR SI SI TORCIDOS O ENROLLADOS INTERIOR EXTENDIENDOSE SI SI Vaina NO NO Crecimiento epifitico NO NO Ancho celular (µm) Largo celular (µm) Morfología celular DISCOIDALES, OVALES ESFERICAS, OVALES, DISCOIDALES otros RAMIFICACION A VECES VERDADERA Fuente: Manual Práctico para el Estudio de Grupos Bioindicadores en Fangos activos Elaboración: Propia Tabla 4.8 A. Clave identificativa para bacterias con diámetro del tricoma inferior a 1 µm Característica predominante DIAMETRO DEL TRICOMA INFERIOR A 1 µm Bacteria filamentosa NOSTOCOIDA L I HALISCOMENOBAC TER H. MICROTRIX P. Tinción Gram Tinción Neisser Tricoma Tinción Neisser gránulos Test gránulos de azufre NO NO NO Luis Alfredo Sánchez Bello Página 31

32 Otras inclusiones celulares Diámetro tricoma (µm) Longitud tricoma (µm) PHB Morfología tricoma TORCIDOS, CURVADOS O ENROLLADOS RECTOS O TORCIDOS ENROLLADO S Localización tricoma INTERIOR O EXTENDIENDO SE BORDE FLOCULAR Y LIBRES EN FLOCULO Y LIBRES Septos celulares visibles DIFICIL VER NO NO Constricciones septos celulares NO NO Vaina NO SI NO Crecimiento epifitico NO -, + NO Ancho celular (µm) Largo celular (µm) Morfología celular OVALES otros AGUJAS IRRADIADAS ABULTAMIEN TO EN CONTORNO FILAMENTO Fuente: Manual Práctico para el Estudio de Grupos Bioindicadores en Fangos activos Elaboración: Propia Tabla 4.8 B. Clave identificativa para bacterias con diámetro de tricoma inferior a 1 µm Caracteristica predominante Bacteria filamentosa DIAMETRO DEL TRICOMA INFERIOR A 1 µm Tipo 0675 Tipo 0092 Tipo 1701 Tinción Gram Luis Alfredo Sánchez Bello Página 32

33 - Tinción Neisser Tricoma Tinción Neisser gránulos Test gránulos de azufre Otras inclusiones celulares Diámetro tricoma (µm) Longitud tricoma (µm) NO NO NO PHB < Morfología tricoma RECTOS, POCO CURVADOS RECTOS, TORCIDOS O LIGERAMENTE CURVADOS CURVADOS O TORCIDOS Localización tricoma INTERIOR INTERIOR O LIBRE TODOS SITIOS Septos celulares visibles Constricciones septos celulares SI NO SI NO NO SI Vaina SI NO SI Crecimiento epifitico ++ NO ++ Ancho celular (µm) Largo celular (µm) Morfología celular CUADRADAS RECTANGULA RES EXTREMOS REDONDEADOS otros CLAVE TINCION NEISSER A VECES RAMIFICACIONE S Fuente: Manual Práctico para el Estudio de Grupos Bioindicadores en Fangos activos Elaboración: Propia Luis Alfredo Sánchez Bello Página 33

34 Tabla 4.8 C. Clave identificativa para bacterias con diámetro del tricoma inferior a 1 µm Característica predominante DIAMETRO DEL TRICOMA INFERIOR A 1 µm Otras características Tipo 1702 Tipo 1851 Tipo 0581 Tinción Gram - + (LIGERO) + - Tinción Neisser Tricoma Tinción Neisser gránulos Test gránulos de azufre NO NO NO Otras inclusiones celulares Diámetro tricoma (µm) Longitud tricoma (µm) Morfología tricoma RECTOS O TORCIDOS RECTOS O ALGO CURVADOS RECTOS LIGERAMENTE CURVOS O ENROLLADOS Localización tricoma EXTENDIENDO SE DESDE FLOCULO EXTENDIENDO SE DESDE FLOCULO LIBRES Septos celulares visibles Constricciones septos celulares NO SI/NO NO NO NO NO Vaina SI SI NO Crecimiento epifitico NO -,+ NO Ancho celular (µm) Largo celular (µm) Morfología celular RECTANGULA RES Luis Alfredo Sánchez Bello Página 34

35 otros A VECES EN MANOJOS Fuente: Manual Práctico para el Estudio de Grupos Bioindicadores en Fangos activos Elaboración: Propia Tabla 4.8 D. Clave identificativa para bacterias con diámetro del tricoma inferior a 1 µm Característica predominante DIAMETRO DEL TRICOMA INFERIOR A 1 µm Otras características Tipo 0803 Tinción Gram - Tinción Neisser Tricoma - Tinción Neisser gránulos + Test gránulos de azufre NO Otras inclusiones celulares Diámetro tricoma (µm) 0.8 Longitud tricoma (µm) Morfología tricoma Localización tricoma Septos celulares visibles Constricciones septos celulares Vaina Crecimiento epifitico RECTOS, TORCIDOS O LIGERAMENTE CURVADOS LIBRE SI DIFICIL VER NO NO Ancho celular (µm) 0.8 Largo celular (µm) Morfología celular CUADRADAS O RECTANGULARES otros Fuente: Manual Práctico para el Estudio de Grupos Bioindicadores en Fangos activos Elaboración: Propia. Luis Alfredo Sánchez Bello Página 35

36 Tabla 4.9. Clave identificativa para bacterias de aspecto ramificado Característica predominante ASPECTO RAMIFICADO Bacteria filamentosa GALO SPHAEROTILU S N. HONGOS Tinción Gram Tinción Neisser Tricoma Tinción Neisser gránulos Test gránulos de azufre Otras inclusiones celulares NO NO NO PHB PHB GRANULOS Diámetro tricoma Longitud tricoma (µm) Morfología tricoma MICELIAL RECTOS, LIGERAMENTE CURVADOS Localización tricoma EN FLOCULO Y LIBRE EXTENDIENDO SE DESDE FLOCULO TODOS SITIOS Septos celulares visibles Constricciones septos celulares NO SI SI NO SI SI Vaina NO SI NO Crecimiento epifitico NO NO NO Ancho celular (µm) Largo celular (µm) Morfología celular EXTREMOS REDONDEADO S Luis Alfredo Sánchez Bello Página 36

37 otros RAMIFICACION VERDADERA RAMIFICACION FALSA, TIPO ARBOL LIGERAMENTE + AL GRAM Fuente: Manual Práctico para el Estudio de Grupos Bioindicadores en Fangos activos Elaboración: Propia Tabla Clave identificativa para bacterias que normalmente acumulan gránulos de azufre Característica predominante Bacteria filamentosa PRESENTAN AZUFRE NORMALMENTE THIOTHRIX I THIOTHRIX II TIPO 0914 Tinción Gram Tinción Neisser Tricoma Tinción Neisser gránulos Test gránulos de azufre Otras inclusiones celulares Diámetro tricoma (µm) Longitud tricoma (µm) SI SI NO PHB PHB PHB Morfología tricoma RECTOS, LIGERAMENTE CURVADOS RECTOS, LIGERAMENTE CURVADOS RECTOS, LIGERAMENTE CURVADOS Localización tricoma EXTENDIENDOSE DESDE FLOCULO EXTENDIENDO SE DESDE FLOCULO LIBRE Septos celulares visibles Constricciones septos celulares SI SI SI NO NO NO Luis Alfredo Sánchez Bello Página 37

38 Vaina SI SI NO Crecimiento epifitico NO NO NO Ancho celular (µm) Largo celular (µm) Morfología celular RECTANGULARE S RECTANGULARE S CUADRADAS otros ROSETAS Y GONIDIOS ROSETAS Y GONIDIOS GRANULOS CUADRADOS Fuente: Manual Práctico para el Estudio de Grupos Bioindicadores en Fangos activos Elaboración: Propia Para llevar a cabo la identificación de las bacterias filamentosas en este estudio, aparte de la observación microscópica en campo claro, como en contraste de fases, se utilizó la técnica de tinción diferencial de Gram. Como se describe anteriormente en la descripción de los materiales, éste método se basa en la diferenciación de la tinción en las paredes celulares de acuerdo al grado de permeabilidad de las mismas al disolvente aplicado. Los filamentos Gram + se observan de color azul-violeta, y los Gram de color rosado. Luis Alfredo Sánchez Bello Página 38

39 5. RESULTADOS Y DISCUSION 5.1. EVALUACION DE LA CALIDAD DEL FANGO RESULTADOS DE LAS MUESTRAS DEL MBR DE HELADOS ALACANT Tabla 5.1. Caracteristicas macroscópicas H.A. Ponderación asignada CARACTERISTICAS MACROSCÓPICAS / PONDERACIÓN FECHA Turbidez Flóculos en suspensión Sedimentabilidad Olor 20/03/13 Alta / 0 Alta / 0 Media / 4.5 Correcto / 3 21/03/13 Alta / 0 Alta / 0 Baja / 0 Correcto / 3 25/03/13 Media / 4.5 Media / 4.5 Media / 4.5 Correcto / 3 02/04/13 Alta / 0 Alta / 0 Baja / 0 Correcto / 3 03/04/13 Alta / 0 Alta / 0 Baja / 0 Correcto / 3 04/04/13 Media / 4.5 Media / 4.5 Baja / 0 Correcto / 3 05/04/13 Alta / 0 Alta / 0 Baja / 0 Correcto / 3 10/04/13 Alta / 0 Alta / 0 Baja / 0 Correcto / 3 11/04/13 Alta / 0 Alta / 0 Media / 4.5 Correcto / 3 15/04/13 Baja / 9 Baja / 9 Alta / 9 Correcto / 3 16/04/13 Alta / 0 Alta / 0 Baja / 0 Correcto / 3 17/04/13 Alta / 0 Alta / 0 Baja / 0 Correcto / 3 19/04/23 Alta / 0 Alta / 0 Media / 4.5 Correcto / 3 23/04/13 Alta / 0 Alta / 0 Baja / 0 Correcto / 3 25/04/13 Alta / 0 Alta / 0 Media / 4.5 Correcto / 3 26/04/13 Alta / 0 Alta / 0 Media / 4.5 Correcto / 3 Luis Alfredo Sánchez Bello Página 39

40 29/04/13 Alta / 0 Alta / 0 Baja / 0 Correcto / 3 Fuente y elaboración: Propia Tabla 5.2 A. Características microscópicas H.A. Ponderación asignada CARACTERISTICAS MICROSCÓPICAS / PONDERACIÓN FECHA Forma Tamaño Estructura Textura 20/03/13 Irregular / 0 Medio / 7 Compacta / 18 Fuerte / 4 21/03/13 Irregular / 0 Medio / 7 Compacta / 18 Fuerte / 4 25/03/13 Irregular / 0 Medio / 7 Media / 9 Fuerte / 4 02/04/13 Irregular / 0 Pequeño / 4 Abierta / 0 Fuerte / 4 03/04/13 Irregular / 0 Medio / 7 Media / 9 Fuerte / 4 04/04/13 Irregular / 0 Medio / 7 Compacta / 18 Fuerte / 4 05/04/13 Irregular / 0 Medio / 7 Compacta / 18 Fuerte / 4 10/04/13 Irregular / 0 Pequeño / 4 Abierta / 0 Débil / 0 11/04/13 Irregular / 0 Medio / 7 Media / 9 Fuerte / 4 15/04/13 Irregular / 0 Medio / 7 Compacta / 18 Fuerte / 4 16/04/13 Irregular / 0 Medio / 7 Compacta / 18 Fuerte / 4 17/04/13 Irregular / 0 Pequeño / 4 Abierta / 0 Débil / 0 19/04/23 Irregular / 0 Medio / 7 Media / 9 Fuerte / 4 23/04/13 Irregular / 0 Medio / 7 Compacta / 18 Fuerte / 4 25/04/13 Irregular / 0 Medio / 7 Media / 9 Fuerte / 4 26/04/13 Irregular / 0 Medio / 7 Media / 9 Fuerte / 4 29/04/13 Irregular / 0 Medio / 7 Compacta / 18 Fuerte / 4 Fuente y elaboración: Propia Luis Alfredo Sánchez Bello Página 40

41 Tabla 5.2 B. Características microscópicas H.A. Ponderación asignada CARACTERISTICAS MICROSCÓPICAS / PONDERACIÓN FECHA Cobertura Filamentos en floculo Filamentos en disolución Diversidad de protozoos 20/03/13 > 50% / / 7 Alta / 0 < 4 especies / 0 21/03/ % / / 7 Baja / especies / 7 25/03/ % / / 7 Baja / especies / 7 02/04/ % / 7 < 5 / 14 Baja / especies / 7 03/04/ % / / 7 Baja / 3 > 7 especies / 13 04/04/ % / / 7 Baja / especies / 7 05/04/13 > 50% / / 7 Alta / 0 < 4 especies / 0 10/04/ % / 7 < 5 / 14 Baja / 3 < 4 especies / 0 11/04/ % / / 7 Baja / 3 < 4 especies / 0 15/04/13 > 50% / / 7 Alta / especies / 7 16/04/ % / / 7 Baja / 3 < 4 especies / 0 17/04/ % / 7 < 5 / 14 Baja / especies / 7 19/04/ % / / 7 Baja / 3 < 4 especies / 0 23/04/ % / / 7 Baja / 3 < 4 especies / 0 25/04/ % / / 7 Baja / 3 < 4 especies / 0 26/04/ % / 7 < 5 / 14 Baja / especies / 7 29/04/ % / / 7 Baja / especies / 7 Fuente y elaboración: Propia Luis Alfredo Sánchez Bello Página 41

42 RESULTADOS DE LAS MUESTRAS DEL MBR PILOTO DE RINCON DE LEON Tabla 5.3: Características macroscópicas R.L. Ponderación asignada CARACTERISTICAS MACROSCÓPICAS - PONDERACIÓN FECHA Turbidez Flóculos en suspensión Sedimentabilidad Olor 21/03/13 Media / 4.5 Alta / 0 Media / 4.5 Correcto / 3 05/04/13 Baja / 9 Baja / 9 Alta / 9 Correcto / 3 10/04/13 Media / 4.5 Media / 4.5 Media / 4.5 Correcto / 3 19/04/13 Media / 4.5 Media / 4.5 Alta / 9 Correcto / 3 26/04/13 Media / 4.5 Media / 4.5 Media / 4.5 Correcto / 3 Fuente y elaboración: Propia Tabla 5.4 A. Características microscópicas R.L. Ponderación asignada CARACTERISTICAS MICROSCÓPICAS / PONDERACIÓN FECHA Forma Tamaño Estructura Textura 21/03/13 Irregular / 0 Medio / 7 Compacta / 18 Fuerte / 4 05/04/13 Irregular / 0 Medio / 7 Compacta / 18 Fuerte / 4 10/04/13 Irregular / 0 Medio / 7 Compacta / 18 Fuerte / 4 19/04/13 Irregular / 0 Medio / 7 Compacta / 18 Fuerte / 4 26/04/13 Irregular / 0 Medio / 7 Compacta / 18 Fuerte / 4 Fuente y elaboración: Propia Luis Alfredo Sánchez Bello Página 42

43 Tabla 5.4 B. Características microscópicas R.L. Ponderación asignada CARACTERISTICAS MICROSCÓPICAS / PONDERACIÓN FECHA Cobertura Filamentos en floculo Filamentos en disolución Diversidad de protozoos 21/03/13 > 50% / 3.5 < 5 / 14 Baja / especies / 7 05/04/ % / 7 < 5 / 14 Baja / especies / 7 10/04/13 > 50% / 3.5 < 5 / 14 Baja / especies / 7 19/04/13 > 50% / 3.5 < 5 / 14 Baja / especies / 7 26/04/13 Irregular / 0 Medio / 7 Compacta / 18 Fuerte / 4 Fuente y elaboración: Propia 5.2. EVALUACION CUALITATIVA Y CUANTITATIVA DE BACTERIAS FILAMENTOSAS RESULTADOS DE LAS MUESTRAS DEL MBR DE HELADOS ALACANT Tabla 5.5. Bacterias filamentosas MBR H.A. BACTERIAS FILAMENTOSAS FECHA Relación de filamentos IRF (m/ml) Especie dominante Especie Secundaria Parámetros bioindicadores asociados 20/03/13 65,625 Tipo 0211 Microthrix Parvicella Turbidez en el clarificado. Bajas concentraciones de oxígeno disuelto. Influentes ricos en grasas. ph > 7. 21/03/13 65,625 Tipo 0041 Tipo 0411 Turbidez en el clarificado. Elevada Luis Alfredo Sánchez Bello Página 43

44 edad del fango. Asociado a vertidos industriales. 25/03/13 39,375 Microthrix Parvicella Tipo 021N Bajas concentraciones de oxígeno disuelto. Influentes ricos en grasas. ph > 7. Deficiencia de Nitrogeno. 02/04/13 26,25 Tipo /04/13 65,625 Nocardia sp. Tipo /04/13 91,875 Tipo Turbidez en el clarificado. Elevada edad de fango. Buena aireación. Compuestos grasos en el influente Elevada edad del fango, bajas cargas másicas 05/04/13 65,625 Microthrix Parvicella Nostocoida Limicola II Baja carga másica. Niveles bajos de oxígeno disuelto. Vertidos industriales. 10/04/13 52,5 Tipo 021N Tipo /04/13 78,75 Tipo 0041 Tipo 0211 Baja carga másica. Elevada edad de fangos. Afluentes industriales bajos en nitrógeno. Turbidez en el clarificado. Baja carga másica. Elevada edad de fangos. 15/04/13 78,75 Nostocoida Limicola I Nostocoida Limicola II Bajas cargas másicas. Baja concentración de oxígeno disuelto. Vertidos Luis Alfredo Sánchez Bello Página 44

45 industriales. 16/04/13 91,875 Nostocoida Limicola I - Bajas cargas másicas. Baja concentración de oxígeno disuelto. Vertidos industriales 17/04/13 39,375 Nocardia sp. Tipo 0211 Elevada edad del fango. Turbidez. Condiciones de buena aireación. 19/04/23 52,5 Microthrix Parvicella - Bajas concentraciones de oxígeno disuelto. Influentes ricos en grasas. ph > 7. Deficiencia de Nitrogeno. 23/04/13 131,25 Tipo 021N Tipo 0211 Bajas cargas másicas. Turbidez en el clarificado 25/04/13 65,625 Nostocoida Limicola II Nostocoida Limicola I Baja carga másica. Niveles bajos de oxígeno disuelto. Vertidos industriales 26/04/13 91,875 Microthrix Parvicella - Bajas concentraciones de oxígeno disuelto. Influentes ricos en grasas. 29/04/13 65,625 Tipo Turbidez en el clarificado. Asociada a aguas de origen industrial. Fuente y elaboración: Propia Luis Alfredo Sánchez Bello Página 45

46 RESULTADOS DE LAS MUESTRAS PILOTO DE RINCON DE LEON Tabla 5.6. Bacterias filamentosas MBR R.L. BACTERIAS FILAMENTOSAS FECHA Relación de filamentos IRF (m/ml) Especie dominante Especie Secundaria Parámetros bioindicadores asociados 21/03/13 78,75 Tipo 0041 Tipo /04/13 65,625 Tipo 0581 Tipo /04/13 65,625 Tipo Elevada edad de fangos. Baja carga másica. Turbidez en el clarificado. Elevada edad del fango. Asociado a vertidos industriales. Elevada edad de fangos. Baja carga másica. 19/04/13 39,375 Nostocoida Limicola I - Baja carga másica. Niveles bajos de oxígeno disuelto. 26/04/13 52,5 Nocardia sp. Tipo 0211 Elevada edad de fango. Buena aireación. Fuente y elaboración: Propia DESCRIPCION DE BACTERIAS FILAMENTOSAS ENCONTRADAS Nostocoida limícola I La morfología de este organismo es ligeramente curvada y enrollada. Posee un diámetro del tricoma entre 0.3 y 0.5 µm. Presenta una fuerte respuesta Gram +. Parámetros bioindicadores: Baja carga másica. Vertidos industriales. Eliminado del sistema con tiempos de retención celular inferiores a los 4 días. Luis Alfredo Sánchez Bello Página 46

47 Figura 5.1. Nostocoida limicola I. 1000x, campo claro. Repuesta Gram + Tipo 0211 Filamentos de forma curvada y doblada. Diámetro del tricoma entre 0.6 y 0.8 µm. Se extienden fuera del flóculo y no presenta vaina ni crecimiento adherido. Respuesta intensa Gram -. Parámetros bioindicadores: turbidez en el clarificado. Asociada a aguas residuales de origen industrial. Figura 5.2. Tipo x, campo claro. Respuesta Gram - Nostocoida limícola II Filamentos torcidos o enrollados. Diámetro del tricoma entre 1.0 y 1.4 µm. forma celular oval, semiesférica. Respuesta Gram -. Septos celulares visibles así como las constricciones de dichos septos. Luis Alfredo Sánchez Bello Página 47

48 Parámetros bioindicadores: baja carga másica. Deficiencias de oxígeno en el reactor. Característicos de vertidos industriales. Figura 5.3. Nostocoida limicola II. 1000x, campo claro Respuesta Gram - Tipo 0041 Filamentos ligeramente curvados. Diámetro del tricoma entre 1.2 y 1.6 µm. Respuesta Gram -. La presencia de crecimiento epiftico importante puede provocar que no se vean los septos celulares. Parámetros bioindicadores: Asociados a altas edades del fango y bajas cargas másicas. Figura 5.4. Tipo x, campo claro. Respuesta Gram Luis Alfredo Sánchez Bello Página 48

49 FECHA Flagelados Amebas Carnívoro nadador Carnívoro suctor Bacteriófago nadador Bacteriófago reptante Bacteriófago sésil Rotíferos Nematodos Anélidos Bioindicación para el control del proceso de tratamiento biológico de aguas residuales industriales en la Microthrix parvicella Filamentos enrollados. Diámetro del tricoma entre 0.6 y 0.8 µm. No presenta ramificaciones ni movilidad. Respuesta intensa a la tinción Gram +. Parámetros bioindicadores: bajas cargas másicas. Influentes ricos en grasas. Bajas temperaturas y ph > 7 siendo el óptimo 8. Figura 5.5. Microthrix parvicella. 1000x, campo claro. Respuesta Gram EVALUACION CUANTITATIVA Y CUALITATIVA DE PROTOZOOS Y METAZOOS RESULTADOS DE LAS MUESTRAS DEL MBR DE HELADOS ALACANT Tabla 5.7. Protozoos y metazoos MBR H.A PROTOZOOS METAZOOS 20/03/ Luis Alfredo Sánchez Bello Página 49

50 21/03/ /03/ /04/ /04/ /04/ /04/ /04/ * /04/ * /04/ /04/ /04/ /04/ /04/ /04/ /04/ /04/ * Se observaron varios rotíferos muertos en la muestra Fuente y elaboración: propia Como se puede apreciar en la tabla 5.6, la mayor parte de microorganismos hallados se encuentran entre ciliados bacteriófagos reptantes y rotíferos. En base a esta relevante agrupación, podemos aseverar que las condiciones del reactor biológico son óptimas, debido a que las especies sindicadas en cada una de los grupos mencionados, tienen asociados parámetros bioindicadores de buenos rendimientos en la depuración. En los días 10 y 11, se observó una mortandad, especialmente de lecánidos, lo que se atribuye a que ingresó algún compuesto de limpieza de características un tanto tóxicas utilizado en la fábrica, que provoco este suceso. Luis Alfredo Sánchez Bello Página 50

51 FECHA Flagelados Amebas Carnívoro nadador Carnívoro suctor Bacteriófago nadador Bacteriófago reptante Bacteriófago sésil Rotíferos Nematodos Anélidos Bioindicación para el control del proceso de tratamiento biológico de aguas residuales industriales en la RESULTADOS DE LAS MUESTRAS DEL MBR PILOTO DE RINCON DE LEON Tabla 5.8. Protozoos y metazoos MBR R.L PROTOZOOS METAZOOS 21/03/ /04/ /04/ /04/ /04/ Fuente y elaboración: propia Como se aprecia en la tabla anterior, la distribución de la microfauna muy similar a las muestras tomadas del licor mezcla de Helados Alacant, nos permite confirmar también, que el licor mezcla del MBR piloto de Rincón de, posee buenos rendimientos en la depuración, así como también una elevada edad del fango DESCRIPCION DE ORGANISMOS REPRESENTATIVOS ENCONTRADOS A continuación se describen las características más relevantes y los parámetros bioindicadores asociados a las especies más representativas encontradas en las observaciones de ambos casos. Arcella sp. Esta ameba testácea fue observada con frecuencia. Presenta una testa pequeña, dorsoventralmente aplanada y de perfil circular. La clave identificativa Luis Alfredo Sánchez Bello Página 51

52 es la abertura ventral centrada e invaginada, con una célula visible en su interior. Parámetros bioindicadores: en general, buenos rendimientos en la depuración. Buena oxigenación y condiciones de nitrificación. Figura 5.6. Arcella sp. 400x, campo claro Carchesium polypinum Este bacteriófago sésil fue observado en colonias ramificadas en varias observaciones. Poseen pedúnculo ramificado y zooides ligeramente acampanados. Presentan espasmodesmas discontinuos que permite la contracción independiente de cada individuo en la colonia. Parámetros bioindicadores: licor mezcla de muy buena calidad. Buena oxigenación. Figura 5.7. Carchesium polypinum. 200x, campo claro Luis Alfredo Sánchez Bello Página 52

53 Epistylis sp. Organismo colonial, con pedúnculo ramificado. La colonia no es contráctil pero los zooides pueden contraer el labio peristomal de forma independiente. Parámetros bioindicadores: Media carga. Figura 5.8. Epistylis sp. 400x, campo claro Aspidisca cicada Este bacteriófago reptante, es el organismo más representativo en este grupo, debido a que aparece en gran parte de las muestras observadas. Posee un lado dorsal abombado y ventral aplanado. Costillas en el lado dorsal y cirros en el lado ventral. Parámetro bioindicador: en general, característico de fangos bien estabilizados. Figura 5.9. Aspidisca cicada. 400x, campo claro Luis Alfredo Sánchez Bello Página 53

54 Rotaria sp. Uno de los metazoos más abundante en las muestras. De forma alargada, color pardo, movimientos locomotores por plegamientos. Parámetros bioindicadores: Elevadas edades de fango. Buena calidad de agua tratada. Figura Rotaria sp. 100x, campo claro Lecane sp. Rotifero de cuerpo redondeado con caparazon externo. Movimiento por contracciones. Parámetros bioindicadores: Procesos muy estabilizados. Eficiencia en la depuración. Figura Lecane sp. 200x, campo claro Nematodos Luis Alfredo Sánchez Bello Página 54

55 Se observaron en algunas muestras, junto a rotiferos y aspidiscas en algunas muestras. Son gusanos planos de importante tamaño. Su alimentacion se basa en otros protozoos. Parametros bioindicadores: Indicadores de una elevada edad del fango. Figura 5.12: Nematodos. 100x, campo claro Anélidos Organismos vermiformes, muy activos. Poseen vacuolas de color rojo Parámetros bioindicadores: altas edades del fango, buenos rendimientos en la depuración. Figura 5.13: Anélido. 100x, campo claro 5.4. ESTUDIO COMPARATIVO Y CORRELACION DE DATOS Luis Alfredo Sánchez Bello Página 55

56 Para llevar a cabo el estudio comparativo, se solicitaron los datos de las analíticas realizadas en ambas plantas en los días que se realizó el análisis microbiológico de las muestras (o cercanas a éstos). En la siguiente tabla, tenemos la relación entre la categoría del fango obtenida, a través del Índice de Fangos, la edad del lodo correspondiente a la fecha, y la concentración en el reactor biológico. Tabla 5.9: Comparación de datos analíticos con las categorías obtenidas MBR Helados Alacant MBR H.A. Índice de Edad del SSLM (g/l) Fangos (IF) lodo (días) 20/03/13 Malo /03/13 Regular /03/13 Bueno /04/13 Regular /04/13 Regular /04/13 Bueno /04/13 Regular /04/13 Malo /04/13 Regular /04/13 Bueno /04/13 Regular /04/13 Regular /04/23 Regular /04/13 Regular /04/13 Regular /04/13 Regular /04/13 Regular Fuente: Datos analíticos MBR Helados Alacant Elaboración: Propia Media SSLM 8.38 Luis Alfredo Sánchez Bello Página 56

57 Tabla 5.10: Comparación de datos analíticos con las categorías obtenidas MBR Piloto Rincón de MBR R.L. Índice de Edad del SSLM (g/l) Fangos (IF) lodo (días) 21/03/13 Bueno /04/13 Óptimo /04/13 Bueno /04/13 Bueno /04/13 Bueno Fuente: Datos analíticos MBR Piloto Rincón de Elaboración: Propia Media SSLM 7.86 Claramente, se observa que en las muestras del MBR de Helados Alacant, al tener una edad del lodo inferior al del MBR piloto de Rincón de, la categoría del lodo, como media, está en regular, mientras que en el otro caso se tiene una categoría buena como media. Como aclaración, la edad del lodo en la planta piloto de Rincón de, es bastante elevada y tiende a aumentar en el tiempo, debido a que está sometida a un estudio de trabajo a una edad del lodo infinita, por lo que los operarios suprimen la purga y aumentan dicha edad para los fines de su investigación. Mientras que en la EDARi de Helados Alacant, la edad del lodo se mantiene constante, debido a que ya tienen una frecuencia de purga establecida, procurando tener en las mejores condiciones del licor mezcla en el reactor biológico. El reparto porcentual de protozoos y metazoos en el estudio, genera una sensibilidad elevada a la hora de evaluar y controlar el proceso de depuración en ambas plantas. Como se puede apreciar en las figuras 12 y 13, la distribución media de los organismos encontrados, la predominancia de rotíferos, como Rotaria sp y Lecane sp, y por el otro lado, de bacteriófagos reptantes, como la Aspidisca sp y Euplotes sp, en base a las características bioindicadoras de los mismos, dan fe de la estabilidad del sistema y la eficiencia de depuración en ambos casos. Luis Alfredo Sánchez Bello Página 57

58 Fuente y elaboración: Propia Figura Reparto porcentual Protozoos y Metazoos MBR Helados Alacant Fuente y elaboración: Propia Figura Reparto porcentual Protozoos y Metazoos MBR Rincón de Luis Alfredo Sánchez Bello Página 58