Naturaleza y Desarrollo Vol.9 Núm.2, Julio-Diciembre, 2011

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1 Naturaleza y Desarrollo Vol.9 Núm.2, Julio-Diciembre, 2011 Hongos entomopatógenos para el control de mosquitas blancas (Bemisia tabaci Gennadius, Bemisia argentifolii Bellows & Perring y Trialeurodes vaporariorum Westwood) Entomopathogenic Fungi for the Control of Whiteflies (Bemisia tabaco Gennadius, Bemisia argentifolii Bellows & Perring and Trialeurodes vaporariorum Westwood) Margarito Ortiz-Catón 1*, R. Alatorre-Rosas 2, Laura Ortega-Arenas 2, A. Ortiz Catón 3, Sergio Alvarado-Casillas 1, L. S. Ibarra-Sanchez 1, C. Santillan-Ortega 1 1 Unidad Académica de Agricultura de la Universidad Autónoma de Nayarit. Km 9 Carr. Tepic-Compostela. 2 Colegio de Postgraduados, Montecillo Estado de México. 3 Universidad Tecnológica de la Costa. *Correspondencia: margaritooc1@hotmail.com Resumen. Los hongos entomopatógenos son una alternativa real para el manejo integrado de mosquitas blancas. En el presente trabajo se determinó la efectividad de cuatro cepas de Paecilomyces fumosoroseus (P2, P3, PF y PG), dos de Verticillium lecanii (V2 y V3) y dos de Beauveria bassiana (Bb1 y Bb17), con base en la mortalidad de ninfas del cuarto ínstar (N4) de Bemisia tabaci, B. argentifolii y Trialeurodes vaporariorum. La efectividad se estimó en miles de conidias por ninfa del cuarto instar. Las cepas de mayor efectividad fueron PG (10320 ninfas muertas), P3 (15510), PF (15670) y V2 (20000) para B. tabaci; Bb17 (14520), V3 (18450), PG (20000) y P3 (20130) para B. argentifolii; y V2 (16810), Bb1 (17830), V3 (21050) y P3 (22130) para T. vaporariorum. Palabras clave: Efectividad biológica, hongos entomopatógenos, mosquitas blancas. Abstract. Entomopathogenic fungi are a real alternative for the integrated management of whiteflies. In the present study, the effectiveness of four isolates of Paecilomyces fumosoroseus (P2, P3, PF and PG), two of Verticillium lecanii (V2 and V3) and two of Beauveria bassiana (Bb1 and Bb17) were determined, based on the mortality of nymphs of Bemisia tabaci, B. argentifolii and Trialeurodes vaporariorum at the fourth nymphal instar (N4). Effectiveness was estimated in thousands of conidia per fourth instar nymph. The isolates PG (10320 dead nymphs), P3 (15510), PF (15670) and V2 (20000) were the most effective in controlling B. tabaci; Bb17 (14520 dead nymphs), V3 (18450), PG (20000) and P3 (20130) for B. argentifolii; and V2 (16810), Bb1 (17830), V3 (21050) and P3 (22130) for T. vaporariorum. Key words: Biological effectiveness, entomopathogenic fungi, whiteflies. 5 Cita sugerida: Ortiz-Catón, M., R. Alatorre-Rosas, L. Ortega-Arenas, A. Ortiz-Catón, S. Alvarado- Casillas, L. S. Ibarra-Sánchez y C. Santillán-Ortega Hongos entomopatógenos para el control de mosquitas blancas (Bemisia tabaci Gennadius, Bemisia argentifolii Bellows & Perring y Trialeurodes vaporariorum Westwood). Naturaleza y Desarrollo 9(2):5-14.

2 Ortiz-Catón et al. Introducción Se estima que existen más de 700 especies, incluyendo subespecies, patotipos y cepas de hongos como agentes de control de plagas insectiles (Bielikova et al., 2002). Las especies más estudiadas y utilizadas como agentes de control biológico en el mundo corresponden a Metarhizium anisopliae (Metsch.) Sorok, Paecilomyces fumosoroseus (Wize) Brown and Smith, Verticillium lecanii (Zimmerman) Viégas reclasificado como Lecanicillium muscarium (Petch) Zare & Gams (Cuthbertson y Walters, 2005) y Beauveria bassiana (Balsamo) Vuillemin (López y Borge, 2001; Bielikova et al., 2002). Los hongos entopatógenos Beauveria bassiana y Paecilomyces fumosoroseus que afectan las mosquitas blancas (Bemisia argentifolii Bellows and Perring, Trialeurodes vaporariorum Westwood y Bemisia tabaci) también tienen potencial para el biocontrol de otras plagas (Wraight et al., 2000; Shi et al., 2009; Cuthbertson et al., 2005). Estos hongos, se pueden encontrar en rastrojos de cultivos, estiércoles, en el suelo y sobre la vegetación en forma natural (López y Börje, 2001). La efectividad biológica de los hongos entomopatógenos depende de varios factores como son: tipo de formulación (Shah y Pell, 2003; Lomer et al., 2001; Shi et al., 2009), variación genética del aislamiento, virulencia (Ortiz-Urquiza et al., 2010), temperatura (Bugeme et al., 2008; Cuthbertson et al., 2005), humedad relativa, especie y estado biológico del hospedante (Wraight et al., 2010; Cuthbertson et al., 2005), concentración y tipo de inóculo y el método de inoculación (Ferron, 1978). En general los hongos entomopatógenos Verticillium lecanii, Beauveria bassiana y Paecilomyes fumosoroseus, tienen mayor efectividad sobre los estados ninfal y larval, pero es menor o casi nulo sobre huevecillos y adultos de mosquitas blancas y otros insectos (Gindin et al., 2000: Wraight et al., 2000). B. bassiana conocida como muscardina blanca afecta a insectos de diferentes grupos taxonómicos, aunque se menciona que es bastante raro encontrarlo sobre homópteros (Ming-Guang et al., 1990). Por otro lado, algunas pruebas de efectividad de cepas de B. bassiana sobre Panthrhytes plutus (Hemiptera) han mostrado variación en la concentración o dosis letal media (CL 50 = DL 50 ) en el rango de 1.18 x 10 3 a 4.29 x 10 4 esporas/ml (Prior et al., 1987), dentro del tiempo letal medio (TL 50 ), entre aislamientos y plagas (Wraight et al., 2010; Migiro et al., 2010). El hongo Verticillium lecanii (Zimm.) Viegas, es un patógeno típico de los homópteros; aunque también puede afectar a insectos de otros grupos taxonómicos. Las ninfas y adultos de las mosquitas son los más afectados por este hongo, según Osborne y Landa (1992). Drummond et al. (1987) estimaron que las CL 50 de 1.3 x 10 5 a 4.2 x 10 7 conidias/ml de V. lecanii provocaron mortalidad en el cuarto ínstar ninfal de Trialeurodes vaporariorum, y que los tiempos letales medios (TL 50 ) variaron de 9 a 5.7 días, en ambientes de 19 ± 1 C y mayor de 95% de humedad relativa (HR). Por otra parte, en condiciones de invernadero, Kanagaratnam et al. (1982) realizaron aspersiones de 1 x

3 Naturaleza y Desarrollo Vol.9, Núm.2, Julio-Diciembre, 2011 conidias/ml, las que produjeron de 85 a 96% de mortalidad en ninfas de Trialeurodes vaporariorum. También, se ha documentado que a diferentes temperaturas, V. lecanni tiene efectos diferenciales de efectividad contra Thrips palmi (Cuthbertson et al., 2005). El hongo Paecilomyces fumosoroseus (Wize) Brown & Smith, puede afectar adultos, ninfas y huevecillos de mosquitas blancas y otros insectos pertenecientes a varios grupos taxonómicos (Osborne y Landa, 1992). Se han calculado de 50 a 100 conidias/mm 2 las CL 50 de cepas (aislamientos) de B. bassiana y P. fumosoroseus sobre el primer instar ninfal (N1) de Bemisia argentifolii. En este caso, la infección se produce a las 24 horas, sólo si la humedad relativa ha permanecido en 100%. También se han observado mortalidades de 40 a 60% en condiciones de humedad más baja con concentración de 1000 conidios/mm 2 ; sin embargo, la mortalidad de adultos es baja (Wraight et al., 2000). Por otra parte, Pineda-Guillermo y Alatorre- Rosas (1995) encontraron que, los aislamientos más virulentos en contra de los primeros instares ninfales de T. vaporariorum, en orden descendente, fueron P. fumosoroseus (P2), Verticillium lecanii (V3) y Beauveria bassiana (Bb), mientras que para el cuarto instar (N4) fueron los de B. bassiana seguido de V. lecanii (V3). La infección de V. lecanii y P. fumosoroseus es más rápida que la de A. aleyrodis, porque ocurre en 24 horas después del contacto de las esporas con el cuerpo del hospedero. P. fumosoroseus puede atacar por el dorso de la ninfa y 24 horas después se pueden detectar hifas en el hemocelo. Es decir, en 48 horas el micelio puede salir al exterior y en 72 horas produce la esporulación (Osborne y Landa, 1992). Este mismo hongo, en condiciones de invernadero y de campo con alta HR mata rápidamente a las mosquitas blancas (Osborne y Landa, 1992: Lourenção et al., 2001). El objetivo de este trabajo fue determinar la efectividad de aislamientos de hongos entomopatógenos contra tres especies de mosquita blancas. Materiales y Métodos Virulencia de hongos entomopatogénicos en tres especies de mosquitas blancas Se estimó la efectividad de las cepas (aislamientos) de hongos entomopatógenos sobre ninfas de T. vaporariorum, procedentes de un cultivo de frijol en Chapingo, México; de B. tabaci de un cultivo de chile Serrano (Capsicum sp.) de Ahuacatlán, Nayarit; y de B. argentifolii capturada en un cultivo de nochebuena (Euphorbia pulcherrima) de Xochimilco D.F., México. La selección de los aislamientos de los hongos se realizó por la mortalidad que ocasionaban algunas de las aplicaciones de esporas (varias dosis o concentraciones), y posteriormente se estimó la virulencia de los aislamientos seleccionados. Selección de aislamientos de hongos entomopatogénicos Para realizar la selección, se consideraron 35 aislamientos de hongos de las especies Verticillium lecanii, Beauveria bassiana, Paecilomyces fumosoroseus, P. farinosus y P. javanicus, obtenidas en el laboratorio de 7

4 Ortiz-Catón et al. Patología de Insectos del Instituto de Fitosanidad del Colegio de Postgraduados, del CINVESTAV- Irapuato, Guanajuato, y cepas procedentes del Estado de Nayarit, México (Cuadro 1). La selección de los aislamientos se realizó a partir de los resultados de la aplicación de 1 x 10 8 conidias/ml de agua, en hojas de jitomate (var. Río Grande) infestado con cuatro ínstares ninfales (N1, N2, N3 y N4), huevecillos y adultos de tres especies de mosquita blanca (T. vaporariorum, B. tabaci y B. argentifolii). Las hojas de jitomate se colocaron dentro de cámaras húmedas, y las evaluaciones de mortalidad de moscas se realizaron cada 24 horas. Al final, se seleccionaron las cepas que produjeron mayor mortalidad en cualquiera de las etapas biológicas, sin considerar el tiempo. Cuadro 1. Origen de las cepas de cinco especies de hongos, utilizadas en las pruebas preliminares de cuatro estados ninfales de tres especies de mosquita blanca, Montecillo, México Especies Identificador de cepa Origen de la cepa B. bassiana 15 Bb Laboratorio de Patología CP B. bassiana 1 Bb Nayarit (Broca del café) B. bassiana 1 Bb Comercial V. lecanii 1 V Nayarit (pulgones) V. lecanii 9 V Patología CP P. fumosoroseus 1 P Nayarit (mosquitas blancas) P. javanicus 1 P CINVESTAV P. farinosus 1 P Nayarit (mosquitas blancas) P. fumosoroseus 1 P Jalisco (gallina ciega) P. fumosoroseus 1 P CINVESTAV P. fumosoroseus 3 P Laboratorio Patología CP Estimación de las DL 50 y DL 95 Para medir la virulencia de los aislamientos seleccionados, en todas las pruebas realizadas, se usó el método topical para las tres especies de mosquitas blancas y aislamientos de hongos. Este método consistió en depositar una gota de 2 µl de cada una de las diferentes dosis y un testigo blanco (agua) sobre el dorso de 20 ninfas de cuarto instar (N4). Cabe señalar que la dosis más baja fue de 200 conidias/ninfa. La aplicación se realizó con un micro-aplicador de 10 µl y con ayuda de un microscopio de disección. Los siete tratamientos integrados (dosis) y tres repeticiones, se evaluaron bajo un diseño completamente al azar. Las dosis se integraron por 2 x 10 7, 2 x 10 6, 2 x 10 5, 2 x 10 4, 2 x 10 3 y 200 conidias por ninfa, el factor de dilución fue de 10. Se emplearon conidias de cultivos de 15 días de edad mantenidas en una cámara germinadora regulada a 27.5 ± 0.5 C, 95-98% de humedad relativa y 12 horas luz. Después de 96 horas de la inoculación, se registró la mortalidad de ninfas como todas aquellas que cambiaron de color y con micelio. Análisis estadístico Los datos de mortalidad obtenidos por cepa, se sometieron a un análisis de varianza y la respectiva comparación de medias por el método de Tukey 8

5 Naturaleza y Desarrollo Vol.9, Núm.2, Julio-Diciembre, 2011 (Martínez, 1988). Con la información de las evaluaciones de mortalidad por cepa, se estimó la DL 50 y DL 95 de cada aislamiento (expresada en miles de conidias/ninfa) y posteriormente se hizo un análisis de regresión (Raymond, 1985). Resultados y Discusión Selección de aislamientos de hongos entomopatogénicos por mortalidad De los 35 aislamientos evaluados a la concentración de 1 x 10 8 esporas por mililitro de agua, se determinó que las cepas P1, P2, P3, PF, PN, PG, V2, V3, Bb1 y Bb17 indujeron los mayores porcentajes de mortalidad de mosquitas blancas. En el caso de los adultos, el aislamiento PN tuvo la mayor mortalidad (57-62%) y P1 fue el que presentó el mayor número de huevecillos infectados (66-75%). No obstante, esto contradice lo señalado por algunos investigadores de que, los estados de huevo y adulto son poco afectados por los hongos entomopatógenos (Gindin et al., 2000). En la mortalidad del estado ninfal, se seleccionaron los aislamientos de P. fumosoroseus y V. lecanii debido a que causaron mortalidad hasta del 97% de mosquitas blancas, 96 horas después de la aplicación de los aislamientos. En estos ensayos, se registró que las ninfas de los primeros tres ínstares (N1, N2 y N3) fueron susceptibles tal y como lo mencionan Gindin et al. (2000). Estos ínstares, después de cinco o seis días, presentaron signos de desecación; mientras que en algunas mosquitas del instar N4, se detectó desarrollo de micelio sobre el dorso pero aún así se produjo la emergencia de adultos; lo que significa que, el hongo no produjo infección en forma interna (Cuadro 2). En el cuarto instar (N4) de B. tabaci, los resultados de los bioensayos muestran que para DL 50, los cuatro aislamientos que utilizaron menor cantidad de conidias fueron PG (10321 conidias), P3 (15519 conidias), PF (15641 conidias) y V2 (20000 conidias). En otro caso, para inducir la mortalidad mayor (DL 95 ), los aislamientos que usaron un menor número de conidias fueron PG ( conidias), V2 ( conidias), P3 ( conidias) y V3 ( conidias). En ambos casos se observa que PG, P3 y V2 requirieron menor cantidad de conidias por matar las ninfas, esto comparado con el resto de cepas. Los valores mayores de las DL 50 y DL 95, se obtuvieron en Bb17 y los menores en el aislamiento PG (Cuadro 3). En el análisis de varianza para la dosis letal media, los aislamientos presentaron diferencias significativas (P < 0.05) en respuesta. En la comparación de medias se obtienen diferencias estadísticas en la DL 50 para aislamientos PG, P3, PF y V2 en relación a los demás aislamientos evaluados. Esto es, las más bajas cantidad de conidias para la letalidad media al cuarto instar (N4) de B. tabaci (Cuadro 3) En cuanto a la reacción en B. argentifolii, primero en el análisis de varianza de las dosis letal media se determinaron diferencias significativas (P<0.05) entre cepas o aislamientos evaluados. Para este caso los aislamientos Bb1 (14520), V3 (18450), PG (20000), P3 (20130), Bb17 (20610) y V2 (23970), resultaron los más sobresalientes debido a que requirieron menor cantidad de conidias para inducir la DL 50 en el cuarto instar (N4). En este 9

6 Ortiz-Catón et al. Cuadro 2. Porcentaje de mortalidad de ninfas de Trialeurodes vaporariorum, Bemisia tabaci y B. argentifolii, causada por cepas de hongos entomopatógenos, en pruebas de selección entomopatogénicas bajo condiciones controladas. Cepas Estado ninfar Trialeurodes vaporariorum Bemisia tabaci Bemisia argentifolii 1 Bb17 N N N N Bb1 N N N N V2 y 3 N N N N PN N N N N PF N N N N P1, 2, 3 y G N N N N Estimación de las DL 50 y DL 95. Cuadro 3. DL 50 y DL 95 (expresada en miles de conidias) de los aislamientos de hongos entomopatógenos de Bemisia tabaci, y coeficientes de regresión (b) con base en la efectividad. Cepas DL 50 en instar N4 Límites fiduciales b ± S 2 χ 2 DL 95 en instar N4 Límites fiduciales Bb a ± V ab ± P ab ± Bb c ± V bc ± PF c ± P c ± PG c ± Medias con la misma letra no son estadísticamente diferentes (Tukey α=0.05); 2Desviación estándar. mismo sentido, los aislados más importantes para generar una DL 95 fueron PG (196090), V3 (772120), P2 (796090) y Bb1 (812560). En la comparación de medias de la DL 50, se observó que los aislamientos Bb1, V3, PG, P3, Bb17 y V2 necesitaron menor cantidad de conidias para provocar el 50% de la mortalidad de mosquitas. Los requerimientos más altos de número de 10

7 Naturaleza y Desarrollo Vol.9, Núm.2, Julio-Diciembre, 2011 conidias para inducir la DL 50 (40.38 y conidias), se presento en los aislamientos PF y P2, y consecuentemente también necesitaron más conidias para provocar las DL95 ( y conidias), Cuadro 4. Cuadro 4. DL 50 y DL 95 (expresada en miles de conidias/n4) de aislamientos de hongos en ninfas del cuarto instar (N4) de Bemisia argentifolii, y coeficientes de regresión (b) con base en la efectividad. Cepas DL 50 en Límites b ± S 2 χ 2 DL 95 en Límites fiduciales instar N4 fiduciales instar N4 PF a ± P ab ± V bc ± Bb c ± P c ± PG c ± V c ± Bb c ± Medias con la misma letra no son estadísticamente diferentes (Tukey, P 0.05); 2Desviación estándar. Los resultados de mortalidad inducida en T. vaporariorum muestran que, hubo diferencias significativas en la respuesta entre aislamientos. Los aislamientos que requirieron menor cantidad de conidias para causar la mortalidad DL 50 del N4 fueron PF (16810), Bb1 (17830), V3 (21050) y P3 (22130), y para la DL 95 fueron Bb1 y P3 (Cuadro 5). Pineda y Alatorre (1995) coinciden en que los aislamientos Bb1 y V3 fueron las más efectivos sobre T. vaporariorum. Los aislamientos V2, Bb1, V3 y P3 provocaron semejante mortalidad del cuarto instar y también lograron la DL 95 con el menor número de conidias (Cuadro 5). Todo esto también muestra la variabilidad diferencial en las mortalidades inducidas de Trialeurodes vaporariorum por los aislamientos Por todo lo anterior, al comparar la efectividad, a nivel de DL 50, de cada una de los aislamientos de hongos sobre el cuarto estado ninfal de las tres especies de mosquitas, se observó como promisorios para un estudio con mayor profundidad a los aislamientos P2, P3 y V2, ya que su respuesta de mortalidad inducida fue más constante a través de las especies de mosquitas. Por el contrario, los otros aislamientos fueron más inconsistentes en inducir la DL 50 en las tres especies de mosquitas evaluadas. No obstante, también puede observarse interacciones de especificidad entre los aislamientos y especies de mosquitas controladas. Por ejemplo, la respuesta en DL 50 de las poblaciones evaluadas de T. vaporariorum fueron de mayor susceptibilidad a todos los aislamientos, excepto a V3, Bb1 y Bb17. También B. tabaci fue más sensible a PG y PF; y B. argentifolii a V3, Bb1 y Bb17. Los aislamientos que presentaron mayor inconsistencia de respuesta fueron PG, PF, V3, Bb1 y Bb17. En general, los aislamientos que presentó la DL 50 más baja, en las tres especies, fue P3 que osciló de a miles de conidias/n4 (Cuadro 6). 11

8 Ortiz-Catón et al. Cuadro 5. DL 50 y DL 95 (expresada en miles de conidias) de los aislamientos de hongos, sobre ninfas de cuarto instar (N4) de Trialeurodes vaporariorum, y coeficientes de regresión (b) con base en la efectividad. Cepas DL 50 en Límites b ± S 2 χ 2 DL 95 en Límites fiduciales instar N4 fiduciales instar N4 PF a ± P ab ± PG bc ± Bb cd ± P de ± V de ± Bb de ± V e ± Medias con la misma letra no son estadísticamente diferentes (Tukey, P 0.05); 2Desviación estándar. Cuadro 6. Comparación estadística de las DL 50 (miles de conidias/n4) de ocho aislamientos de hongos sobre tres especies de mosquita blanca. Especie de P2 P3 PG PF V2 V3 Bb1 Bb17 mosquita B. tabaci a a b c a a a a B. argentifolii a a b b a b b b T. vaporariorum a a a a a b b b 1 Medias con la misma letra no son diferentes (Tukey, P 0.05). Conclusiones En este trabajo, la aplicación de ocho aislamientos de P. fumosoroseus y V. lecanii causaron mortalidad hasta del 97% en mosquitas blancas (Bemisia tabaci, Bemisia argentifolii y Trialeurodes vaporariorum). Los aislamientos que requirieron menor cantidad de conidias para eliminar al 50% de las poblaciones de B. tabaci fueron Paecilomyces fumosoroseus cepas PG (10325 conidias), P3 (15519 conidias), PF (15671 conidias); en B. argentifolii las cepas más efectivas fueron Bb17 (14524 conidias) y V3 (18458 conidias); y en T. vaporariorum, V2 (16813 conidias), Bb1 (17831 conidias) y V3 (21054 conidias). Literatura citada Bielikova, L., Z. Landa, L. Osborne & V. Curn Characterization and identification of entomopathogenic and mycosporasitic fungi using RAPD-PCR technique. Plant Prot. Sci. 38, Bugeme, D.M., N.K. Maniania, M. Knapp & N.I. Boga Effect of temperature on virulence of Beauveria bassiana and Metarhizium anisopliae isolates to Tetranychus evansi. Exp. Appl. Acarol. 46, Drummond, J., J.B. Heale & T. Gillespie Germination and effect of reduced humidity on expression of patogenicity in Verticillium lecanii 12

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10 Ortiz-Catón et al. Memoria XVIII Congreso Nacional de Control Biológico y I Cong. Americano de Control Biológico. Tapachula, Chiapas, México. pp: Prior, C, P.. Jollands & G.L. Patourel Infectivity of oil and water formulations of Beauveria bassiana (Deuteromycotina: Hyphomycetes) to the cocoa Weevil Pest Pantorhytesplutus (Coleoptera: Curcurlionidae). J. Invertebr. Pathol. 52, Raymond, M Presentation dún programme Basic dánalyse log-probit pour microordinateur. Cah. O.R.S.T.O.M. Ser. Entomol. Méd. Parasitol. 28, Shah, P.A. & J.K. Pell Entomopathogenic fungi as biological control agents. Appl. Microbiol. Biotechnol. 61, Shi, Y., X. Xu & Y. Zhu Optimization of Verticillium lecanii spore production in solid-state fermentation on sugarcane bagasse. Appl. Microbiol. Biotechnol. 82(5), Sugimoto, M., M. Koike, N. Hiyama & H. Nagao Genetic, morphological, and virulence characterization of the entomopathogenic fungus Verticillium lecanii. J. Invertebr. Pathol. 82, Wraight, S.P., M. E. Ramos, P.B. Avery, S.T. Jaronski & J.D. Vandenberg Comparative virulence of Beauveria bassiana isolates against lepidopteran pests of vegetable crops. J Invertebr. Pathol. 103, Wraight, S.P., R.I. Carruthers, S.T. Jaronski, C.A. Bradley, C.J. Garza & S. Galaini-Wraight Evaluation of the entomopathogenic fungi Beauveria bassiana and Paecilomyces fumosoroseus for Microbial Control of the Silverleaf Whitefly, Bemisia argentifolii. Biological Control 17, Recibido: 21 de julio de 2011 Aceptado 27 de noviembre de