MICROSCOPIOS MICROSCOPIOS MICROSCOPIOS MICROSCOPIOS

Transcripción

1 MICROSCOPIOS MICROSCOPIOS MICROSCOPIOS MICROSCOPIOS Griego: Mikros: pequeño Skopein: mirar

2 Zacharias Jansen Holanda ( ) 3 y 9 aumentos Jan Swammerdam observó insectos y sangre con corpúsculos que le dan ese color. Nehemiah Grew estudió los órganos de reproducción de las plantas y descubrió los granos de polen. Reigner de Graaf describió en el ovario los folículos. Marcello Malpighi sus primeros estudios los realizó con pulmones de rana, descubrió que las arterias y las venas se hallaban unidos mediante los capilares.

3 Robert Hooke (1665) Observó el corcho constituido por pequeñas celdillas con aire, que llamó células

4 Microscopio Simple Antony van Leeuwenhoek ( ) Logró aumentos de 270 X sin perjuicio de la nitidez

5 Otto Muller (1773) Describió los bacilos y espirilos

6 Joseph Jackson Lister (1820) Microscopio acromático Aberración cromática Lente acromático La distancia focal es distinta para los diferentes colores

7 RESOLUCIÓN Es la propiedad de un sistema óptico de hacer visibles como independientes dos puntos muy cercanos entre sí LR= 1/PR Ojo humano = 0,1 mm Microscopio óptico = 0,2 mm Microscopio electrónico = 0,2 nm micrómetro (µm): 10-6 metros nanómetro (nm): 10-9 metros angstrom (Å): metros LR = 0,61. l AN

8 RESOLUCIÓN Índice de refracción LR = 0,61. l N. AN Cos a

9 RESOLUCIÓN LR = 0,61. l AN Las partículas también se comportan como ondas (De Broglie 1926) Microscopio electrónico l electrón = 0,005 nm LR = 0,2-0,5nm LR = 0,17 µm Magnificación : Objetivo X Ocular

10 Objetivo 10X AN 0.15 Ocular 20 X l = 550 nm Magnificación: 200 X Resolución: L= 2.2 μ Objetivo 40X AN 0.65 Ocular 5 X Magnificación: 200 X Resolución: L= 0.5 μ

11 Aberraciones Geométricas esférica astigmatismo en coma curvatura de campo Alteración de la forma Cromáticas Distorsiones en los colores. Tipos de objetivos Plan: Corrige aberraciones geométricas. Combinable con otras lentes Achromat: Corrige aberración esférica y cromática para rojo y azul. Fluorite (semi-apochromats): Corrige aberración esférica y cromática para rojo y azul. Permite mayores aperturas numéricas y resultando en imágenes más luminosas. Apochromatic: Eliminan las aberraciones cromáticas en los tres colores (RGB), y corrigen las esféricas. Tienen aperturas numéricas superiores a los anteriores. Es la mejor elección para foto micrografía.

12 PLAN = objetivo planacromático; NEOFLUAR = objetivo con apertura numérica incrementada; PLANAPO = objetivo planapocromático; ULTRAFLUAR = objetivo especial para fluorescencia; POL = objetivo exento de tensiones, especial para microscopía de polarización; Ph 2 = objetivo de contraste de fases con anillo del númerol 2; m.j = objetivo con diafragma iris, apropiado para campo oscuro.

13 PENSEMOS Tengo 2 microscopios iluminados con luz blanca (550 nm de promedio) El microscopio A tiene un ocular de 5X y un objetivo de 60X con una amplitud numérica de El B tiene un ocular de 10X y un objetivo de 30X con una amplitud numérica de Que magnificación logro con cada uno de ellos? A= B= Con cual obtengo mejor resolución?

14 MICROSCOPIOS Campo Oscuro Luz visible Contraste de Fase Interferencia Luz polarizada Luz ultravioleta Campo Ultravioleta Fluorescencia Confocal Multifotón Electrónicos Transmisión (TEM) Barrido (SEM) sonda de Barrido (SPM) Efecto túnel (STM) Fuerza atómica (AFM) Contacto No contacto intermitente

15 Campo Oscuro Bloquea los rayos centrales de luz dejando pasar los oblicuos. Luz reflejada y difractada por la muestra.

16 VENTAJAS *Permite ver partículas dispersas en un medio homogéneo. * Hace posible la observación del movimiento Browniano de las partículas. * Se puede utilizar para la observación de preparaciones sin colorear. * Visualiza los bordes destacados de las muestras. * Técnica valiosa para observar microorganismos de tipo Treponema pallidum, espiroquetas con diámetros superior a 0.2 um DESVENTAJAS * Inadecuada preparación de la muestra. * Difícil acceso al microscopio que posea el condensador especial por su alto costo. * No deja visualizar estructuras celulares especificas, solo bordes de células partículas.

17 Contraste de Fases microscopio basado en cálculos matemáticos Uso: células vivas, tejidos vivos, cortes no coloreados = espesores = índice refracción = Fase La fase de un haz de luz es inobservable Luz difractada Fritz Zernike 1934 Premio Nobel de Física 1953

18 Ventajas Permiten observar las células en acción y estudiar los movimientos implicados en procesos como la mitosis o la migración celular. Se usa para medir índice de refracción y concentración de sólidos de las estructuras celulares. Es útil para determinar masa seca y espesor de las estructuras celulares. Fondo claro Contraste de Fase Células en cultivo Células en cultivo Tiene la desventaja de producir halos y es difícil obtener una alta resolución. Las muestras deben ser muy delgadas y no deben abarcar todo el campo de observación. La fuente luminosa debe ser muy intensa

19 (7) Imagen intermedia De luz polarizada Birrefringencia aparece un rayo regular rápido que vibra en una dirección y otro paralelo llamado irregular con velocidad de propagación más lenta y que vibra ortogonalmente con respecto al primero (6)Lente (5) Analizador rotado 90º en relación a (1) materiales isótropos índice de refracción constante materiales anisótropos distintos índices de refracción (4) Objetivo (3) Espécimen iluminado con luz polarizada lineal. (2) Condensador (1) Filtro polarizador Es útil para examinar estructuras birrefringentes (fibras musculares, fibras proteicas del tejido conectivo, gotas lipídicas y fotorreceptores retinianos).

20 Interferencia Produce imágenes claras y sin halos, con aspecto tridimensional y permite observar estructuras incoloras como si fuesen coloreadas Es costoso e incomodo.

21 Microscopio invertido Las muestras se pueden colocar en diferentes recipientes con espesores y características ópticas variables. Permite observar organismos o tejidos en cultivo sin una preparación previa disminuyendo las condiciones de estrés. Cámara de video: actividades dinámicas de las células

22 Microscopio invertido Alga Cultivo celular Fondo claro Contraste de fase Desventajas: costo y limitada magnificación

23 Microscopio con procesador de imágenes

24 PENSEMOS Con el microscopio de contraste de fase, los científicos pueden estudiar: A: división celular B: anticuerpos C: moléculas de ADN Para observar pequeñas partículas en movimiento, qué microscopio utilizaría? A: de luz polarizada B: de campo oscuro C: de interferencia Si usted tiene que construir su propio microscopio de polarización, en que orden colocaría los filtros polarizantes? A: Fuente de luz Condensador Filtro(A) Espécimen- Filtro (B) -Objetivo B:Fuente de luz Filtro(A) Condensador Espécimen- Filtro (B) -Objetivo C: Fuente de luz Filtro(A) Condensador - Espécimen Objetivo- Filtro(B)

25 Fluorescencia Fluorescencia primaria (autofluorescencia) Fluorescencia secundaria (fluorocromo) Isotiacianato de fluoresceína (FITC) nm Tetrametil Rodamina nm Naranja de Acridina nm Diaminofenilindol (DAPI) nm Ioduro de propidio nm

26 Fluorescencia

27 Fluorescencia Fibroblastos cultivados:golgi: amarillo (anti-galactosiltransferasa) Microtúbulos: verde (anti-tubulina) Células de cerebro en cultivo Neuronas: neurofilamentos (amarillo) Astrocitos: PFAG (rojo)

28 Microscopio confocal Escaneo de láser (LSCM) TIPOS Escaneo de platina (SSCM) Escaneo de disco (DSCM)

29 Citoqueratina Desmoplaquina Fibroblasto Actina: rojo Vimentina: verde

30 Microscopio confocal Cortes ópticos a distinta profundidad Reconstrucción tridimensional

31 VENTAJAS Imágenes siempre en foco Secciones ópticas Imágenes 3D Muestras vivas Colocalización molecular DESVENTAJAS Intensidades de excitación superiores ( láser). Mayor tiempo de exposición. Anticuerpos menos diluidos. Tubulina verde Actina roja

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33 PENSEMOS La luz emitida por material fluorescente tiene menor energía que la luz radiante. Cuál es la característica de la luz de baja energía? A: Tiene una longitud de onda mas corta B: La longitud de onda es indistinta C: Tiene una longitud de onda mas larga Cuando se excita material fluorescente con la correspondiente longitud de onda, Los átomos de este material absorben la energía. Los electrones de los átomos Pasan a un nuevo nivel energético. Que pasa cuando los electrones regresan al Estado original? A: Emiten partículas alfa B: Emiten partículas beta C: Emiten fotones

34 Microscopio electrónico 1924 D`Broglie carácter ondulatorio de los electrones 1926 Busch presenta el diseño de una lente electromagnética Lente electromagnética Ernst Ruska y Max Knoll 1933: Diseño y construcción del primer ME. 1986: Premio Nobel de Física

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36 Fuente de alto voltaje Columna vacío Cátodo Ánodo Lente condensadora Objeto Imagen intermedia Lente objetivo Lente proyectora Imagen final Pantalla fluorescente

37 Microscopio Electrónico de Transmisión (MET) Permite el estudio de la ultraestructura de materiales orgánicos o inorgánicos. APLICACIÓN Determinación de estructura cristalina y tamaño de partícula en minerales, metales, etc. Identificación de bordes de grano e interfaces en metales. Estudio de fases y zonas cristalinas en polímeros. Cambios estructurales de materiales sometidos a diferentes tratamientos térmicos. Realización de estudios de histoquímica para identificar compuestos específicos. Estudios de ultraestructura de tejidos vegetales y animales. Reconocimiento de virus. Estudios de citoquímica. Estudios de estructuras moleculares Platino

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41 3 mm Portaespecimen

42 1965: primer microscopio electrónico de barrido comercial.

43 MICROSCOPIO ELECTRONICO DE BARRIDO - SEM Los convierte en una señal electrónica que es proyectada en un tubo de rayos catódicos (CRT)

44 Microscopio electrónico de barrido

45 APLICACIONES DE MEB (SEM) Sus análisis proporcionan datos como textura, tamaño y forma de la muestra. Estudio de materiales Caracterización micro estructural de materiales. Composición de superficies y tamaño de grano. Valoración del deterioro de materiales, fatiga, corrosión, fragilización etc. Estudio químico y estructural de obras de arte, alteración de monumentos, identificación de pigmentos (restauración, autentificación) Otros campos: Geología Odontología Paleontología y Arqueología: Peritajes Medicina Forense Botánica, Biomedicina y Medicina Electrónica

46 OPTICO TEM SEM Long. de onda) Aumentos Lím.resolución Espesor muestra nm X 0,2um 5-7um 0,005 nm X 0,2-0,5nm 50-70nm 0,005nm X 10 nm 1 cm

47 La microscopia SPM (microscopia de proximidad) sonda de barrido Una sonda puntiaguda barre la superficie de una muestra, monitorizándose la interacciones que ocurren entre la punta y la muestra. - Una punta. - Un sistema de nanodesplazamiento. - Una muestra. - Un dispositivo de acercamiento punta/muestra. - Una electrónica y/o informática de control. Las características generales : - Desplazamientos de hasta 150 μm en el plano, y μm en altura. - Resolución de hasta 0.01 Å, resolución teórica de las cerámicas piezoeléctricas. - Permiten trabajar en medios muy variables: al aire, en atmósfera controlada, en vacío y ultra-alto vacío, altas/bajas temperaturas, líquidos

48 MICROSCOPIO DE FUERZA ATÓMICA (AFM) De contacto La fuerza origina la flexión del brazo adaptándose a la superficie de la muestra. Un láser incide sobre el dorso del brazo y se refleja sobre un fotodetector obteniendo una imagen gráfica de la superficie De no contacto Se excita cerca de su frecuencia de resonancia de modo que vibre cerca de la superficie de la muestra.a frecuencias de 100 a 400 khz y conforme se acerca la punta a la superficie se detectan cambios en la frecuencia de resonancia La sensibilidad de la técnica proviene de la frecuencia de resonancia del cantilever. De contacto intermitente La punta está en intermitente contacto con la superficie a la vez que la barre.la variación de la amplitud de oscilación de la punta, debida a la amortiguación sobre la superficie es lo que se utiliza como señal de control. Evita las fuerzas de laterales y de fricción que ocurren en la AFM.

49 De contacto -Ventajas: amplia gama de muestras a analizar; (medidas in situ en una celda líquida o en la celda electroquímica) Alta resolución - Desventajas: la punta está en contacto con la superficie; problemas de destrucción de la punta o modificación de la superficie, arrastre de partículas. De no contacto Ventajas: no existe modificación ni contaminación de la muestra; se pueden medir diferentes gradientes de fuerza (magnética, electrostática, etc.). Desventajas: resoluciones altas requieren que la punta se sitúe muy cerca de la superficie De contacto intermitente Ventajas: medida muy estable; fuerza de presión muy débil; resolución elevada Desventajas: no puede trabajar en medio líquido; no se llega a resolución atómica; barridos más lentos.

50 MICROSCOPIO DE EFECTO TUNEL (STM) Heinrich Rohrer y Gerd Binnig (1981) Premio Nobel de Física 1986 (junto con Ruska) No utiliza luz, ni haz de electrones, ni ópticas (Scanning Tunneling Microscope ) Fuente: Nube de electrones de la superficie de la muestra Sonda: punta que se desplaza de manera constante sobre sup De W (pulidas electroquímicamente), Pd, Pt-Ir. Ventaja : resolución a escala atómica. Para conseguir este tipo de resolución se ha de trabajar sobre muy buenos conductores (Pt, Au, Cu, Ag). Limitaciónes: imposibilidad de trabajar con muestras aislantes. Trabajar in-situ, al vacío o a baja temperatura. punta de wolframio Es un instrumento fundamental en el campo de la nanotecnología y la nanociencia.

51 Microscopio de efecto túnel Microscopio de Efecto Túnel Microscopio de Fuerza Atómica Cromosomas Fibras colágenas ADN

52 Toda interacción que se pueda medir entre la punta y la muestra puede dar lugar a una forma de microscopia SPM. Otros tipos de microscopia SPM son: Lateral Force Microscopy (LFM), Force Modulation Microscopy, Magnetic Force Microscopy (MFM), Electric Force Microscopy (EFM), Surface Potential Force Microscopy, Phase Imaging, Force Volume, Electrochemical STM & AFM (ECM), Scanning Thermal Microscopy (SThM), etc

53 PENSEMOS Con qué microscopio se obtuvieron las siguientes fotografías? A B C D E F 1- Confocal 2- Luz polarizada 3- Interferencia 4-TEM 5-SEM 6- Fluorescencia

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