TEMA 6.I: MUTACIÓN SELECCIÓN

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1 TEMA 6.I: MUTACIÓN SELECCIÓN DESARROLLO DE CEPAS Los MOTIVOS del desarrollo de cepas: 1. Incrementar la produccion. Alterando la regulacion; alterando la permeabilidad o creando sistemas que expulsen el producto; incrementar la resistencia a su propio AB o a un metabolito intermediario (ya que a veces no resisten laa presion del AB). 2. Propiedades fermentativas mejoradas. Sin pigmentos, que tengan pocas necesidades de oxigeno,que no produzcan espuma, que sea capaz de crecer en sustratos baratos. 3. Productos finales unicos. En metabolitos secundarios. 4. Biosintesis de nuevos productos. Usar la ingenieria genetica para obtener AB y metabolitos que nunca habian sintetizado esos MO (como puede ser la insulina humana sintetizada por e.coli - MÉTODOS Mutación-selección Recombinación Ingeniería genetica: Tecnología del ADN recombinante "in vitro" 1.- Bases moleculares de la mutación Mutación: es un cambio heredable en la secuencia de bases de los ácidos nucleícos contenidos en el genoma de un organismo. Mutaciones espontáneas: Radiaciones naturales Errores durante la Replicación ( ) Mutaciones inducidas por mutágenos: Metabolitos Secundarios ( ) Mutantes Auxotrofos ( ) Recombinación Genética: es el proceso por el cual los elementos genéticos contenidos en dos genomas separados se juntan en uno sólo (genes, conjunto de genes, cromosomas). Frecuencia de Mutación: proporción de mutantes en la población Mecanismos mutacionales 1.-Cambios premutacionales Emparejamiento incorrecto Dímeros de pirimidina Alteración química de bases Alquilación, desaminación Entrecruzamiento entre cadenas complementarias Intercalamiento de mutágenos Ruptura de una cadena Ruptura de las dos cadenas Inserción (transposones)

2 2.-Procesos de reparación Fotorreactivación Reparación por escisión: daño ultravioleta, Daños alquilantes y deaminados Reparación postreplicativa por recombinación Reparación SOS: El mecanismos SOS es un mecanismo de emergencia, es inducido a diferencia de los otros, cuando se encuentran con daños genéticos, repara para que la célula sea viable aunque comete muchos errores ya que a veces repara sobre vacio, y entonces los errores pasan como material genético estable a la siguiente generación, como mutación 3.-Mutación Fracaso parcial del mecanismo de reparación Mutantes 2.- Mutágenos I. Mutágenos químicos a. Análogos de bases (5-bromouracilo que se empareja de forma incorrecta) b. Agentes que reaccionan con el DNA (producen alquilaciones, hidroxilaciones, aminaciones... y alteran las bases y producen errores.) c. Agentes Intercalantes (el mas conocido es el bromuro de etidio, colorante que se intercala entre ambas cadenas de DNA estabilizandola, cuando este se tiene que copiar, en la zona donde esta se crea un hueco) II. Mutágenos físicos a. Luz Ultravioleta b. Radiación Ionizante con mas energia q la luz uv, ya q ionizan los componentes y les hace reactivos (entrecruzamiento de cadenas, ruptura fisica...) ej: rayos X. III. Mutágenos biológicos a. Elementos transponibles, un transposon (trozo de DNA que se copia y salta a otra zona del genoma,ademas son faciles de marcar) b. Mutagénesis dirigida Rango (saber que produccion obtenemos), en la natural no perdemos nunca la prouccion de clortetraciclina; con el resto si; los radiacion UV y los NTG son los que mas producen Clase mas frecuente (nos interesa que la moda sean mutantes superproductores). Los mas de radiaciones utravioleta Frecuencia de cepas con mayor productiivdad, en la natural es bajo, con la uv es muy alta y la mejor. NTG: agente alquilante mas potente (junto con UV da los mejores resultados) Mostazas nitrogenadas MUTACION SELECCION: los pasos de mejor donde sale que tipo de mutageno se uso para Penicillum notatum. En la ultima etapa se uso sistematicamente la mostaza. se paso de 3 a 7000 mg

3 3.- Técnicas desarrollo de cepas por mutación-selección 1.-Técnica de selección frente a análogos o antimetabolitos 2.-Técnica de selección de revertientes 3.-Técnica de selección de auxotrofos 4.-Técnica de selección por mutagénesis secuencial 5.-Técnica de selección por comutación 6.-Mutasíntesis (biosíntesis mutacional) 7.- Cosíntesis 1.- Técnica de selección frente a análogos. Un análogo estructural es una sustancia química con una estructura similar que mimética perfectamente a un producto intermediario pero no es esa estructura. Un análogo estructura en una ruta de producción de aminoácidos es un D-aminoácido, funcionan como reguladores, pero no sirven estructuralmente porque no se puede incorporar a la proteína, por lo que sólo cumple su función reguladora. 2.- Técnica de selección de revertientes. Técnica muy utilizada para la producción de antibióticos. Partiendo de la cepa parental (C1) que produe antibiotico la muto, elegimos el que no produce AB, a este le vuelvo a mutar y seleccionamos los que si producen AB, con una frecuencia muy alta estos suelen ser mucho mas productores que el primero. Un revertiente verdadero es aquel en la que se produce una mutación en el mismo punto pero de sentido contrario, es decir, que revierte a la original. Con el segundo agente mutageno se va a provocar una mutación puntual que revierta la primera mutación, pero esto es muy improbable. Lo habitual es que se tenga una segunda mutación en otro gen que da lugar a una nueva conformación de la proteína que altera su función compensando la primera mutación. Es decir, se recupera la función de la proteína y se compensa la mutación que alteraba el proceso. Esto afecta al centro alostérico de la proteína, esto es lo que hace que estos dobles mutantes hagan que se gane en cuanto a la producción de antibiótico.

4 3.- Auxótrofos Objetivo: lisina - Pasos a seguir: coger un medio de cultivo líquido y crecer MO para ponerlos en contacto con el agente mutágeno y se esperan dos generaciones para que se generen los mutantes. Se coge una alícuota de esta población y la pongo en un medio de cultivo que reúna una serie de características especiales (medio mínimo (MM) al que le pongo todos los factores de crecimiento que necesita una célula para crecer menos lisina). Para enriquecer este cultivo en este tipo de mutantes tengo que poner un antibiótico que actúe sólo sobre los MO que están creciendo, por ejemplo, la penicilina que actúa sobre la pared celular y así acabo con todos los que están creciendo, excepto con los auxótrofos de lisina, que no están creciendo porque no hay lisina. Posteriormente recupero los MO que quedaron y elimino los que no me interesan y pongo en un medio que sólo contenga lisina. 4.- Técnicas «dirigidas». Dirigir nuestras mutaciones a los genes que nos interesan. Se busca obtener un cultivo en el que todas las células estén en el mismo momento del ciclo -> cultivo sincrónico. Auxotrofos NTG: Muy eficiente. Es un agente alquilante. Tiene una predilección y se une mucho más fuerte. Muta ADN de cadena sencilla para dar de cadena doble. Con estas dos premisas, se diseñan las técnicas dirigidas. Que consisten en el mapeo de genes, se conocen los tiempo de replicación de la bacteria y que genes se van replicando en cada tiempo y se van añadiendo los agentes mutágenos necesarios para cada gen. Necesito saber muy bien, la posición de los genes en el cromosoma y la ruta de biosíntesis. 5.- Técnica de selección por comutación. La replicación es bidireccional simétrica, por lo que si no consigo detectar los genes que me interesan, detecto más fácilmente los simétricos de la horquilla de replicación, así es más sencillo encontrar los que necesito en cuanto al tiempo de replicación. 6.- Mutasíntesis La penicilina esta diseñada para eliminar de la célula tres aminoácidos que pueden ser tóxicos cuando se acumulan. La penicilina se forma por condensación, un tripéptido. Productos del metabolismo primario se acumulan y hay que eliminarlos para que no intoxiquen. Y para ello se utilizan las rutas del metabolismo secundario que tiene como función unirlos y algunos de ellos tienen función de antibiótico. Si yo bloqueo un metabolito primario, la célula no produce el antibiótico, la célula ha mutado porque le falta un elemento. Esto se comprueba mediante el medio de cultivo, si añades este nutriente se vuelve a conseguir el producto final. Pero en el medio de cultivo no se va a poner el mismo metabolito, sino un análogo estructural que va a hacer que el antibiótico obtenido tenga características mejores.

5 7.- Cosíntesis Cuando no se puede desregular una ruta metabólica, tenemos que aplicar esta técnica. Se obtienen dos mutantes cada uno con la ruta truncada y la suma de ambos nos da una ruta completa. En el primer mutante se bloquea la enzima quedándose sin producto final y así se acumula el producto intermediario C. El segundo mutante se bloquea justo en el paso anterior (B --> C), por ello su ruta se inicia en el producto almacenado por el mutante 1. Si cultivo ambos el segundo utiliza el metabolito que está en el medio producido por el primero para acabar produciendo el último que se acumula, sin alterar el sistema de regulación de la ruta en ambos mutantes.

6 Tema 6. II Mejora de cepas por recombinación 1. Objetivos 2. Recombinación genética en bacterias I. Transformación II. Transducción III. Conjugación 3. Recombinacion genética en hongos 4. Fusión de protoplastos. I. Recombinación sexual II. Recombinación parasexual 1. Objetivos Reunir en una cepa las mejoras obtenidas en varias por distintos métodos. Eliminar mutaciones indeseables que tienen efectos pleiotrópicos negativos para el rendimiento (vitalidad disminuida) Eliminar en las cepas de alta producción cambios fisiológicos indeseados: producción de espuma. Necesidades nutricionales. 2. Recombinación genética: Es el proceso por el cual los elementos genéticos contenidos en dos genomas separados se juntan en uno solo. Es una forma efectiva de aumentar la variabilidad genética. Métodos naturales y artificiales. - Objetivo: Reunir en una cepa las mejoras obtenidas en varias por distintos métodos Eliminar mutaciones indeseables que tienen efectos pleiotrópicos negativos para el rendimiento (vitalidad disminuida) Eliminar en las cepas de alta producción cambios fisiológicos indeseados: Producción de espuma Necesidades nutricionales METODOS NATURALES» Recombinación genética en hongos - Recombinación sexual:

7 - Recombinación parasexual: tenemos dos individuos en crecimiento que son haploides. Si se ponen juntos en una placa las hifas de los hongos se entrecruzan y se unen produciendose anastomosis, se unen los citoplasmas de las dos líneas parentales haploides y se generan unas células curiosas en las que coexisten los núcleos de los dos hongos. Célula con varios núcleos de diferente procedencia y ambos haploides: heterocarionte. De una célula de este tipo van a salir esporas de un parental y otras del otro parental y ambas haploides. Pero con cierta frecuencia se produce cariogamia, es decir, dos núcleos haploides se unen para dar lugar a un núcleo diploide estable, y como consecuencia se produce un entre cruzamiento de los cromosomas y dará lugar luego a hifas diploides que podrán generar mediante reducción meiótica hifas haploides que están recombinadas.» Recombinación genética en bacterias. Tenemos tres sistemas en la que una parte del genoma de una célula donadora puede pasar dentro de una célula receptora y una vez dentro recombina. Hay diferencias en cuanto a la transferencia del ADN. La recombinación siempre es homóloga. Nunca en procariotas se puede transferir el material genético completo de una célula a otra. En eucariotas puedo coger el genoma completo de una célula y unirlo al de otra. Inconvenientes recombinación natural: 1-Frecuencia baja 2-No son corrientes en microorganismos industriales. MÉTODOS ARTIFICIALES: Fusión de protoplastos Método Eliminación de paredes celulares. Fusión: PEG, electrofusión Regeneración de la pared. Diseñar medio y condiciones. Mediante un detergente o un agente tensioactivo se elimina la pared, membrana o quitina. Tengo dos células desnudas y mediante PEG las uno, y pueden ocurrir dos cosas, que se generen dos células con dos núcleos distintos, o que en el caso de los eucariotas se produzca cariogamia o en los procariotas recombinación.

8 Ventajas: La frecuencia de recombinación se incrementa de una forma espectacular. Aplicable a eucariotas y procariotas Recombinación intraespecífica, interespecífica En procariotas: contacto entre genomas completos Recombinación natural vs fusión de protoplastos - Frecuencia de recombinación baja - No son corrientes en MO industriales.