El salto de la doble hélice. Consecuencias del Proyecto Genoma Humano en la medicina del siglo XXI (Primera Parte)

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1 Rev. Arg. Anest (2004), 62, 5: El salto de la doble hélice. Consecuencias Artículo de revisión El salto de la doble hélice. Consecuencias del Proyecto Genoma Humano en la medicina del siglo XXI (Primera Parte) Dr. *Barbieri Pedro Dra. **Moya Graciela...en un sentido estricto, la evolución de la vida, tal como la conocemos, es la evolución de las estructuras macromoleculares... 1 Comentario del editor: Este artículo consta de tres partes que serán publicados en números sucesivos. En el de hoy iniciamos la Introducción al tema mediante un diccionario de los términos más usuales que serán usados en el texto. Comentario de los autores: en el texto se encuentran palabras resaltadas entre paréntesis (), lo que indica que es una abreviatura o resume una frase; otras están entre corchetes [], cuyo significado se desarrolla en el diccionario; finalmente hay términos entre llaves {}, que son referencias en lengua inglesa más común de palabras que aparecen en el texto. Diccionario Acido desoxirribonucleico (ADN) {DNA}: polímero lineal compuesto por cuatro tipos de nucleótidos de desoxirribosa (adenina (A), citosina (C), guanina (G), timina (T)), que contiene la información genética. En su estado nativo, el ADN es una doble hélice compuesta por dos hebras antiparalelas unidas por enlaces de hidrógeno entre bases púricas y pirimídicas complementarias. Acido nucleico: polímero de nucleótidos unidos mediante enlaces fosfodiester (ej: ADN, ARN). Acido ribonucleico (ARN) {RNA}: cadena simple de ácidos nucleicos que contiene las bases adenina (A), citosina (C), guanina (G) y uracilo (U), y tiene un importante rol en la síntesis de proteínas y otras actividades químicas de la célula. Existen diversas clases de ARN (ARN mensajero, ARN de transferencia, ARN ribosomal y otros pequeños ARNs) ADN complementario (ADNc) {cdna}: molécula de ADN copiada de una molécula de ARNm mediante la transcriptasa inversa, por lo que carece de los intrones presentes en el ADN genómico. La determinación de la secuencia de bases de un ADNc permite deducir la secuencia de aminoácidos de la proteína codificada. La expresión de ADNc en células recombinantes se puede utilizar para producir grandes cantidades de proteínas codificadas in vitro. ADN doble cadena (ADNdc) {dsdna}: estructura tridimensional más común del ADN celular, en la que las dos hebras de polinucleótidos son antiparalalelas y se enrollan una alrededor de la otra, con uniones puente de hidrógeno entre las bases complementarias. ADN genómico: secuencia de nucleótidos que compone el material genético de una célula u organismo. Incluye al ADN cromosómico y al ADN mitocondrial. ADN polimerasa (ADNpol) {DNApol}: enzima que copia una hebra de ADN (plantilla o patrón) para formar la hebra complementaria, que compone una nueva molécula bicatenaria de ADN. Todas las ADN polimerasas agregan desoxirribonucleótidos de a uno por vez, en dirección 5 3, a un corto cebador {primer} ya existente de ADN o ARN. ADN de secuencia simple: cortas secuencias (menos de 20 nucleótidos) altamente repetidas en tandem que se encuentran en los centrómeros y telómeros, también en otras ubicaciones cromosómicas, y no son transcriptas. Alelo: una de dos o más formas alternativas de una secuencia localizada en un sitio (locus) sobre cromosomas homólogos. Alelo nulo {Null allele}: variante alélica no funcionante. Alelo wild type : variante de secuencia que es tomada como la presentación standard u original. Ambiente: factores externos al cuerpo humano. Para los genetistas, el ambiente es todo lo que no es genotipo. Algunos aspectos del ambiente que influyen sobre la salud y la enfermedad: -dieta, -aire, -agua, -radiación,- infección. Aminoácido: compuesto orgánico que contiene en su grupo funcional un grupo amino y uno carboxilo. Componentes de las proteínas. Anticodón: secuencia de tres nucleótidos en un ARNt, complementaria de un codón en un ARNm. Durante la sín- *Servicio de Anestesiología. Hospital Británico de Buenos Aires, pedrobarbieri@arnet.com.ar ** Instituto Genos. Buenos Aires, gracielamoya@tutopia.com.ar Revista Argentina de Anestesiología

2 Artículo de revisión tesis proteica, el apareamiento de las bases del codón y el anticodón alinean el ARNt portador del correspondiente aminoácido para agregarlo a la cadena peptídica en crecimiento. Adenosin trifosfato (ATP)«molécula con capacidad de captación y entrega de energía celular. Biblioteca de ADN: fragmentos de ADN genómico clonado que en su conjunto componen la totalidad del genoma (biblioteca genómica) o ADNc de todos los ARNm producidos por un tipo celular (biblioteca de ADNc). Biología molecular: rama de la biología que estudia las moléculas participantes en los constituyentes celulares (citoplasma y organelas citoplasmáticas, núcleo y componentes nucleares). En especial busca las bases moleculares de los procesos genéticos. Caja TATA {TATA BOX}: secuencia conservada en el promotor de genes eucariontes, donde se ensambla el complejo de iniciación de la transcripción. Cariotipo: visualización del número, tamaño y forma de todo el conjunto de cromosomas en metafase de una célula eucarionte (Figura 1). Cebador {primer}: corta secuencia de ácido nucleico que contiene un grupo hidroxilo 3, que hibrida con una hebra patrón complementaria y actúa como punto de inicio para la adición de nucleótidos, con la finalidad de copiar la hebra patrón. Centrómero: parte adelgazada de un cromosoma durante la mitosis, donde se adosan las cromátides hermanas y de la que se extienden las fibras del cinetocoro hacia un polo del huso; es necesario para la migración correcta de los cromosomas durante la mitosis y la meiosis (Figura 2). Cistrón: unidad genética que codifica un único polipéptido. Código genético: correspondencia entre tripletes en ADN (o ARN) y aminoácidos en proteínas. Incluye a 64 tripletes, de los cuales 61 tripletes tienen sentido al codificar para alguno de los 20 aminoácidos conocidos. Tres tripletes no codifican para aminoácidos (UAA, UAG y UGA) y se conocen como tripletes o codones de terminación. Codón: secuencia de tres nucleótidos en el ADN o el ARNm que codifica para un aminoácido particular durante la síntesis de proteínas; también se denomina triplete. De los 64 codones posibles, tres son de detención, es decir que no codifican para ningún aminoácido y determinan la finalización de la síntesis proteica. Control genético: todos los mecanismos que intervienen en la regulación de la expresión génica. El más común es la regulación de la transcripción, si bien los mecanismos que influyen sobre el procesamiento, la estabilización y la traducción de ARNm contribuyen también a controlar la expresión de algunos genes. Cromatina: complejo de ADN, histonas y proteínas no histonas a partir de las cuales se forman los cromosomas eucariontes. La condensación de la cromatina durante la mitosis produce los cromosomas visibles en la metafase. Cromatografía líquida: técnica para separar mezclas de proteínas, ácidos nucleicos y otras moléculas celulares. Se basa en el principio de que las moléculas disueltas en una solución interactúan (se unen y disocian) con una superficie sólida. Si se permite que la solución fluya a través de la superficie, las moléculas que interactúan con frecuencia con la superficie permanecerán más tiempo ligadas a ella, por lo que se desplazarán a menor velocidad que las que interactúen poco con la superficie. La cromatografía líquida se lleva a cabo en una columna en la que hay perlas esféricas en un empaquetamiento denso. La naturaleza de estas perlas determina si la separación de las proteínas depende de diferencias de masa, carga o afinidad de unión. Las tres técnicas comunes de cromatografía líquida son por filtración en gel; -por intercambio iónico; -por afinidad con anticuerpo. Cromosoma: en eucariontes, la unidad estructural del material genético, que consiste en una única molécula de ADN lineal bicatenaria y las proteínas asociadas. Durante la mitosis, los cromosomas se condensan en unidades compactas visibles a la microscopía óptica (Figura 1). Deleción: pérdida de una porción del ADN. La deleción de un gen o parte de un gen puede producir enfermedades o anomalías (Figura 11). Desequilibrio de enlace o ligamiento {linkage disequilibrium}: asociación de genes y/o marcadores que se presentan cerca uno del otro en un cromosoma. Cuando hay desequilibrio de ligamiento, los genes y/o marcadores asociados tienden a heredarse en forma conjunta. Desnaturalización: alteración drástica de la conformación de una proteína o un ácido nucleico, debida a la ruptura de diversos enlaces no covalentes, como consecuencia de calentamiento o exposición a agentes químicos determinados; por lo general se pierde la función biológica. Diploide: organismo o célula con dos conjuntos completos de cromosomas homólogos y las consecuentes dos copias (alelos) de cada gen o sitio genético. Las células somáticas contienen el número diploide de cromosomas (2n) característico de la especie. Dominante: alelo de un gen que se expresa en el fenotipo de un heterocigota; el alelo cuya expresión es enmascarada por el dominante en un heterocigota se denomina recesivo. Elemento móvil de ADN: Cualquier secuencia de ADN que no se encuentra en la misma ubicación cromosómica en todos los individuos de una especie. Elemento promotor proximal: cualquier secuencia reguladora del ADN eucarionte localizada dentro de los 200 pares de bases río arriba {upstream} del sitio de iniciación de la transcripción. La transcripción de muchos genes es controlada por múltiples elementos promotores proximales. Empalmosoma {spliceosoma}: gran complejo de ribonucleoproteínas que se ensambla sobre un pre ARNm y lleva a cabo la eliminación de intrones y el consecuente empalme de exones que da origen al ARNm maduro. 330 Volumen 62/ Número 5

3 El salto de la doble hélice. Consecuencias Enlace covalente: fuerza química estable que mantiene unidos los átomos moleculares, dado que comparten uno o más pares de electrones. Enlace no covalente: unión química débil en la que no se comparten electrones. A menudo los enlaces no covalentes múltiples estabilizan la conformación de macromoléculas y median interacciones muy específicas entre moléculas. Ensamblaje de ARN {splicing}: proceso por el cual se logra quitar los intrones y se unen los exones del ARNm. Enzimas de Restricción (endonucleasas): enzimas que reconocen y escinden una secuencia corta específica, el sitio de restricción, en las moléculas de ADN bicatenario. Se utilizan ampliamente en la tecnología de ADN recombinante. Estructura primaria: en las proteínas, la disposición lineal (secuencia) de aminoácidos y la ubicación de los enlaces covalentes (en su mayoría uniones disulfuro) dentro de una cadena polipeptídica. Estructura secundaria: en las proteínas, el plegamiento local de una cadena polipeptídica para formar estructuras regulares, por ejemplo, la hélice alfa, la lámina beta, y los giros y asas en forma de U. Estructura terciaria: en proteínas, forma tridimensional global de una cadena polipeptídica que se estabiliza mediante múltiples interacciones no covalentes entre las cadenas laterales. Eucariontes: clase de organismos, compuestos por una o más células, que contienen un núcleo y organelas rodeados por membrana. Constituye uno de los tres linajes evolutivos diferenciados de los organismos actuales. Eucromatina: porciones menos condensadas de cromatina transcripcionalmente activas, que se encuentran en los cromosomas en interfase. Exón: segmentos de un gen eucarionte que llega al citoplasma como parte de una molécula de ARNm, ARNt, o ARNr. Generalmente corresponden a la región génica codificante de proteínas. Expresión génica: proceso global a través del cual se convierte la información codificada en un gen, en un fenotipo observable (el ARNm ya es expresión). Factor de elongación: una de varias proteínas no ribosómicas requeridas para la traducción continua de ARNm, después de la iniciación. Factor de iniciación: una de un conjunto de proteínas que favorecen la adecuada asociación de los ribosomas y el ARNm, fundamentales para el inicio de la síntesis proteica. Factor de terminación: una de varias proteínas que actúan para finalizar la síntesis proteica a través del reconocimiento de un codón de detención en el ARNm, con la consiguiente liberación de las subunidades ribosomales. Factor de transcripción: término general para cualquier proteína, distinta de la ARN polimerasa, requerida para iniciar o regular la transcripción en las células eucariontes. En la formación del complejo de iniciación de la transcripción, cerca del sitio iniciador, participan factores generales, requeridos para la transcripción de todos los genes. Factores específicos estimulan o reprimen la transcripción de genes particulares a través de la unión con sus secuencias reguladoras. Fenómica: rama de la biología molecular que estudia la expresión génica. Fenotipo: características observables de una célula u organismo, como consecuencia de la expresión de su genotipo, y en el cual contribuye el medio ambiente. En farmacogenómica, involucra el efecto clínico ante un tratamiento con drogas, o el grado de metabolización de las mismas. Fragmentos de Okazaki: secuencias de ADN monocatenarios de menos de 1000 bases, formados durante la síntesis de una hebra discontinua durante la replicación del ADN, que rápidamente es unido por la ADN ligasa, para formar una hebra de ADN continua (Figura 6). Gen: unidad física y funcional de la herencia, que transporta información de una generación a otra. Secuencia de ADN que incluye exones, intrones y regiones de control regulatorias, necesarias para la producción de una proteína o un ARN funcionales. Genética reversa: metodología empleada en biología molecular para, a partir de una determinada secuencia aminoacídica (proteína) obtener las secuencias de ARNs mensajeros posibles, con la finalidad de obtener la secuencia génica que originó la proteína en cuestión. Genoma: la totalidad de la información genética existente en una célula u organismo. El genoma humano está compuesto por el genoma nuclear y el genoma mitocondrial. Genómica: estudio no solo del gen en sí mismo, sino de su función e interacción con los demás genes del genoma y el medio ambiente. Se encarga del análisis comparativo de las secuencias genómicas completas de distintos organismos. Se utiliza para evaluar las relaciones evolutivas entre especies (genómica evolutiva) y predecir la cantidad y tipos generales de proteínas producidas por un organismo. Genotipificación: determinación de marcadores genéticos con características singulares (marcadores de enfermedad, de pronósticos, etc). Determinación del genotipo para un locus determinado en uno o más individuos. Genotipo: secuencia genética completa de una célula u organismo aislado. Haploide: organismo o célula que solo posee un miembro de cada par de cromosomas homólogos, y en consecuencia, una única copia (alelo) de cada gen o sitio genético. Los gametos y las células bacterianas (tienen un solo cromosoma) son haploides. Helicasa: enzima que se desplaza a lo largo de un ADN doble cadena, utilizando la energía liberada por hidrólisis de ATP, para liberar (desenrollar) las dos hebras. Utilizada en la replicación y la transcripción del ADN (Figura 6). Revista Argentina de Anestesiología

4 Artículo de revisión Heterocigoto: célula u organismo diploide que contiene dos alelos diferentes de un gen particular. Heterocromatina: región de cromatina que permanece muy condensada y transcripcionalmente inactiva, durante la interfase. Histonas: familia de proteínas pequeñas básicas muy conservadas que se encuentran en la cromatina de todas las células eucariontes; se asocian con el ADN en el nucleosoma. Iniciador {primer}: secuencia promotora eucarionte de la ARN polimerasa II, que especifica la iniciación de la transcripción dentro de la secuencia. Inserción: agregado de un nucleótido o más en una secuencia nucleotídica. La inserción de una o más bases en una secuencia génica puede generar una patología o anomalía. Intrón: secuencia de bases de ADN que interrumpen las secuencias codificantes de proteínas (exones) en un gen; estas secuencias son transcriptas en un ARNm inmaduro, pero son eliminadas del ARNm antes de ser traducido en una proteína. Locus: es la posición de una determinada secuencia (SNP, gen u otro rasgo), en el genoma (plural: loci). Mapeo: es el proceso de deducir representaciones esquemáticas del ADN. Se pueden construir tres tipos de mapas de ADN: mapas físicos, mapas genéticos y mapas citogenéticos. Marco de lectura: secuencia de tripletes, desde el codón inicio hasta el codón terminal, que dará origen a una proteína (Figura 7). Metabonómica: análisis de los procesos metabólicos y sus moléculas en salud y enfermedad, mediante medición cuantitativa de la respuesta metabólica multiparamétrica de los sistemas ante estímulos fisiopatológicos o modificaciones genéticas. Animales y humanos presentan una consistente respuesta metabólica a la enfermedad, y efectos (deseables y adversos) a las drogas. Estas respuestas son complejas, y a menudo un solo marcador no puede ser identificado. Esta ciencia provee los medios para caracterizar este perfil holístico. Gracias a la espectroscopía RMN se puede identificar un amplio rango de componentes en sangre u orina. Tiene muchos usos, desde la identificación de nuevas rutas metabólicas asociadas a enfermedad, hasta el diagnóstico clínico de enfermedad. Metafase: estadio de la mitosis en el cual los cromosomas están en su máximo estado de compactación. Adosados al huso mitótico en el ecuador, aún no han iniciado la separación hacia los polos opuestos del huso (Figura 1). Microarray: la posibilidad de evaluar la variación individual en un solo ensayo genético, es decir, determinar la variación de por lo menos SNPs en cada individuo, es factible gracias a desarrollos en el campo de la microelectrónica aplicada a la genética molecular. El desarrollo recibe el nombre de chip genético (microarray) y tiene el tamaño de una estampilla en la cual se imprimen hasta secuencias de ADN diferentes de aproximadamente 30 nucleótidos de longitud, que son inmovilizadas en una superficie sólida por técnicas de fotolitografía, semejantes a las utilizadas en la construcción de semiconductores. Un conjunto de sondas que abarcan la variabilidad genómica de un individuo se harán reaccionar con el chip y permitirá obtener un patrón de hibridación que representa su perfil genómico. Este se analiza en un lector confocal integrado con un procesador electrónico. Este análisis múltiple de marcadores individuales permitirá, no solo continuar el análisis de las enfermedades genéticas monofactoriales, sino también comenzar con mayores posibilidades de éxito el análisis de enfermedades multifactoriales y el desarrollo de la farmacogenómica. Monómero: unidades químicas aisladas (ej: nucleótidos- A, T, etc). Nucleótido: Unidad monomérica de ácidos nucleicos. Base organica (A, T, C, G) más el azúcar de cinco carbonos (pentosa) más los fosfatos, componentes de los ácidos nucleicos. Operón: en el ADN procarionte es un cúmulo de genes contiguos transcriptos por un promotor, que da origen a ARNm policistrónico. Polímero: múltiples unidades químicas, resultantes de la unión de secuencias monoméricas. Polimorfismo: secuencia de ADN que presenta dos o más variantes en una población. El polimorfismo de un solo nucleótido {SNP} (se pronuncia SNIP en inglés) es el cambio en sólo un nucleótido en la secuencia. Procesamiento del ARNm: mecanismo por medio del cual el ARNm copiado del duplex pierde partes de la secuencia de nucleótidos (intrones) para dar origen al transcripto maduro. Promotor: porción inicial del gen, responsable de su activación o desactivación. Secuencias consenso a las que se unen los factores de transcripción y la ARN polimerasa para activar la expresión de un gen. Reacción en cadena de la polimerasa {PCR}: es un método in vitro para la amplificación enzimática de secuencias específicas de ADN. La amplificación ocurre a través de ciclos de desnaturalización, annealing (recocción o templado) de primers y extensión con Taq ADN polimerasa. Es una técnica rápida y barata para hacer un número ilimitado de copias de cualquier segmento de ADN. ( fotocopia molecular ). Superenrollamientos del ADN: regiones del ADN que presentan enrollamientos de la doble hélice, debidos al estrés de torsión por el desenrollado local. Terapia génica: terapia en evolución que pretende estudiar y evaluar la posibilidad de reparar, sustituir o silenciar parte del repertorio genético de las células con fines terapéuticos. Topoisomerasa: clase de enzimas que controlan la cantidad y la topología de los superenrollamientos del ADN. Las enzimas tipo I cortan las hebras del ADN, las rotan una respecto de la otra y vuelven a sellar los extremos. Las 332 Volumen 62/ Número 5

5 El salto de la doble hélice. Consecuencias enzimas de tipo II cortan y vuelven a sellar ambas hebras de ADN. Traducción: producción de un polipéptido a partir de la secuencia de nucleótidos de un ARN mensajero. Intervienen en ella los ribosomas, ARNm, ARNt y aminoácidos Transcripción: mecanismo nuclear gracias al cual una cadena de ADN es copiada a un ARN complementario, por medio de la acción de una ARN polimerasa. Transcripto primario: producto inicial de ARN, que contiene intrones y exones, obtenido por transcripción del ADN. Los transcriptos primarios son sometidos al [procesamiento del ARN] para formar las especies de ARN con actividad fisiológica específica. Transcriptómica: es una manera global de estudiar los patrones de expresión génica, analizando el transcriptoma (set completo de ARNs producidos por el genoma en un determinado tiempo). Es la medición cuantitativa de la expresión génica en una célula o tejido. Generalmente esto involucra la medición de niveles de ARNm por varios métodos, el más común de los cuales involucra chips génicos. Los problemas aquí involucrados son: que los chips son muy caros, que algunos genes o secuencias no tienen una función conocida, y que las relaciones entre variaciones cuantitativas o patrones en la expresión y las influencias de la célula o caminos celulares son pobremente conocidos. Además, los ARNm no son químicamente estables, por lo cual se tienen que tomar recaudos para asegurar la confiabilidad de las mediciones del chip. En una muestra de tejido, aun en los relativamente homogéneos como el hígado, hay docenas de tipos celulares en diferentes localizaciones topográficas realizando diferentes funciones, y presentando diferentes niveles de actividad genética. El chip génico mide un promedio de esas actividades, cuyo significado aún es incierto. Translocación: ruptura y remoción de un gran segmento de ADN de un cromosoma, seguido por la unión del segmento a otro cromosoma diferente. Xenobióticos: sustancias o drogas extrañas no terapéuticas; contaminantes ambientales. Las figuras citadas serán incluidas en el texto a partir de la RAA Vol. 63 Nº 1. Aceptado: 11/12/04 Dirección postal: Dr. Pedro Barbieri pedrobarbieri@arnet.com.ar Revista Argentina de Anestesiología