CAPÍTULO 5: BASES MOLECULARES DE ALTERACIONES CITOGENÉTICAS 1

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1 CAPÍTULO 5: BASES MOLECULARES DE ALTERACIONES CITOGENÉTICAS 1 Tema 5. Bases moleculares de alteraciones citogenéticas El estudio de los cromosomas humanos. El fenómeno de no disyunción meiótica y sus implicaciones. Mutaciones debidas a repeticiones dispersas. Desórdenes genómicos. El estudio de los cromosomas humanos La citogenética constitucional se ocupa del análisis de los cromosomas en células que representan la línea germinal del individuo (habitualmente linfocitos de sangre periférica), y se llama así para distinguirla de los estudios citogenéticos sobre poblaciones celulares concretas que no representan la constitución genética de todo el individuo (células somáticas, por ejemplo las células de un tumor). La citogenética constitucional refleja, por tanto, la estructura cromosómica que ha sido heredada y que, a su vez, se transmitirá a la descendencia. La citogenética clásica se basa en la creación y análisis del cariotipo, que es la presentación ordenada de los cromosomas cuando se hacen visibles en metafase. Hasta los años 50 se creía que los humanos teníamos 48 cromosomas y que el sexo dependía del número de cromosomas X, como sucede en Drosophila. En 1956 se determinó el número exacto de cromosomas de la especia humana, y en 1959 ya se habían identificado las anomalías cromosómicas características de los Síndromes de Down, Turner y Klinefelter. Esto se debió a mejoras técnicas que permitieron cultivar leucocitos de sangre periférica (estimulando el crecimiento en cultivo con fitohemaglutinina y mitógenos), detener el ciclo celular específicamente en metafase (utilizando sustancias como colchicina) y realizar tinciones específicas del ADN. En 1968 Caspersson introdujo las bandas Q, y en 1971 se introdujeron las bandas G, que son el método más utilizado para generar cariotipos. La cromatina es una estructura dinámica cuyo grado de empaquetamiento es máximo durante la mitosis, y por eso en esta fase del ciclo celular se puede ver en una forma especialmente condensada que da lugar a los cromosomas. Como hemos visto, esta condensación se produce porque la fibra de cromatina de 300 nm se enrolla en forma de espiral, proporcionando un grado de empaquetamiento unas 5 veces mayor al observado durante la interfase. La mitosis es el proceso de división de las células somáticas, fundamental en la proliferación celular que tiene lugar durante el desarrollo embrionario, el crecimiento y el mantenimiento de los tejidos. Supone una reorganización drástica de todos los componentes celulares, pero muy especialmente de los cromosomas, cuya segregación a cada una de las células hijas debe ser muy precisa y estar finamente regulada y coordinada con la separación física de las nuevas células (citoquinesis). Durante la mitosis, la maquinaria celular se especializa en llevar a cabo los distintos procesos que tienen lugar en la célula: condensación de la cromatina, formación del huso mitótico, segregación de los componentes y fisión celular. Figura 5.1 video que ilustra las principales fases de la mitosis, en lo que respecta al comportamiento de los cromosomas y la separación de las cromátides hermanas. La primera fase de la mitosis (profase), comienza con la condensación de la cromatina, la ruptura de la envuelta nuclear y el desarrollo del huso mitótico. Es importante recordar que la cromatina ha sido

2 CAPÍTULO 5: BASES MOLECULARES DE ALTERACIONES CITOGENÉTICAS 2 replicada en la fase S de la interfase previa, por lo que cada cromosoma está ahora formado por dos cromátides hermanas. Los microtúbulos se unen a los quinetocoros, estructuras proteicas formadas sobre los centrómeros de cada cromosoma, y comienzan a transportar a los cromosomas hacia el plano ecuatorial del huso. En la fase siguiente (metafase) cada cromosoma está unido a microtúbulos procedentes de los dos polos de la célula, de modo que todos los cromosomas están en el ecuador del huso mitótico sometidos a fuerzas tensionales opuestas. Los mecanismos moleculares que regulan la cohesión de cromátides hermanas comienzan a conocerse cada vez mejor, y su implicación en patología humana está adquiriendo mayor relevancia. Por ejemplo, se han identificado las proteínas cromosómicas necesarias para mantener la cohesión de cromátides hermanas, que se denominan cohesinas. En eucariotas funcionan como cohesinas al menos cuatro miembros de la familia SMC (Structural Maintenance of Chromosomes), y en Xenopus (sapo) se ha identificado un complejo que es necesario para la cohesión y que está formado por SMC1 y SMC3 junto con SCC1 (Sister Chromatid Cohesion 1). La cohesión se establece en la fase S del ciclo celular, durante la replicación del ADN, aunque las cohesinas estaban ya presentes en la cromatina. Al replicarse el ADN, ambas cromátides quedan unidas por las cohesinas en toda su longitud, distinguiéndose dos tipos de cohesión: la cohesión en los centrómeros y la cohesión en los brazos cromosómicos. Ambos tipos de cohesión están mediados por cohesinas, pero los procesos que los regulan son algo diferentes. El mantenimiento de esta cohesión durante metafase es muy importante, porque es precisamente el balance entre las fuerzas de los microtúbulos y la cohesión de ambas cromátides lo que permite el alineamiento de los cromosomas en el mismo plano: la tendencia de los microtúbulos a separar las cromátides se ve contrarrestada por la cohesión que las mantiene unidas, y gracias a esta cohesión se genera la tensión necesaria para formar la placa metafásica. Es precisamente la pérdida brusca de cohesión lo que permite la separación de las cromátides. Lógicamente, un componente fundamental en estos procesos es el quinetocoro, que en definitiva es el punto de cada cromosoma donde se anclan los microtúbulos. Existe en células eucariotas un sistema que comprueba que todos los quinetocoros estén unidos a microtúbulos y activa un punto de control que impide la separación de las cromátides antes de conseguir la perfecta unión de todos los quinetocoros a sus microtúbulos respectivos. La metafase va seguida por la anafase, en la que tiene lugar la segregación de las cromátides hermanas de cada cromosoma hacia polos opuestos de la célula. La separación simultánea de 46 pares de cromátides hermanas en la transición metafase-anafase es un momento crucial del ciclo celular, y por tanto está finamente regulado. Por ejemplo, es crítico que la cohesión se pierda en el momento adecuado, para que cada cromátide pueda migrar a una célula hija sin errores. En general, se observa que primero se pierde la cohesión en los centrómeros, y a medida que los microtúbulos van "tirando" de los quinetocoros se va perdiendo la cohesión en los brazos. La separación se lleva a cabo mediante la degradación de las cohesinas. La última fase de la mitosis es la telofase, en la que los cromosomas vuelven a descondensarse y se forma la envoltura nuclear alrededor de cada uno de los nuevos núcleos que se han formado en cada polo de la célula. Terminada la mitosis, el proceso de división celular se completará con la citoquinesis, en la que los componentes celulares se reordenan y se reorganiza el citoesqueleto para facilitar la divisón física de la célula en dos células hijas. Dada la importancia de la separación de las cromátides hermanas en anafase, se ha investigado mucho en torno a su regulación. Se sabe que la degradación de las cohesinas se lleva a cabo por dos mecanismos distintos: fosforilación (mediada por la quinasa Polo) de algunos componentes, y proteolisis de otros. Las proteínas implicadas en la proteolisis de la cohesinas se llaman separinas (ó separasas). Se ha comprobado que las separinas son capaces de romper el complejo cohesina porque degradan la proteína SCC1 (una cohesina) durante el comienzo de la anafase, permitiendo la separación de las cromátides por la fuerza que ejercen los microtúbulos. Cómo se activan las separinas en el momento exacto de la anafase? Esto se ha resuelto gracias a la identificación de las securinas,

3 CAPÍTULO 5: BASES MOLECULARES DE ALTERACIONES CITOGENÉTICAS 3 proteínas que inhiben la acción proteolítica que ejercen las separinas sobre las cohesinas. Por tanto, durante la mitosis las securinas están unidas a las separinas y así inhiben su acción, de modo que el complejo cohesina permanece intacto y las cromátides permanecen unidas. La disociación de las cohesinas se produce por la degradación súbita de las securinas al comienzo de la anafase, de manera que las separinas quedan libres y pueden cortar por proteolisis el complejo cohesina. El evento crucial, por tanto, es la degradación de securinas, degradación que está mediada por un complejo proteico llamado APC (Anaphase Promoting Complex) que posee actividad ubiquitina-protein-ligasa y promueve la degradación de diversas proteínas al comienzo de la anafase. Lógicamente, estos procesos no deben comenzar hasta que todos los quinetocoros están correctamente unidos a los microtúbulos del huso, pues de lo contrario la segregación de las cromátides no sería correcta. Por tanto, existe también un mecanismo de señalización que detecta si todos los quinetocoros han sido correctamente unidos por microtúbulos y envía una señal de activación del APC, para que dé comienzo la pérdida de cohesión. Figura 5.2 Proceso de degradación de las cohesinas, necesario para que pueda tener lugar la correcta separación de las cromátides hermanas durante la mitosis, explicado en este video. En organismos de reproducción sexual, la formación de los gametos implica un modo de división celular diferente al de las células somáticas. Los gametos deberán poseer una sola copia de cada cromosoma, de modo que el cigoto resultante de la unión del gameto masculino y del gameto femenino en la fertilización sea diploide (con un cromosoma de origen paterno y otro cromosoma de origen materno en cada par cromosómico). Para obtener un número haploide (n) de cromosomas en los gametos, el proceso de formación de los mismos (gametogénesis) tiene unas características especiales. La principal peculiaridad es la existencia de un tipo distinto división celular en el que una célula diploide (2n) replica su ADN una vez (duplicando su contenido total en ADN de 2C a 4C) pero experimenta dos divisiones cromosómicas; esto tiene como consecuencia que los gametos masculino (espermatozoide) y femenino (oocito) llevan un número haploide de cromosomas (n) y un contenido total de ADN igual a C (una cromátide por cromosoma). Este modo de división celular se denomina meiosis, y tiene además otras características muy importantes para la transmisión de la variabilidad genética. En ambas líneas germinales, masculina o femenina, la gametogénesis comienza cuando los gonocitos experimentan una serie de divisiones mitóticas típicas en las que las células van madurando hasta llegar a formar las gonias (espermatogonias u oogonias, respectivamente) y los gametocitos primarios, que son células diploides (2n). A partir de este momento, las células replican su ADN en la fase S y a continuación entran en meiosis, en vez de dividirse por mitosis. Figura 5.3 Visión general de la gametogénesis, tanto en la vía masculina (espermatogénesis) como en la femenina (oogénesis). El desarrollo es paralelo en ambas vías, con la diferencia de la aparición de corpúsculos polares en la oogénesis. La maduración final hace que los espermatozoides y el óvulo sean células de características muy distintas. La imagen representa una célula con dos pares cromosómicos, uno en tonos rojos y otro en tonos azules. Es muy importante seguir la pista a las distintas cromátides.

4 CAPÍTULO 5: BASES MOLECULARES DE ALTERACIONES CITOGENÉTICAS 4 La meiosis incluye en realidad dos distintas divisiones cromosómicas, por lo que suele separarse en dos fases llamadas meiosis I (ó primera división meiótica) y meiosis II (segunda división meiótica). La meiosis I es la más importante de las dos, y comienza con una profase larga, complicada y claramente distinta de la profase de la mitosis. Esta profase de la meiosis I (llamada, por tanto, profase I) comienza con la condensación de la cromatina que, no lo olvidemos, se había replicado en la fase S precedente. Ambas cromátides están íntimamente unidas formando un único filamento, que se une por sus extremos a la membrana nuclear. Esta primera parte de la profase I se llama leptoteno. En la siguiente etapa, llamada cigoteno, los cromosomas homólogos se emparejan longitudinalmente con gran exactitud, de manera que las secuencias de cada uno de los dos homólogos quedan perfectamente alineadas. La unión entre los cromosomas de cada par se hace progresivamente más fuerte, dando lugar a un fenómeno que se conoce como sinapsis. La sinapsis se mantiene gracias a la formación del complejo sinaptonémico. La profase I continúa con la siguiente etapa, paquiteno, en la que los cromosomas se condensan todavía más y cada par de homólogos apacece como un bivalente (una estructura formada por dos cromosomas) ó tétrada (por estar formada por cuatro cromátides). De todas formas, el evento más importante de la etapa de paquiteno es el intercambio de material genético entre cromosomas homólogos, a través del proceso de recombinación que estudiaremos más adelante. En la siguiente etapa, la de diploteno, desaparece el complejo sinaptonémico y los cromosomas homólogos comienzan a separarse. Recordemos que hasta este momento la célula es diploide (2n) con contenido 4C de ADN, al tener dos cromátides por cromosoma. Durante la separación de los cromosomas homólogos en diploteno, las dos cromátides de cada cromosoma permanecen todavía unidas entre sí. Sin embargo, debido al intercambio de material genético precedente, la separación pone de manifiesto los puntos en los que se produjo un sobrecruzamiento, ya que esas regiones forman "puentes" que mantienen unidos a los dos homólogos de cada par e impiden la separación total. Estos puntos se

5 CAPÍTULO 5: BASES MOLECULARES DE ALTERACIONES CITOGENÉTICAS 5 denominan quiasmas, y han de resolverse de algún modo para que la separación de los cromosomas pueda completarse. Por tanto, la profase I termina con una etapa corta denominada diaquinesis, en la que la cromatina alcanza su grado máximo de condensación y los cromosomas aparecen más cortos y gruesos. Tras la profase I, los espermatocitos primarios entran ahora en metafase I, en la cual desaparece la membrana nuclear, se forma el huso y los microtúbulos traccionan por los quinetocoros. Esto hace que los bivalentes, que llevan los cromosomas parcialmente separados (unidos únicamente por los quiasmas), se orienten en el ecuador de la célula. Debido a esta configuración, los cromosomas homólogos se sitúan en la placa metafásica con los centrómeros apuntando cada uno hacia uno de los polos de la célula. En la anafase I, la tracción de los microtúbulos y la activación del Complejo Promotor de la Anafase permiten la separación total de cada cromosoma homólogo hacia uno de los polos, fenómeno llamado disyunción. Finalmente, en la telofase I se han formado ya dos grupos de cromosomas en cada polo de la célula: cada uno de estos grupos consta de un número haploide (n) de cromosomas, cada uno de los cuales posee dos cromátides (contenido total de ADN igual a 2C). La meiosis I termina con la citoquinesis, la división física de las dos células hijas. Esta última fase es diferente en la línea germinal masculina y femenina, porque así como las células hijas del espermatocito primario son iguales, en el caso de la línea femenina una de las dos células hijas se lleva casi todo el citoplasma mientras que la otra es mucho menor. Por tanto, en la espermatogénesis cada esperamatocito primario da lugar a dos espermatocitos secundarios, mientras en la oogénesis cada oocito primario da lugar a un oocito secundario y a un corpúsculo polar de primer orden. La segunda división meiótica, ó meiosis II, es prácticamente igual a una mitosis. La única diferencia estriba en que la célula que se divide es haploide, mientras que en el caso de la mitosis la célula es diploide. Por tanto, esta división celular va a separar las dos cromátides que componen cada cromosoma de un gametocito secundario, para generar gametos con un número haploide de cromosomas (n), cada uno de los cuales está formado por una sola cromátide (contenido total de ADN igual a C). Como decíamos al principio, esto asegura que la fecundación da lugar a un cigoto diploide (2n) con contenido de ADN igual a 2C, al recibir un complemento cromosómico de cada gameto. El modo en que se completa la meiosis es también diferente en ambos sexos. Así como la espermatogénesis discurre de un modo continuo desde que se alcanza la madurez sexual, la oogénesis se detiene en profase I, de manera que un alto número de oocitos primarios permanecen en un estado prolongado de diploteno, llamado dictioteno. Estos oocitos sólo proseguirán su maduración al llegar la madurez sexual, cuando con cada ciclo menstrual un oocito culmina la meiosis I y completa también la meiosis II para dar un oocito secundario (óvulo) y un segundo corpúsculo polar. Figura 5.4 Video en el que se muestran esquemáticamente las distintas fases de la meiosis. Es importante fijarse en un hecho distintivo de la anafase de la meiosis I, que no comparten ni la anafase de la meiosis II ni la anafase de la mitosis. Este hecho consiste en que los cromosomas homólogos se separan pero, al mismo tiempo, las dos cromátides de cada cromosoma permanecen unidas por los centrómeros, por la acción de unas moléculas llamadas shugoshinas,. Esto se consigue porque las cohesinas centroméricas no son degradadas por las separasas. Las shugoshinas se unen específicamente a los centrómeros en asociación con una fosfatasa, lo que impide la fosforilación de las cohesinas a ese nivel y su posterior degradación por las separasas. Después, en la meiosis II, la

6 CAPÍTULO 5: BASES MOLECULARES DE ALTERACIONES CITOGENÉTICAS 6 ausencia de shugoshinas permite una segunda ola de activación de separasas que finalmente llevará a la separación completa de las dos cromátides de cada cromosoma homólogo. El fenómeno de no disyunción meiótica Se estima que hasta un 5% de todas las concepciones humanas son aneuploides, aunque la gran mayoría de éstas terminan en abortos espontáneos y no se reconocen clínicamente. La incidencia de aneuploidías varía según el periodo gestacional: Frecuencia de anomalías cromosómicas en: Mortinatos (20 a 40 semanas de gestación): 4% Abortos espontáneos detectables clínicamente (7 a 8 semanas de gestación): 35% Abortos espontáneos NO detectables clínicamente (antes de 7 semanas): 20% También se ha visto que hasta un 20% de los oocitos humanos son portadores de aneuploidías, mientras que sólo el 1-2% de los espermatozoides tienen alteraciones en el número de cromosomas. De estos datos se concluye que la segregación de cromosomas durante la meiosis especialmente durante la oogénesis no es un proceso totalmente eficaz. La segregación cromosómica incorrecta origina alteraciones cromosómicas en el embrión, pero la mayoría de estos embarazos se pierden porque esas alteraciones son letales en las fases iniciales del desarrollo embrionario. Como se recordará, los cromosomas homólogos y las cromátides hermanas se separan en cada una de las dos divisiones que tienen lugar durante la meiosis. Las aneuploidías se producen por una separación incorrecta (no-disyunción) en una de las dos divisiones meióticas, aunque lo más frecuente es la falta de disyunción en meiosis I por la presencia de un sobrecruzamiento mal posicionado. Como hemos visto, una gonia diploide da lugar a cuatro gametos haploides ya que, tras la replicación del ADN en el gonocito primario, la primera división meiótica genera células con un solo cromosoma de cada par (aunque cada uno tiene todavía dos cromátides hermanas); la segunda división meiótica separa las cromátides hermanas a cada uno de los gametos. Teniendo este esquema en mente, es fácil comprender que los efectos de una no-disyunción en la meiosis I serán distintos a los efectos de una nodisyunción en la meiosis II. Si la no-disyunción ha tenido lugar en meiosis I, se producirán 2 gametos nulisómicos (sin ninguna copia de ese cromosoma) y dos gametos disómicos (con dos copias), los cuales llevarán una copia de cada cromosoma homólogo presente en la célula progenitora (es decir, son heterodisómicos). Por el contrario, si la no-disyunción sucede en la meiosis II, tendremos 2 gametos normales, un gameto nulisómico y un gameto disómico con dos copias idénticas (isodisómico). El video de la Figura 5.5 muestra los tipos de gametos resultantes de la nodisyunción en meiosis I o en meiosis II. Como se ha mencionado más arriba, está comprobado que la mayoría de los errores de disyunción tienen lugar durante la oogénesis, especialmente en meiosis I. Esto se ha relacionado con el hecho de que la gametogénesis femenina al contrario de lo que sucede en la espermatogénesis experimenta una meiosis I especialmente larga (comienza en el periodo fetal y culmina con cada ovulación, entre 15 y 45 años después). Este hecho podría aumentar la sensibilidad del oocito a sufrir no-disyunciones. Estudios recientes muestran que la aparición de no-disyunciones tiene que ver con la posición de los quiasmas durante la recombinación, de modo que los quiasmas que están

7 CAPÍTULO 5: BASES MOLECULARES DE ALTERACIONES CITOGENÉTICAS 7 demasiado cerca de los centrómeros o de los telómeros favorecen los errores en la separación de los cromosomas homólogos. Actualmente se piensa que la maquinaria que procesa los quiasmas va perdiendo eficacia con los años, por lo que los oocitos con quiasmas en localizaciones "subóptimas" originan errores de disyunción con mayor facilidad en oocitos "viejos" que en oocitos "jóvenes". Esto encaja bien con el hecho de que las aneuploidías son más frecuentes al aumentar la edad materna. Respecto a las causas moleculares de la no-disyunción, es razonable pensar que la des-regulación de los procesos de recombinación, cohesión y separación de cromátides sea responsable, en buena medida, de la segregación deficiente de los cromosomas a las células hijas. Como se recordará, durante la meiosis I cada pareja de quinetocoros hermanos es arrastrada hacia un extremo del huso acromático; si ha habido un sobrecruzamiento, la cohesión debida a la presencia de los quiasmas se opondrá a la fuerza de los microtúbulos que tienden a separar los dos cromosomas homólogos. Por tanto, es fundamental que la cohesión entre cromosomas homólogos se mantenga a nivel de los centrómeros mientras los homólogos se separan, para que las cromátides se mantengan unidas hasta la llegada de la meiosis II. En este sentido, la alteración de cualquiera de las proteínas que regulan estos procesos (estudiadas en el apartado anterior) puede provocar la aparición de aneuploidías. Por ejemplo, los ratones con mutaciones en SMC1beta (una cohesina específica de la meiosis) han puesto de manifiesto que dicha cohesina se une a los quiasmas y que es causa de aneuploidías relacionadas con la edad, ya que la frecuencia de no-disyunciones va aumentando con la edad en las hembras. Esto se ha visto corroborado por la detección de alteraciones de estos mecanismos en células tumorales, caracterizadas por la presencia de aneuploidías muy marcadas. Se ha visto, por ejemplo, que en tumores colorrectales aneuploides hay mutaciones en el gen BUB1, que codifica una proteína del complejo proteico que regula la cohesión en los quinetocoros. Además, se ha demostrado que una securina denominada PTTG (pituitary tumour transforming gene) tiene propiedades de oncogén: muestra niveles altos de expresión en tumores pituitarios y es un factor de mal pronóstico en cáncer de colon, ya que los niveles de PTTG correlacionan con la invasividad del tumor. Todo esto pone de manifiesto que los genes implicados en los mecanismos que regulan la segregación de cromátides hermanas durante la división celular son muy importantes para mantener una correcta segregación cromosómica durante la mitosis, y es lógico pensar que lo mismo se puede aplicar a la meiosis. Mutaciones debidas a repeticiones dispersas Las repeticiones dispersas del genoma humano, estudiadas con detalle en el Capítulo 1, suelen dar lugar a reordenamientos cromosómicos por un mecanismo denominado "sobrecruzamiento desigual" (en inglés, UnEqual Cross-over, UEC). Habitualmente, la recombinación homóloga durante la meiosis tiene como finalidad producir nuevas combinaciones de alelos, ya que se recombinan cromosomas homólogos. El sobrecruzamiento desigual consiste en la recombinación entre secuencias homólogas pero noalélicas (es decir, que tienen homología en su secuencia pero están en localizaciones genómicas diferentes). Tal es el caso, por ejemplo, de los genes parálogos (miembros de una familia génica, con alto grado de homología entre ellos) o de las repeticiones dispersas tipo SINE ó LINE (cuyos miembros tienen una secuencia muy homóloga). Un buen ejemplo que ilustra los efectos del sobrecruzamiento desigual es el mecanismo que origina varones con cariotipo XX ó mujeres XY (con disgenesia gonadal y disfunción ovárica). Hasta un 30% de los casos de estas patologías son debidos a un sobrecruzamiento desigual entre los genes PRKX y PRKY, genes homólogos que están cerca de la Región Pseudoautosómica de los cromosomas sexuales X e Y, respectivamente. Fruto de esta recombinación desigual, el gen SRY gen que determina el sexo masculino, situado en el cromosoma Y acompaña al fragmento telomérico del cromosoma Y que se mueve al cromosoma X, dando como

8 CAPÍTULO 5: BASES MOLECULARES DE ALTERACIONES CITOGENÉTICAS 8 resultado un cromosoma X que contiene SRY y un cromosoma Y sin SRY. Esto origina individuos que fenotípicamente son varones a pesar de ser XX, así como mujeres con cariotipo XY. Figura 5.6 Esquema de la translocación entre los cromosomas X e Y por un sobrecruzamiento desigual entre secuencias muy homólogas (aunque no idénticas) en ambos cromosomas. Además, los fenómenos de recombinación desigual son causa frecuente de duplicaciones o deleciones cuando tienen lugar entre repeticiones no alélicas de gran tamaño con un alto grado de homología, como son las duplicaciones segmentarias del genoma humano, que ya mencionamos en un capítulo anterior. Habitualmente, esto sucede entre secuencias que pertenecen a cromosomas distintos, pero en ocasiones la recombinación o sobrecruzamiento desigual también puede tener lugar entre cromátides hermanas. En este caso se produce el llamado "intercambio desigual entre cromatides hermanas" (en inglés, UnEqual Sister Chromatid Exchange, abreviado UESCE), que da lugar a alteraciones en ambas cromátides de un mismo cromosoma: habitualmente se produce una duplicación en una cromátide y una deleción en la otra. El video de la Figura 5.7 muestra el proceso de recombinación desigual entre secuencias homólogas no-alélicas, tanto en el caso de que estas secuencias estén en cromosomas distintos como si están en cromátides hermanas. Otro posible efecto de la recombinación desigual entre secuencias homólogas es la conversión génica entre ellas. Como hemos visto al hablar de la recombinación homóloga, durante ese proceso se puede formar un heterodúplex (desemparejamiento) que puede dar lugar a un proceso de conversión génica, de modo que una de las secuencias se copia a la otra. Habitualmente, la conversión génica tiene lugar entre alelos de un mismo gen; sin embargo, la recombinación desigual entre dos secuencias no alélicas (un gen y un pseudogen no funcional, por ejemplo) puede provocar la conversión de la secuencia del gen en la secuencia del pseudogen, lo que equivaldría a anular la función del gen. Un ejemplo clásico de este mecanismo es la enfermedad llamada "Hiperplasia Suprarrenal Congénita" (déficit del enzima 21-hidroxilasa). Alrededor del 75% de los casos de esta enfermedad están provocados por un fenómeno de conversión génica entre el gen CYP21B (que codifica el enzima) y el pseudogen CYP21A (que no es funcional).

9 CAPÍTULO 5: BASES MOLECULARES DE ALTERACIONES CITOGENÉTICAS 9 De modo general, hasta ahora hemos considerado elementos repetidos que están en la misma orientación (en sentido 5 3 ) cuando se recombinan ilegítimamente. Puede suceder, sin embargo, que las repeticiones estén invertidas (en orientaciones contrarias una respecto de la otra). En este caso, la recombinación entre elementos repetidos dará lugar a la inversión de la región que queda entre las repeticiones, como se verá en un ejemplo del siguiente apartado. Desórdenes genómicos En conjunto, los procesos de recombinación desigual dan lugar a un grupo de enfermedades humanas que se conocen con el nombre de Desórdenes Genómicos, y que incluyen entre otros los Síndromes por microdeleción: enfermedades debidas a pequeñas deleciones (no visibles en un cariotipo convencional) en las que se pierden uno o varios genes. Los Desórdenes Genómicos se pueden agrupar como sigue: A. Debidos a deleciones: Los pacientes con Ictiosis ligada al X tienen una deleción del gen de la sulfatasa esteroidea en Xp22, por reordenación entre elementos repetidos (separados por 1,9 Mb) que flanquean este gen. La deleción que produce el Síndrome de Williams-Beuren está originada por recombinación entre duplicaciones segmentarias que flanquean el gen de la elastina en 7q11, repeticiones que están separadas por 1,6 Mb. La causa más frecuente de los Síndromes de Prader-Willi y de Angelman es una deleción de 4 Mb por recombinación desigual entre duplicaciones en 15q11-q13. La reordenación más frecuente en el cromosoma 22 es la deleción de unas 3 Mb en 22q11.2, que se encuentra en el 90% de pacientes con Síndrome de Di George ó con Síndrome Cardio-velo-facial. Un caso especial de deleción de secuencias repetidas es la contracción de una serie de repeticiones en tándem cerca del telómero 4q, que origina una enfermedad llamada distrofia facio-escápulo-humeral. Recientemente se ha comprendido el mecanismo molecular de dicha enfermedad. En la región subtelomérica 4q existe un elemento llamado D4Z4 que está repetido en tándem. Los cromosomas normales tienen entre 10 y 100 repeticiones del elemento. Los cromosomas contraídos, que tienen entre 1 y 10 repeticiones, pueden dar lugar a la enfermedad si además ese cromosoma tiene un satélite beta a continuación de la repetición (lo que se conoce como variante 4qA); los cromosomas 4q sin el satélite beta no dan lugar a la enfermedad, aunque tengan sólo 1-10 repeticiones D4Z4 (variante 4qB). Esta contracción desencadena la enfermedad mediante la des-regulación de genes cercanos a esa región, especialmente por sobre-expresión del gen DUX1.

10 CAPÍTULO 5: BASES MOLECULARES DE ALTERACIONES CITOGENÉTICAS 10 Figura 5.8 Se esquematizan las regiones delecionadas en algunos desórdenes genomicos. En todos los casos se muestran los elementos repetidos (duplicaciones segmentarias, habitualmente) que interaccionan en procesos de recombinación desigual y provocan la

11 CAPÍTULO 5: BASES MOLECULARES DE ALTERACIONES CITOGENÉTICAS 11 deleción de la región que queda entre ellos. Dichos elementos aparecen como rectángulos verdes. B. Debidos a duplicaciones/deleciones: Los reordenamientos entre dos elementos llamados CMT1A-REP, localizados en 17p12, dan lugar a individuos con la duplicación o con la deleción de la región comprendida entre ambas repeticiones. Esta región incluye el gen PMP22, que codifica una proteína de la mielina, y la duplicación o deleción de esta región origina enfermedades dos distintas (Charcot-Marie-Tooth o Neuropatía Hereditaria con Parálisis por Presión, respectivamente). Las repeticiones CMT1A-REP tienen un tamaño de unas 30 kb y están a una distancia de 1,5 Mb, de forma que el sobrecruzamiento desigual entre ellas origina la deleción o duplicación de esa región. Estas repeticiones tienen una región pequeña (1,7 kb) que es casi totalmente idéntica en todas ellas, y también contienen un elemento similar al transposón "mariner". Parece que la presencia de éste último puede favorecer la acción de una transposasa a este nivel y facilitar la recombinación desigual entre cromátides. Algo similar sucede en el Síndrome de Smith-Magenis, debido a una deleción de unas 5 Mb en 17p11.2. Los individuos con duplicación de esa región tienen un fenotipo distinto. Figura 5.9 Regiones del cromosoma 17 que se alteran en el Sindrome de Charcot-Marie-Tooth y en el Síndrome de Smith-Magenis. En ambos casos, las alteraciones están provocadas por recombinación desigual entre elementos homólogos (rectángulos verdes). En la parte izquierda se esquematizan las alteraciones que dan lugar al Síndrome de Charcot- Marie-Tooth (CMT) y a la Neuropatía Hereditaria con Parálisis por Presión (HNPP), por duplicación o deleción de la misma región genómica, respectivamente.

12 CAPÍTULO 5: BASES MOLECULARES DE ALTERACIONES CITOGENÉTICAS 12 C. Debidos a Inversiones: Cuando la recombinación desigual se produce entre repeticiones invertidas que están en la misma cromátide, a menudo se originan inversiones cromosómicas. Este fenómeno es especialmente frecuente como causa de Hemofilia A, una coagulopatía debida al déficit de Factor VIII de la coagulación. El gen que codifica el Factor VIII tiene un elemento llamado int22h que está repetido dos veces antes del exón 1 y otra vez (en la orientación contraria) en el intrón 22 (entre los exones 22 y 23). Un sobrecruzamiento desigual entre uno de los elementos que están antes del exón 1 con el elemento del intrón 22 dará lugar a una inversión de toda la región comprendida entre ambas repeticiones, rompiendo totalmente la capacidad codificante del gen. Este mecanismo es responsable de un 45% de los casos de Hemofilia A en humanos, lo que subraya la gran importancia de este tipo de fenómenos en patología humana. Figura 5.10 La mutación más frecuente en el gen del Factor VIII de la coagulación (causa de la hemofilia A) es una inversión que incluye toda la parte inicial del gen hasta el exón 22. Dicha inversión se debe a la recombinación desigual entre unos elementos repetidos en orientación invertida, tal y como se muestra en este video. Otro ejemplo de inversión es la que da lugar a la distrofia muscular de Emery-Dreifuss, por recombinación entre repeticiones invertidas en Xq28. Este caso es especialmente interesante porque se ha detectado la inversión de esta región en un tercio de las mujeres normales. D. Otras anomalías: La recombinación desigual entre elementos duplicados del genoma humano origina también otros procesos. Por ejemplo, la duplicación invertida del cromosoma 15 es el cromosoma marcador que se encuentra con mayor frecuencia en recién nacidos. También se encuentra un cromosoma marcador dicéntrico debido a una duplicación invertida en 22q en pacientes con Síndrome de Ojo de Gato, por reordenamientos entre duplicaciones segmentarias. Estas mismas duplicaciones están implicadas en la translocación t(11;22)(q23;q11), que es la única translocación recíproca equilibrada recurrente en humanos. Finalmente, se ha observado que hasta un 1% de los casos de retraso mental esporádico pueden ser debidos a una microdeleción en 17q21.31, por recombinación entre duplicaciones segmentarias flanqueantes. En esta región, se ha visto que el 80% de los europeos llevan cromosomas tipo H1, formados por dos parejas de duplicaciones segmentarias (en la figura, una pareja aparece en tonos rojos y otra pareja en tonos verdes). El 20% de la población lleva cromosomas tipo H2, originados por una inversión por recombinación entre las duplicaciones verdes. Como resultado de esa inversión, las duplicaciones rojas queden dispuestas en orientación directa (es decir, apuntando en el mismo sentido) en los cromosomas con la forma H2; por el contrario, en los cromosomas con la configuración H1 están en orientación invertida. Precisamente, un fenómeno de recombinación desigual entre repeticiones directas, como las duplicaciones segmentarias rojas del cromosoma con la configuración H2, puede originar la deleción de toda la región comprendida entre las repeticiones. En la parte inferior de la figura se muestra el resultado de dicho proceso, con un cromosoma que lleva una deleción de kb. Esta microdeleción elimina los genes que están en esa región, y se ha visto que hasta el 1% de los casos de retraso mental esporádico son portadores de esta microdeleción.

13 CAPÍTULO 5: BASES MOLECULARES DE ALTERACIONES CITOGENÉTICAS 13 Figura 5.11 muestra la estructura de 17q21.31 y la microdeleción que se origina en esta región.