ÁCIDOS NUCLEICOS. Síntesis de novo: Adenosina trifosfato (Purina) Uridina trifosfato. Pirimidinas. (inositato)

Transcripción

1 ÁCIDOS NUCLEICOS (Fosfo-ribosilpirofosfato) Adenosina trifosfato (Purina) Uridina trifosfato (Pirimidina) Síntesis de novo: Pirimidinas Purinas (inositato) Pirimidinas: ribosa incluida al final Purinas: el anillo crece sobre una estructura que contiene ribosa

2 REPLICACIÓN DEL ADN Generalidades Estructurales del ADN -Doble hélice de hebras antiparalelas -Bases hacia el interior, Ribosas y P hacia el exterior - A-T (2 ptes H) y G-C (3 ptes H) -3 tipos estructurales: A, B y Z

3 La doble hélice presenta un surco menor y un surco mayor según la cara expuesta hacia donde se disponen los azúcares o no, respectivamente - Importante por presentar grupos capaces de interaccionar con proteínas (por ej. Histonas) mediante puentes H.

4 Enzimas involucradas en la Replicación Helicasa - Separa ambas hebras de ADN - Cambios conformacionales de la enzima e hidrólisis de ATP desestabilizan la doble cadena. Horquilla de replicación ADN Polimerasa -Añade nucleótidos al extremo 3` (crece de 5`a 3`) -Necesita un cebador -La base correcta se determina por capacidad de formar puentes H -La polimerasa posee un dominio polimerasa y otro exonucleasa corrección de errores 5` 5` 3` 3`

5 Topoisomerasas A- topoisomerasa I: corta una hebra de ADN superenrollado. Relaja la tensión generada por superenrollamientos producidos por la separación de las hebras. B- Topoisomerasa II: introduce superenrollamientos, (ADN girasas) corta 2 hebras de ADN. Topoisomerasa I Topoisomerasa II

6 dnaa: proteína de iniciación - Reconoce el origen de la replicación y comienza el desenrrollamiento. - Reconoce secuencias específicas (Ej. locus ori C de E. coli) Eucariotas: múltiples orígenes de replicación (cél. Humanas: varios cientos por cromosoma) SSB - Proteína que reconoce y se une a hebras simples impide el reensamble de ambas hebras Primasa - ARN polimerasa que sintetiza el cebador 5-6 nucleótidos de ARN - El cebador es luego eliminado por un dominio exonucleasa de la ADN polimerasa. Ligasa - Responsable de la unión de fragmentos de Okazaki: trozos de ADN de la hebra retardada. - Cataliza uniones próximas OH-3`con P-5`.

7 Recombinación del ADN - Intercambio de material genético - incremento de la diversidad biológica - Intervienen las enzimas Recombinasas: ^ Intervienen 4 moléculas de enzima simultáneamente ^ Se genera una unión de Holliday entre 2 moléculas de ADN

8 TRANSCRIPCIÓN Y MADURACIÓN DEL ARN Transcripción: pasaje de la información contenida en ADN hacia ARN Enzimas y Procesos que intervienen en la Transcripción en Procariotas (E.Coli) ARN Polimerasa: - 4 subunidades: αββ`σ - σ : localización de secuencia promotora - αββ`: unidad catalitica núcleo de la enzima - Secuencias promotoras: 5-6 bases en posición 10 y 35 antes del punto de iniciación caracterización por footprinting - Capaz de desenrollar ambas hebras de ADN (17 bases) - Sin cebador - Burbuja de Transcripción : ARN-Pol, ADN molde y cadena ARN creciente. - Sin activ. exonucleasa mayor probabilidad de error - Señal de terminación: secuencia rica en GC con poli U al medio y al final de la misma. ARNm: no sufre modificaciones la traducción comienza mientras se va sintetizando. ARNr y ARNt: se modifican por hidrólisis de ciertas secuencias/trozos y por modificación de bases (pseudouridilato en ARNt)

9 Técnica de Footprinting Señal de Terminación

10 Eucariotas -Transcripción y Traducción separadas en espacio y tiempo - 3 tipos de ARN polimerasas según producto de síntesis y localización -ARNm: altamente modificado - Cofia 5` GTP y Metilación de ribosas - Cola poli (A) (extremo 3`) - Maduración: espliceosoma (corte y ensamblado) - Modificaciones post trascripcionales: cambios en la secuencia del ARNm - 1 gen varios ARNm varias proteínas } Proteoma más complejo que Genoma ARN polimerasa I: Nucleolo ARNr (sub. Mayor) ARN Polimerasa II: Nucleoplasma ARNm ARN Polimerasa III: Nucleoplasma ARNt y ARNr (sub. Menor)

11 BIOSINTESIS DE PROTEINAS TRADUCCIÓN: Secuencia de ARNm Secuencia de aminoácidos = Proteína CÓDIGO GENÉTICO: - Universal - 4 bases codifican para 20 aminoácidos (AA) - Secuencia 3 bases ARNm: codon 1 aminoácido (AA) - Los 2 primeros nucleótidos son imprescindibles. - Muy importante la identificación del nucleótido de inicio. - Frecuencia de error =<10-4 ESQUEMA GENERAL: ADN ARNm (lect. 5` a 3`) Proteinas (sínt. NH 2 a COO-) Transcripción Traducción - Ribosomas: ARNr y proteinas - ARNt, asociado a un aminoácido

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13 ARN DE TRANSFERENCIA: - Nexo entre ARNm y proteína - Específico para cada AA Estructura: - Estr. 2 ria en Hoja de trébol (mantenida evolutivamente) nucleótidos - Alg. bases son no comunes: Dihidrouridina, Inosina, - Nucleótidos apareados: dobles cadenas - Nucleót. no apareados: lazos (TψC, DHU, Anticodon) -Tallo aceptor: extr.3` no apareado (CCA) es el sitio de unión del AA. -Estr. tridimensional: L con el tallo aceptor y el anticodon enfrentados. - Teoría del balanceo (Ej: alanina: GCU, GCC, GCG y GCA)

14 ACTIVACIÓN DEL ARNt y AMINOACIL-ARNt-SINTETASA AA-ARNt-Sintetasa - Realiza la traducción prop. dicha - AA-ARNt: unión éster -2`o3`de la ribosa de la adenina del ARNt y COO- del AA: 1)- AA + ATP AA-AMP + PPi 2)- AA-AMP + ARNt + PPi AA-ARNt + AMP + 2 Pi Reacción general (1+2)- AA+ ATP + ARNt AA-ARNt + AMP + 2 Pi -La mayoría del ARNt esta unido a AA. -Prueba de Lectura: sitio activo (discrimina AA mayores) y sitio de prueba (elimina AA menores). - Reconoce secuencia del tallo aceptor y alg. veces también del anticodon.

15 RIBOSOMAS -Complejo supramolecular de ARNr y Proteínas - ARNr función catalítica principal y Proteínas función estructural. - Ribosoma (E.Coli): subs 30S y 50S 70S 30S: ARN 16S (1500 nucl.) y 21 prot 50S: ARN 5S y 23S y 33 prot. Eucariotas: 40S y 60S= 80S - Poseen 3 sitios de unión para ARNt: A, P y E

16 INICIACIÓN TRADUCCIÓN: 3 pasos: - Iniciación - Elongación - Terminación -Ensamble de ambas subs. del ribosoma, AA-ARNt de iniciación y ARNm. -Requiere un ARNt específico con Met (formil-met en Proc.) que reconoce el codon de iniciación AUG: Secuencia Shine-Dalgarno (Proc) o 1er AUG desde 5`-3` (Euc). - Eucariotas son monocistrónicos y Procariotas son policistrónicos: una moléc. ARNm más de una proteina. - 3 factores de Iniciación: IF3 e IF1 se unen a la sub 30S, IF2 (tipo de Prot. G) se une a GTP y permite la unión del AA-ARNt de inic. al sitio P de la sub.30s, posterior unión de sub 50S y liberación de factores

17 ELONGACIÓN -Comienza en el sitio P con el ARNt de inic. y el sitio A libre. -Intervienen 3 fact. de elongación: EF-Tu (tipo de Prot. G) que se une a GTP y a un AA-ARNt; EF-Ts cataliza el intercambio de GDP por GTP del EF-Tu. Finalmente el factor EF-G permite la translocación de los ARNt (desde los sitios A y P hacia P y E del ribosoma, resp.) con gasto de otro GTP. -El AA-ARNt se une al sitio A, une la Met de iniciación y de allí se mueve hacia el sitio P desplazando a la otra molec. de ARNt sin el AA hacia el sitio E Crecim. de la cadena polipeptídica. -Enlace peptídico: peptidil transferasa asociada a la sub 50S. -Interacción codon-anticodon determina el AA-ARNt a ocupar el sitio A. -El desplaz. del ARNt desde A a P desplaza al ribosoma a través del ARNm -El ARNm se lee de 5` a 3` y la sínt. de Prot. crece desde NH 2 a COO- EF-Tu-GTP-AA- ARNt

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19 TERMINACIÓN -Secuencia finalizadora del codon del ARNm: UAA, UAG, UGA - 3 fact. de terminación (Proc): RF1 (reconoce UAA, UAG), RF2 (reconoce UAA y UGA) y RF3 (tipo Prot. G) que une GTP y refuerza las uniones de uno de los otros fact. con el codon de ARNm. - El heterodímero altera la activ. de la peptidil transferasa: se hidrata el sitio donde actúa la enzima. - En Euc. hay un solo factor: RRF. RRF Liberación de RRF, de subunidades del ribosoma y de la cad. polipeptídica. ANTIBIÓTICOS: muchos actúan inhibiendo la sínt. de Proteínas

20 PRINCIPALES DIFERENCIAS ENTRE SINTESIS DE PROTEINAS EN EUCARIOTAS (E) Y PROCARIOTAS (P). 1- Tamaño de los ribosomas: E- 80S (40-60) P- 70S (30-50) 2- AA-ARNt iniciador: E- Met P- formil-met 3- Reconocimiento de la Iniciación:E- 1er AUG desde 5`-3`. P- Secuencia Shine-Dalgarno y AUG. 4- ARNm: E- monocistrónico P- policistrónico 5- Factores de Iniciación: E: varios (> de 3). P: Fact. de Terminación: E: 1. P: 3. COSTO ENERGÉTICO DE LA SÍNT. DE PROTEÍNAS Por cada AA incorporado a la cadena polipeptídica: 1 ATP 1 AMP + 1Pi +1Pi Activación ARNt (AA-ARNt-sintetasa) 1 GTP 1 GDP + 1 Pi..Iniciación (IF2) (1 x prot) 2 GTP 2 GDP + 2 Pi..Elongación (EF-Tu y EFg) 1 GTP 1 GDP + 1 Pi..Terminación (RF3) (1 x prot) ATP: formación de nuevos enlaces GTP: cambios conformacionales

21 MODIFICACIONES DE PROTEÍNAS: Cotraduccionales (prot. unidas al ribosoma, durante la traducción) o postraduccionales. - Desformilación - Glicosilación - Fosforilación - Acetilación - Carboxilación - Metilación - Hidroxilación - Acilación - Etc Glicosilación: unión covalente de uno o varios glicosilos. Se glucosilan proteínas que se van a secretar o son de membrana, y nunca se da en los procariotas. Co o Postraduccional. - favorecen o estabilizan la conformación final de la proteína extracelular o de membrana - aumentan la vida media de la proteína incrementando su estabilidad y su resistencia a la digestión por las proteasas. - aumentan la solubilidad en un medio acuoso - aportan las estructuras que van a reconocer algunos receptores (por ejemplo, los antígenos) Fosforilación Postraduccional Afecta OH de Ser, Thr y Tyr

22 Acetilación: Introduce un acetilo en grupo amino (Met y Lys) Carboxilación -En C beta de Asp o C gamma de Glu. -Carboxi-Asp o carboxi-glu: quelantes de Ca imprescindibles en la coagulación

23 Metilación - Extremo NH 2 de Lys o COO- de Glu. - SAM (S-Adenosil-Lmetionina: donador de metilos)

24 PROTEÍNAS ASOCIADAS A MEMBRANAS: Se sintetizan a través de ribosomas asociados a membranas: - Procariotas: Membr. Plasmática. - Eucariotas: Ret.Endoplásmico Ap.Golgi Vesículas de excreción. Ej. Síntesis de una proteína viral asociada a la membrana.

25 Ubiquitinización: marcado para su degradación En este proceso algunas de las proteínas celulares son covalentemente modificadas con otra pequeña proteína (peso molecular 11 kda) llamada SUMO (small ubiquitin-related modifier)

26 Proyecto proteoma humano Genoma constituido por ADN, es el conjunto de genes Transcriptoma - genes se transcriben en forma de ARN mensajero Proteoma -conjunto de todas las proteínas obtenidas directamente del ARNm o tras diversas transformaciones Metaboloma -conjunto de los diferentes metabolitos existentes, con diversas naturalezas químicas Genómica Proyecto Genoma Humano identificación y secuenciación de alrededor de genes Sin embargo, las proteínas son las verdaderas expresiones funcionales del genoma Dogma: 1 gen=1 proteína 1 gen =varias proteínas -mecanismos de maduración de ARN y modificación postraduccionales de las proteínas. -Relación entre número de proteínas y genes: 1-2 en bacterias 3 en levaduras 6-8 en Humanos (posiblemente) genes presentes y más de proteínas conocidas en la actualidad. PPH: desde abril del más de mil millones de dólares de financiación- Objetivos: creación de un Catálogo general de proteínas humanas (variantes posibles, interacciones entre proteínas y proteínas o entre proteínas y ácidos nucleicos, mecanismos de acción, etc.)

27 REGULACION DE LA EXPRESIÓN GÉNICA -Expresión génica: Proceso que abarca Transcripción y Traducción -Importancia de su regulación: - Diferente tipo de cél. en un mismo organismo (Eucariotas) - Adaptación a factores externos (Procariotas) -Puede regularse sobre la Transcripción o Traducción. -En general se obtiene por interacción proteina-adn. REGULACIÓN EN PROCARIOTAS -Policistrónico (cistrón= 1 gen o 1 proteína) -Proteínas Constitutivas o Proteínas Adaptativas o Inducibles. -β-galactosidasa de E.coli Inducible en presencia de Lactosa.

28 OPERON LAC -Operón: unidad de expresión para 2 o más proteínas. -Estructura: gen regulador-centro operador-genes estructurales. -LAC: gen regulador Prot. represora operador promotor 3 genes estructurales (β-galactosidasa, Permeasa y Transacetilasa) -Mecanismo muy común en Procariotas (E.coli: 19 operones)

29 PROTEÍNA ACTIVADORA DE CATABOLITOS (CAP) - Mecanismo activador - AMPc Complejo AMPc-CAP: se une a ADN y favorece la unión de ARN polimerasa y su transcripción. -Mejora la actividad del operón LAC, entre otros ( glucosa AMPc). -Prot. Dimérica

30 REGULACION EN EUCARIOTAS - Mayor complejidad: - Genoma mucho mayor. - Posee diferentes tipos celulares. -ADN asociado a Prot. Específicas: Histonas -Complejo ADN-Histonas Cromatina - Sin operones (prot que comparten una misma via son codificadas por genes distantes) - Transcripción y Traducción no están acopladas (en tiempo y espacio). - Nucleosoma: 145 pb ADN + octámero de histonas (2 moléc. de c/u: H2A, H2B, H3, H4). -Asociación entre nucleosomas: ADN conector (55 pb) + H1 -Histonas: cola aminoterminal hacia el exterior del nucleosoma esencial para procesos de regulación -Alta condensación del ADN: 2 niveles de enrollamiento (levógiro), a) ADN sobre nucleosoma y b) disposición en espiral de los nucleosomas. -Dimensiones: - Diámetro del nucleosoma: 100 Å - Ancho de la hél. de nucleosomas: 360 Å E. Coli: 4,6 Mb y prot. Saccharomices Cerevisiae (Eucariota sencillo): 17 Mb y prot. Humano: Mb y más de prot. -La asociación ADN-histonas no permite el acceso de otras proteínas al ADN ADNasas, ARN polimerasa, etc. nivel de regulación (Ej. GAL4). - Asi, la regulación en eucariotas esta regulada en general por interacciones proteína-proteína involucrando a varias de ellas control combinatorio.

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32 Receptores Hormonales Nucleares (RHN) (hormonas esteroideas) -Estrógenos: Alta hidrofobicidad atraviesan membranas celulares. -Se unen a RHN -Estos receptores regulan la expresión génica interactuando con ADN. -Tienen 3 sitios: unión del ligando (extr. COO-), reconocimiento de ADN, unión del coactivador o correpresor. - Ej. de ligandos: estradiol (agonista del rec de andrógenos, aumenta masa musc.) y tamoxifeno (antagonista rec de estrógenos, inhibe crecimiento anticancerígeno para tumores mamarios).

33 Los COACTIVADORES y CORREPRESORES: modulan la transcripción Modificando covalentemente la cola de las histonas. -Las histonas son ricas en lisina y arginina (cargas +) para su asociación con el ADN (cargas -). -Los coactivadores inducen la acetilación de las lisinas las cuales pierden su carga y el nucleosoma se relaja permitiendo la transcripción. - El ADN eucariota es inaccesible en su mayor parte para la transcripción.

34 REGULACION POST-TRANSCRIPCIONAL Procariotas: Ej. Operón TRP (Triptofano): el ADN codifica un ARNm con las sig. caract.: -Lleva información para la expresión de 5 prot. Involucradas en la síntesis del TRP. -ARNm: 5`-Promotor-Operador-secuencia Lider con un atenuador interno- genes estructurales (5)- 3`. -Secuencia del atenuador : 14 codones, AUG (inicio), 2 UGG (TRP) intermedios y UGA (señal de terminación). - TRP: el ribosoma avanza y se detiene en UGA sin llegar a los genes estructurales. - TRP: el ARNt-TRP no se forma, el ribosoma se detiene antes de UGA pero puede seguir luego la transcripción más adelante. -Sistema de regulación común en procariotas. 5` P O L E D C B A 3` atenuador AUG.. UGG UGG...UGA Inic Trp..Trp..Term

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36 Eucariotas: Regulación del metabolismo del Hierro -Fe: Necesario en Hemoglobina, citocromos, etc. -Su exceso genera radicales libres. - Metabolismo: Transferrina (transportador), Receptor de Transferrina y Ferritina (reserva). - Fe - Receptor y Ferritina (y viceversa) -ARNm que codifica Ferritina (A):. EstructuraIRE /elemento de resp. Al Fe) (ext.5`): secuencia horquilla. BP-IRE: prot. que reconoce IRE. Fe se une Fe a la BP-IRE libera el sitio IRE expresión de Ferritina. - ARNm de Receptor de Transferrina (B): - Varias IRE (ext. 3`) que estabilizan al ARNm. - Fe se une Fe a la BP-IRE libera sitios IRE se desestabilizan los ARNm. A B

37 - Definición: HORMONAS -Sustancia que es producida por una estructura, glándula, en una parte del organismo y que genera una respuesta en otra parte (Starling, 1900). - Cualquier sustancia que liberada por una célula actúa sobre otra célula cercana o lejana, sin importar la vía empleada para su transporte (Guillemin, 1950). - Función: el sistema endocrino, junto con el sist. nervioso son responsables de la integración del funcionamiento del organismo. - Clasificación: -Según el lugar de acción: Autócrina, Parácrina o Endocrina (actúan sobre la misma célula, cél. cercanas o tejidos distantes respect.) -Según su naturaleza química: Hidrofílicas o Hidrofóbicas, y Aminas (tiroideas), Proteicas (insulina) o Esteroideas (progesterona). - Modo de acción: - Hidrofílicas: se unen a receptores específicos en el exterior de la membrana celular. Esto dispara la síntesis de los llamados segundos mensajeros dentro de la célula. - Hidrofóbicas: cruzan la membrana plasmática y se unen a receptores específicos dentro de la célula efectora. El complejo hormona-receptor ejerce, luego, su efecto sobre la transcripción de genes específicos en el núcleo.