Universidad Nacional Autónoma de México

Transcripción

1 Universidad Nacional Autónoma de México Facultad de Química Curso Genética y Biología Molecular (1630) Licenciatura Químico Farmacéutico Biológico Dra. Herminia Loza Tavera Profesora Titular de Carrera Departamento de Bioquímica Lab 105, Edif E hlozat@unam.mx

2 VII. CÓDIGO GENÉTICO. TRADUCCIÓN Y PROCESAMIENTO Objetivo general DE PROTEÍNAS. El alumno conocerá el proceso de traducción de los mrnas basado en la universalidad del código genético y comprenderá su importancia dentro del contexto de la expresión genética, dado que la síntesis de proteínas es el paso final requerido para realizar la función del gen correspondiente. Comprenderá las diferencias de este proceso en organismos procariontes y eucariontes y su regulación.

3 Objetivos particulares 1. Código genético, universalidad, características y el trna como molécula adaptadora. 2. Componentes del aparato de traducción. El alumno Definirá el concepto de codón, clases de codones y su ubicación en la tabla del código genético 1.2. Interpretará al código genético como el conjunto de claves que identifican a cada aminoácido en el marco de su universalidad y degeneración Distinguirá la existencia de aminoácidos especiales como formil-metionina y selenocisteína y su relación con los codones que se han definido Explicará que el orden de los aminoácidos en una proteína lo define la secuencia de bases en cada gen y que el marco de lectura lo determina el codón de inicio de la traducción Examinará las funciones que desempeña el RNAt como molécula adaptadora entre el RNAm y las proteínas Definirá la hipótesis del bamboleo (Wobble) y su importancia Describirá a los ribosomas procariontes y eucariontes, sus componentes de RNA ribosomal y proteínas, sus características estructurales y propiedades físicas Nombrará la función propia de cada una de las subunidades ribosomales durante el proceso de traducción Definirá las características de los RNAm procariontes y eucariontes importantes para el proceso de traducción (secuencia Shine-Dalgarno en procariontes; cap, regiones no traducibles y cola de poli adeninas en eucariontes) Discutirá las diferencias entre los RNAt iniciadores en procariontes y eucariontes, así como distinguirá entre un RNAt iniciador y un RNAt elongador de la cadena polipeptídica Descubrirá el papel de las aminoacil trna sintetasas en la fidelidad de la traducción. Clasificará su actividad como el primer paso necesario para la traducción de RNAm a proteína. X X X X X X X X X X X Conocimiento Comprensión Aplicación

4 Objetivos particulares 3. El proceso de traducción 4. Regulación de la traducción El alumno Conocerá que la traducción se divide en tres etapas: iniciación, elongación y terminación, cada una de las cuales tiene requerimientos energéticos diferentes, factores de traducción accesorios e involucra componentes del aparato traduccional diferentes Nombrará los factores de inicio de traducción en procariontes y los pasos secuenciales que implica esta etapa Discutirá las diferencias entre el inicio de la traducción procarionte y eucarionte, basado en la temporalidad, localización y características propias de este proceso Nombrará los factores participantes en la elongación del polipéptido, la actividad peptidil transferasa del ribosoma y la importancia de la translocación coordinada de las subunidades ribosomales durante la traducción Nombrará los factores participantes en el reconocimiento de los codones de paro, la escisión del polipéptido sintetizado, y el reciclado de las subunidades ribosomales Ilustrará el efecto de los antibióticos sobre el aparato traduccional procarionte y eucarionte, su aplicación en la medicina y el estudio de la estructura y mecanismos del aparato traduccional Clasificará los diferentes niveles de regulación que requiere una traducción fidedigna Distinguirá las diferencias entre la traducción procarionte y eucarionte a nivel de temporalidad y localización respecto a la transcripción del mrna. X X X X X X X Conocimiento Comprensión Aplicación X

5 CÓDIGO GENÉTICO Y TRADUCCIÓN

6 1. Código genético: características a. Es universal b. Es de tripletes (codones)

7 Una secuencia de RNA tiene tres posibles marcos de lectura Sólo un marco es el correcto y se define por el codón de inicio AUG

8 c. El código genético es no-translapado d. El código genético es sin comas: la lectura de los tripletes se realiza de manera continua

9 e. El código genético es redundante: un aminoácido puede ser codificado por más de un codón 64 posibles combinaciones de tripletes sólo 20 aminoácidos Existen 61 codones que codifican aminoácidos Generalmente un aminoácido está codificado por codones con secuencias similares en la primera y segunda posición y 3 codones que no codifican aminoácidos, son señales de paro f. El código genético es degenerado ya que en muchos casos la tercer base del codón puede ser cambiada sin que cambie su significado a aminoácido

10 Organización del código genético

11 1. El trna como molécula adaptadora Aminoácido específico mrna XYZ Debe existir una molécula que sea capaz de reconocer un codón específico y que lo equipare a un aminoácido específico: un adaptador. Esta molécula debe reconocer al codón y reconocer al aminoácido.? Cuál es la molécula encargada de equiparar el código de nucleótidos al código de aminoácidos? El RNA de transferencia es el Adaptador Reconoce las bases de cada codón a través de su región anticodón. El reconocimiento del codón por el anticodón es por apareamiento W-C y con orientación antiparalela

12 trna Se encargan de llevar los aminoácidos a los ribosomas tienen una longitud de aproximadamente nucleótidos

13 Reconocimiento codón/anticodón: el bamboleo (wobble) Como el código genético está organizado para que los codones que codifican un mismo aa varíen en la tercera posición, un mismo trna puede reconocer a varios codones porque en su primera posición en el anticodón contiene un nt que puede aparearse con varios de los diferentes nt de los distintos codones.

14 Interacción codón-anticodón la 3ª posición puede no presentar apareamiento W-C (hipótesis del bamboleo ) las bacterias tienen 31 diferentes trna los eucariontes tienen 48

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16 2. Componentes del aparato de traducción El ribosoma Subunidad grande trnas 30 nm Subunidad pequeña

17 Ribosomas procariontes y eucariontes

18 El principal papel de las proteínas ribosomales es estabilizar a la estructura del rrna

19 El ribosoma: máquina molecular Ribosoma: 2 subunidades desiguales unidas débilmente, formadas por polímeros de alto peso molecular, de estructura compacta Traducción: lectura consecutiva de tripletes en el mrna que permiten síntesis concomitante de una cadena polipeptídica El ribosoma realiza 3 funciones: a) Función genética (decodificar la secuencia de nucleótidos en aminoácidos b) Función enzimática (catalizar la formación del enlace peptídico) c) Función de translocación (máquina que se mueve a lo largo del mrna, por la que van pasando los trnas y se alarga la cadena peptídica) Función genética subunidad pequeña Función enzimática subunidad grande Translocación ambas subunidades

20 3. El proceso de traducción La traducción se divide en cuatro etapas a. Activación del aminoácido o aminoacilación del trna b. Inicio c. Alargamiento d. Terminación

21 a. Aminoacilación del trna 1. Formación de aminoacil-adenilato 2. Síntesis de aminoacil-trna 1 ATP! Antes de su unión al trna el aminoácido debe ser activado. Esta activación se realiza por la unión de un ATP al aminoácido, por acción de una aminoacil trna sintetasa. Esto da lugar a un aminoacil adenilato (aminoacil AMP), el cual luego se une al 3 OH del trna correspondiente.

22 Especificidad de las aminoaciltrna sintetasas La fidelidad del código genético se sustenta en la actividad de las aminoacil trna sintetasas

23 Mecanismo de reacción de las aminoacil trna sintetasas

24 ...continuación Aminoacil trna sintetasas Clase I Aminoacil trna sintetasas Clase II

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26 Cómo está unido el aminoácido al trna? El carboxilo del aminoácido forma un enlace éster con el 3 OH de la ribosa del nucleótido de adenina localizada en el extremo 3 del trna Todos los trnas tienen la secuencia CCA en el extremo 3.

27 Enlace éster entre la adenina 3 del trna y el aminoácido

28 trna unido a una aminoacil trna sintetasa

29 En procariontes: la traducción sigue a la transcripción La proteína se sintetiza a partir del amino terminal

30 Comparación de las estructuras de los mrnas maduros de procariontes y eucariontes mrnas policistrónicos mrnas monocistrónicos Alberts et al., 3 rd ed., p.237

31 La traducción de las distintas regiones codificadoras de un mrna policistrónico puede iniciar independientemente

32 La síntesis de la proteína inicia en el extremo amino terminal

33 A: aceptor P: peptidil E: salida (exit) Sitios funcionales en el ribosoma Centro peptidil transferasa (PTC) Centro activador de GTPasa Centro decodificador

34 b. Inicio de la traducción subunidades del ribosoma mrna trna f-met factores de inicio GTP GTP

35 En procariontes, el reconocimiento del sitio de inicio de la traducción se basa en la interacción entre el rrna 16S y la secuencia Shine-Dalgarno localizada en el 5 UTR del mrna Presente en la región 5 del mrna, antes del codón de inicio de la traducción

36 El reconocimiento es por apareamiento de nucleótidos de forma complementaria y antiparalela Extremo 3 del rrna 16S mrna procarióntico con la secuencia consenso Shine- Dalgarno

37 En bacterias la selección del codón de inicio se realiza por interacción entre el mrna y el ribosoma Shine-Dalgarno 5 -AGGAGGU-3

38 Inicio de la traducción en procariontes

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40 Inicio de la traducción en 50S 30S [Mg 2+ ] procariontes + IF1 IF2 IF3 fmet AUG 3 2 GDP fmet AUG 1 GTP 3 Shine-Dalgarno 3 fmet fmet 2 3 GTP 1 GTP complejo de inicio de la traducción

41 Para el inicio de la traducción se requiere que: Las subunidades ribosomales estén separadas La subunidad pequeña reconozca al mrna en la secuencia Shine-Dalgarno El primer trna (fmet-trna) se coloque en la posición P de la subunidad ribosomal pequeña El anticodón del primer trna reconozca al codón de inicio (AUG) Participen varios factores de inicio de la traducción (IFs) Ocurre hidrólisis de al menos una molécula de GTP

42 Aminoácido con el que se inicia la traducción en procariontes

43 En procariontes existen dos trna de metionina, uno iniciador y otro alargador El fmet-trna iniciador tiene características especiales En la mitad de los casos, la metionina es removida de la proteína Reconoce los codones AUG ó GUG

44 Factores de inicio de la traducción en procariontes Factor Función IF1 Previene la unión de trnas en el sitio A de la subunidad 30S IF2 GTPasa que interacciona con 3 componentes claves durante iniciación: la subunidad 30S, IF1, y fmet-trna) IF3 Se une a la subunidad 30S y evita re-asociación con la subunidad 60S. Participa en el reconocimiento codón-anticodón f-met IF3 aa-trna IF1 IF: initiation factor 5 E P A 3

45 adición del 5 7 mgpppg (cap) terminación splicing poliadenilación exportación almacenaje En eucariontes, el procesamiento del mrna define su destino - Capping - Splicing - Poliadenilación nuclear - Exportación nuclear -Localización citoplasmática traducción degradación Traducción Almacenaje Degradación

46 En eucariontes, el mrna que se va a traducir es reconocido por el CAP ( 7 mgpppg) Otras modificaciones del CAP implican la metilación en los 2 OH de las ribosas de los dos primeros nucleótidos del mrna m 2,3,7 G en snrnp s Funciones: Protección (5 3 exonucleasa) Traducción Splicing Procesamiento

47 En el inicio de la traducción en eucariontes se forma un complejo circularizado entre los extremos 5 y 3 del mrna y proteínas específicas Formación del CAP binding complex eif4f es un heterotrímero que consiste de: eif4g que es una proteína de andamiaje eif4e que une al CAP eif4a que desenvuelve la estructura 5 (helicasa ) eif4g se une a otros dos factores: eif4b que estimula a la eif4a helicasa PABP que unen a la cola de polia (3 )

48 En eucariontes, eif2 GTP se une a trna-met El eif3 mantiene disociada a la subunidad ribosomal 40S eif2 GTP El eif2 + GTP une Met-tRNA al 40S Se forma el complejo 43S eif2 es una GPTasa eif2b es el factor que intercambia el GDP por GTP eif2 GDP eif2b intercambia GDP x GTP en eif2

49 Complejo mrna-43s Complejo 48S Posibles interacciones: eif4g une al eif3 mrna une al eif4g, Eif3 y a la subunidad ribosomal 40S Se forma el complejo 48S

50 El complejo 48S escanea la región 5 UTR hasta encontrar el primer AUG en contexto apropiado eif1 y eif1a permiten que se realice el escaneo eif5 induce hidrólisis de GTP por eif2 eif2 y eif3 son liberados eif5 media la unión de la subunidad ribosomal 60S eif4a: helicasa; utiliza ATP para deshacer estructura secundaria en el mrna y permitir el paso de la subunidad 40S.

51 Entorno del codón de inicio AUG En eucariontes, no hay una secuencia Shine- Dalgarno como en procariontes. El primer AUG que permita pausar el ribosoma debe tener un entorno adecuado. 5 CAP 40S C C A C C A U G G G consenso

52 Resumen del inicio de la traducción en eucariontes

53 La proteína eif4g es una proteína de andamiaje 2Apro PABP eif4e eif4a eif4a eif

54 c. Alargamiento En procariontes ribosoma mrna trnas-aa factores de alargamiento (elongation factors) GTP GTP x aa

55 Entrada del aminoacil trna Factores de alargamiento Bacteria EF-Tu EF-Ts EF-G Eucariontes eef-1 eef-1 eef-2 EF: elongation factor 1. Posicionamiento del aa-trna aa elongador correcto (EF-Tu/eEF-1 ) en el sitio A 2. Hidrólisis de GTP y cambio conformacional. Para regenerar EFTu GTP se requiere EF-Ts

56 El rrna 16S de la subunidad chica del ribosoma de procariontes interacciona con el codón y el anticodón permitiendo un reconocimiento correcto

57 La formación del enlace peptídico es por la actividad peptidil transferasa del rrna 23S En eucariontes es el rrna 28S 3. Ataque nucleofílico del amino del aa2 al carboxilo del aa1 formándose el enlace peptídico 4. Los dos aminoácidos unidos por un enlace peptídico están ahora en el trna que se encuentra en el sitio A

58 Translocación Bacteria EF-Tu EF-Ts EF-G Eucariontes eef-1 eef-1 eef-2 5. Entrada de EF-G/eEF-2 6. Hidrólisis de GTP 7. Cambio conformacional y desplazamiento del ribosoma 8. Sale el trna vacío que estaba en la posición P y el trna con el péptido naciente se mueve de la posición A, a la posición P 8. En la posición A se encuentra ahora el siguiente codón

59 Ciclos de alargamiento Se repiten los pasos del alargamiento las veces necesarias para leer todos los codones del mrna

60 d. Terminación ribosoma mrna factores de terminación GTP proteína subunidades ribosoma mrna trna libre

61 Factores de terminación Bacteria Eucariontes RF1 RF2 RF3 erf1 erf3 RF: release factor

62 erf1 utiliza agua para hidrolizar el péptido y liberarlo del ribosoma

63 Modelo de terminación en bacterias

64 Moléculas que unen el mismo sitio en el ribosoma

65 Gasto energético del proceso de traducción Se hidrolizan 2 GTPs por cada aminoácido incorporado La hidrólisis promueve cambios conformacionales Cargado de trna con su aminoácido 1 ATP /aa TRADUCCIÓN Iniciación Elongación Terminación 1 GTP (1er aminoácido) 2 GTPs /aa 1 GTP Cuántos GTPs y ATPs se requieren para la síntesis de una proteína de 300 aa?

66 Antibióticos inhibidores de la traducción Antibiótico/Toxina Organismo Función Tetraciclina Procarionte Sitio A subunidad 30S Cloramfenicol Procarionte Centro PTC subunidad 50S Puromicina Procarionte/Eucarionte Centro PTC subunidad 50S Eritromicina Procarionte Tunel de salida del péptido naciente Acido fusídico Procarionte EF-G Ricina Procarionte Modifica el RNA en el centro activador de GTPasa Toxina de difteria Eucarionte Modifica EF-1A Cicloheximida Eucarionte Translocación del ribosoma durante elongación

67 La puromicina inhibe la traducción porque se parece al aminoacil-trna

68 La kirromicina bloquea a EF-Tu El ácido fusídico bloquea a EF-G

69 Otros antibióticos...

70 Qué es lo que puede limitar la síntesis de proteínas en eucariontes? 1. Cantidad y eficiencia de mrnas (específica) 2. Abundancia de Ribosomas (global) 3. Actividad de la maquinaria traduccional (global o específica) 4. Velocidad de alargamiento (global o específica)

71 Elementos en el mrna eucarionte que regulan su destino Genome Biology 2002

72 Puntos de regulación del inicio de la traducción en eucariontes 1 Reconocimiento del mrna por el complejo 43S eif4e eif2 GTP eif2b eif4g PABP trna met 2 Formación del complejo ternario