M. Galvis*, D. Molina*, C. Ortiz** & R. Torres*

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1 Los Biocombustibles: hacia el Desarrollo Sostenible ESTUDIO DEL PROCESO DE FERMENTACION DE GLUCOSA PARA LA PRODUCCION DE BIOETANOL A PARTIR DE LEVADURAS NATIVAS. M. Galvis*, D. Molina*, C. Ortiz** & R. Torres* *Escuela de Química - Universidad Industrial de Santander. **Escuela de Bacteriología y Laboratorio Clínico Universidad Industrial de Santander Calle 9 Carrera 27. Ciudad Universitaria, Bucaramanga, Colombia. de correspondencia: dmolina@uis.edu.co Resumen: Se estudió el proceso de fermentación de glucosa para la producción de bioetanol utilizando levaduras nativas en un sistema por lote a escala de laboratorio. Las levaduras fueron aisladas a partir de bebidas típicas fermentadas en la región de Santander. Posteriormente, se realizó la selección del mejor microorganismo con base en la cinética de consumo de glucosa (determinada por el método del ácido 3,5 Dinitrosalicílico), la producción de biomasa (determinada por Turbidimetría y peso seco) y la concentración de etanol (cuantificado mediante Headspace-Cromatografía de gases). La cepa seleccionada produjo una concentración máxima de etanol de 5,16 % (v/v) y una productividad volumétrica de 2,6 g/l*h. Finalmente, con el objetivo de probar un medio de cultivo más económico, se realizó un ensayo preliminar utilizando un medio modificado. En este caso, se alcanzó una productividad volumétrica de 3,58 g/l*h. Todos los experimentos se realizaron en el Laboratorio de bioquímica e ingeniería de proteínas de la Universidad Industrial de Santander. Palabras Claves: Bioetanol, levaduras nativas, Productividad de etanol. Abstract: Glucose fermentation for bioethanol production was studied at laboratory scale using native yeasts in a batch mode system. The yeasts were isolated from typical fermented beverages available in the Santander region. Subsequently, the selection of the best organism was based on the kinetics of glucose consumption (determined by the 3,5-Dinitrosalysilic acid Method), biomass production (determined by Turbidity and dry cell weight) and ethanol concentration (quantified by Head-space Gas chromatography). The selected strain produced a maximum of ethanol concentration of 5.16% (v/v) and a volumetric productivity of 2.6 g / l h. Finally, to test a more economic growth medium, a preliminary experiment using a modified culture medium was carried out. In this case, a volumetric productivity of 3.58 g / l * h was obtained. All the experiments were performed at the laboratory of biochemistry and protein engineering from the Universidad Industrial de Santander. Keywords: Bioethanol, ethanol productivity, native yeasts. Universidad del Quindío - 9, 1 y 11 de septiembre Armenia, Colombia 1

2 Memorias del IV Simposio de Química Aplicada SIQUIA INTRODUCCIÓN Como consecuencia del desarrollo industrial y el crecimiento de la población existe un continuo incremento en el consumo de energía alrededor del mundo. Sin embargo las fuentes convencionales de energía como los combustibles fósiles no pueden satisfacer en su totalidad tal demanda energética, las cantidades de estas fuentes no renovables son limitadas y ejercen un impacto negativo en el medio ambiente. Por su parte el uso de los biocombustibles como nuevas alternativas de fuentes energéticas presenta muchas ventajas, contribuye a la reducción de emisiones de CO 2 al ambiente, reducen la dependencia a la importación de aceites y permite oportunidades de desarrollo a nivel rural. (Nikolic et al 29) El bioetanol es uno de los biocombustibles ampliamente usado, en mezclas con gasolina o como combustible. Además, es uno de los más prometedores a partir de fuentes renovables. La búsqueda en la producción del bioetanol por fermentación ha dado lugar a un incremento en el interés de encontrar biorrecursos alternativos o fuentes amiláceas que sirvan de materias primas para la producción de etanol. Por este motivo se han empleado productos como el maíz (USA), la caña de azúcar (en Brasil) y otras materias primas ricas en carbohidratos fermentables o que pueden llevarse a productos que pueden ser convertidos en azúcares fermentables. (Voca et al 29). El proceso de fermentación y la posterior producción de bioetanol requieren de microorganismos que efectúen el proceso de bioconversion. Los microorganismos más ampliamente utilizados para la fermentación alcohólica son las levaduras Saccharomyces cerevisiae. Estas levaduras tienen la capacidad para crecer en condiciones anaerobias y son capaces de fermentar azúcares. Otras levaduras como Schizosaccharomyces pombe presentan algunas ventajas adicionales de alta tolerancia osmótica. Por su parte bacterias como Zymomonas mobilis pueden dar lugar a altas concentraciones de etanol pero también pueden producir sustratos no deseables como el sorbitol los cuales reducen la eficiencia de la conversión de sucrosa a etanol. (Fukuda et al 29) El objetivo de este estudio era realizar una selección de la mejor levadura, a partir de aislamientos nativos en un medio de cultivo que utiliza la glucosa como azúcar fermentable. El trabajo se plantea como una contribución a la línea de investigación en biotecnología, que abarca la producción de bioetanol a partir del almidón de yuca en la que se emplean materias primas no aptas para el consumo humano, provenientes de la región de Santander. Puesto que los microorganismos fermentadores tradicionales, han sido trabajados principalmente sobre fuentes amiláceas diferentes a la yuca. En el presente proyecto las levaduras a emplear fueron aisladas a partir de bebidas típicas de fermentación. Universidad del Quindío - 9, 1 y 11 de septiembre Armenia, Colombia 2

3 2. MATERIALES Y MÉTODOS 2.1. Microorganismos nativos Los Biocombustibles: hacia el Desarrollo Sostenible Los microorganismos fueron aislados a partir de bebidas típicas de fermentación de manzana, caña y panela. También fue estudiada la capacidad fermentativa de una levadura proveniente del bagazo de fique. Los microorganismos fueron inicialmente cultivados en cajas de Petri que contenían glucosa (2g/l), extracto de levadura (1g/l), peptona (1g/l) y agar (15 g/l), a una temperatura de 37 C, durante 36 horas. Posteriormente eran almacenados a 4 C y mantenidos por subcultivo semanalmente Preparación del inóculo Los diferentes asilamientos fueron sembrados por agotamiento sobre un medio YPG (glucosa extracto de levadura y peptona) en condiciones microaerófilas a 37 C durante 36 horas. Algunas de las colonias formadas fueron transferidas a tubos de ensayo para inocular un medio que contenía medio de fermentación enriquecido con extracto de levadura peptona y glucosa. Los cultivos fueron incubados a 37 C por 12 horas. El ph inicial del medio fue 6.7. Este sirvió como cultivo inicial para la producción de bioetanol Medio de fermentación La fermentación fue llevada a cabo en Erlenmeyer de 3 ml con un contenido de 13 ml del medio previamente esterilizado, el cual se inoculó al (1 % (v/w)) del cultivo inicial (descrito en 2.2). Los cultivos se incubaron a 32 C bajo agitación controlada de 13 rpm, durante 4 horas. Todos los experimentos fueron realizados por duplicado Técnicas analíticas A intervalos de tiempo apropiados fueron removidos del sistema de fermentación 2 ml de muestra para determinación de biomasa, glucosa y etanol Determinación del contenido de Biomasa. La producción de biomasa fue determinada por Turbidimetría en relación con el peso seco efectuando la medida de la dispersión de la luz a 65 nm en un SPECTRONIC 2 GENESYS. La interpolación de los datos de absorbancia se hizo en una curva patrón previamente obtenida Determinación del contenido de Glucosa. La determinación de glucosa se hizo utilizando el método del ácido 3,5 dinitrosalicílico para azúcares reductores (Miller 1959). Se elaboró una curva patrón en las que se midió la absorbancia de concentraciones conocidas de glucosa a una longitud de onda de 54 nm Determinación de contenido de etanol. El etanol fue cuantificado por headspace-cromatografía de gases (HS-GC) Los datos fueron obtenidos a partir de una curva de calibración elaborada con soluciones de etanol de concentración conocida, en las mismas condiciones de operación que la muestra de interés (Hailong Li et al 29). Se utilizó un cromatógrafo de gases Hewlett Packard modelo 589 bajo las condiciones de operación propuestas por la Escuela Nacional de Cromatografía de la Facultad de Ciencias de la Universidad industrial de Santander. Universidad del Quindío - 9, 1 y 11 de septiembre Armenia, Colombia 3

4 3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN Aislamiento de levaduras productoras de bioetanol. A partir de microorganismos aislados de bebidas fermentadas de manzana, caña, panela y bagazo de fique se obtuvieron cuatro levaduras que presentaban características micro y macroscópicas correspondientes con las levaduras similares al tamaño color y forma de una cepa patrón Selección del microorganismo/ aislamiento mayor productor de bioetanol. Se estudió la producción de bioetanol por levaduras nativas aisladas a partir de bebidas típicas de fermentación usando como sustrato glucosa. Se encontró que la levadura proveniente del aislamiento de caña presenta una mayor productividad de etanol hasta las 25 horas, 2.6 g/l*h. Un medio rico en nutrientes como el seleccionado, permite que los microorganismos tengan excelentes fuentes para sus procesos bioquimicos. Es así como los aislamientos de estudio tienden a producir grandes cantidades de biomasa. Fueron elaboradas cinéticas de crecimiento para las levaduras aisladas a partir de bebidas fermentadas de manzana, caña, panela y la levadura proveniente del bagazo de fique. La levadura obtenida a partir de caña fermentada presentó la mayor producción de biomasa alcanzando 5,1861 g/l a las 25 horas de fermentación De forma similar se elaboró una cinética de producción de etanol en la que la levadura proveniente de la bebida fermentada de caña presenta las mayores concentraciones de etanol. Se alcanzaron concentraciones de etanol de alrededor de los 5 g/l a las 25 horas de fermentación. Por su parte la levadura asilada del bagazo de fique puede alcanzar una concentración de etanol próxima a la dada por la levadura de caña pero en un tiempo superior. Tabla 1. Parámetros de rendimiento de etanol. Yx/s Yp/s Yp/x Qp MANZANA,287, ,1557 1,543 CAÑA,535,5396 1,957 2,649 GUARAPO,372,351 9,4324 1,516 FIQUE,524,4862 9,2832 1,6922 La Tabla 1, presenta los parámetros de rendimiento obtenidos para las cuatro levaduras evaluadas. Los parámetros cinéticos de producción muestran que el microorganismo que permite la mayor productividad de etanol es la levadura aislada de la bebida de fermentación de la caña, mientras que la productividad de los aislamientos de manzana y guarapo es similar y más baja que la de caña de azúcar. De acuerdo con la literatura, los resultados son promisorios, teniendo en cuenta que otros investigadores han mostrado productividades de etanol comparables con los obtenidos. En estudios realizados por Sventlana Nikolíc y sus colaboradores en el año 29, utilizando células inmovilizadas de Sacchromyces cerevisiae obtuvieron una productividad volumétrica de 1.96 g/l*h después de 48 horas en un proceso de sacarificación y fermentación simultanea.

5 Los Biocombustibles: hacia el Desarrollo Sostenible Por su parte Ramasamy Amutha & Paramasamy Gunasekaran en el 21, al emplear células libres de Saccharomyces diastaticus y Z. mobilis sobre almidón licuado como sustrato obtuvieron una productividad volumétrica máxima de,95 g/l*h durante un tiempo de fermentación de 42 horas. En la figura 1, se presenta la cinética de crecimiento, consumo de glucosa y producción de etanol durante la fermentación realizada a ph inicial 6.5, 32 C, 13 rpm. CINÉTICA DE FERMENTACIÓN Etanol(g/l)-Biomasa(g/l) Tiempo(h),12,1,8,6,4,2 Glucosa(Kg/l) Biomasa(g/l) Etanol(g/l) Glucosa(g/l) Figura 1.Cinética de fermentación. Aislamiento de caña. Condiciones del proceso: ph 6.5, 32 C, 13 rpm, concentración del inóculo 1 %(v/v) 3.4. Estudio preliminar de la cinética de producción de etanol en medio de cultivo modificado. Fueron estudiados dos medios de cultivo para la producción de etanol, utilizando la levadura previamente seleccionada. El medio 1 corresponde con el medio que se venía utilizando durante la selección de la mejor cepa productora de etanol. El medio 2, había sido modificado no contenía peptona. Los resultados obtenidos se resumen en la tabla 2. Tabla 2. Parámetros cinéticos de producción de etanol obtenidos en estudio preliminar de medios de cultivo. Yx/s Yp/s Yp/x Qp MEDIO 1,535,5396 1,957 2,649 MEDIO 2,246,588 23,5659 3,5871 El medio 2 presenta en todos los casos los mejores parámetros de rendimiento, siendo superior la productividad volumétrica de etanol a las 25 horas. Esto indica que la deficiencia de peptona en el medio de fermentación no limita al microorganismo en sus procesos bioquímicos específicamente en la producción de etanol. Además, puesto que el extracto de levadura es entre Universidad del Quindío - 9, 1 y 11 de septiembre Armenia, Colombia 5

6 otros, una fuente de sales inorgánicas, vitaminas y aminoácidos, su adición estaría liberando a la célula de la síntesis de aminoácidos permitiendo una mayor disponibilidad del sustrato para la producción del etanol (Mejías 199). CINÉTICA DE FERMENTACIÓN Etanol(g/l)-Biomasa(g/l) Tiempo(h),16,14,12,1,8,6,4,2 Glucosa(Kg/l) Biomasa(g/l) Etanol(g/l) Glucosa(g/l) Figura 2. Cinética de fermentación. Aislamiento de caña. Condiciones del proceso ph 6.7, 32 C, 13 rpm, concentración del inóculo 1 %(v/v). La figura 2, presenta el perfil cinético en los parámetros de producción de etanol y biomasa así como el consumo de glucosa en el tiempo por la levadura nativa seleccionada en un medio de cultivo en ausencia de peptona. La levadura nativa seleccionada puede alcanzar a sus 23 horas de tiempo de fermentación cerca del 8.2 %, aunque después de este tiempo se observa una disminución en la producción de etanol. 4. CONCLUSIONES En el estudio de la fermentación en cultivos por lotes a nivel de laboratorio se encontró que la levadura nativa que permite la mayor producción de etanol en el tiempo era la proveniente del aislamiento de caña de cultivos propios de la región de Santander. El extracto de levadura suple con los nutrientes requeridos y necesarios para que la levadura seleccionada ejerza con eficiencia sus procesos bioquimicos y producción de etanol. 5. BIBLIOGRAFÍA Hideki Fukuda, Akihiko Kondo, Sriappareddy Tamalampudi. Bioenergy: Sustainable fuels from biomass by yeast and fungal whole-cell biocatalysts. 28. Hailong li, xin Cheng chaiyulin deng, huaiyu zhan, shiyu fu. rapid determination of ethanol in fermentation liquor by full evaporation headspace gas chromatography.28

7 Los Biocombustibles: hacia el Desarrollo Sostenible Mejías Gladys M. Estudio de la fermentación alcohólica en sistemas discontinuos. Tesis. Universidad católica de Valparaíso.199. Neven Voca, Boris Varga, Tajana Kricka,Dusca Curic, Vanja Jurisic, Ana matin. Progress in etanol production from corn kernel by applying cooking pre-treatment. 29. Ramasamy Amutha, Paramasamy Gunasekaran. Production of ethanol from liquefied cassava starch using Co-inmobilized cells of Zymomonas mobilis and Saccharomyces diastaticus. 21 Svetlana Nikkolic, Ljiljana Mojovic, Marica Rakin, Dusanka Pejin. Bioetanol production form corn meal by simultaneous enzymatic saccharification and fermentation with immobilized cell of Saccharomyces cerevisiae var. elipsoideus AGRADECIMIENTOS Al Ministerio de Agricultura y Desarrollo Rural de Colombia por su apoyo económico para el desarrollo de esta investigación (Proyecto No 27D ). Universidad del Quindío - 9, 1 y 11 de septiembre Armenia, Colombia 7