TRABAJO PRACTICO N 4 SISTEMA REPRODUCTOR INTRODUCCION OBJETIVOS DEL TRABAJO PRACTICO

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1 TRABAJO PRACTICO N4 SISTEMA REPRODUCTOR INTRODUCCION Las hormonas sexuales en los vertebrados (esteroides derivados del colesterol) incluyen los estrógenos (predominantes en las hembras), los andrógenos (predominantes en los machos) y la progesterona. La producción y secreción de estos esteroides, gonadales, esta bajo control de la hormona folículo estimulante (FSH) y la hormona luteinizante (LH), liberadas por la adenohipófisis en respuesta a Gn-RH (hormona hipotalámica liberadora de gonadotrofinas). A su vez, la secreción de las gonadotrofinas hipofisarias está modulada por la retroalimentación de las hormonas gonadales. Los mecanismos neuroendocrinos desempeñan un papel importante en la regulación del ciclo sexual y reproductivo. Las interacciones entre las gonadotrofinas y los esteroides proporcionan la base de la periodicidad o ritmicidad sexual que es muy acentuada en la hembra de los mamíferos. En el caso de la hembra de la mayoría de los mamíferos, el ciclo reproductivo (estral) a nivel del ovario y del útero, consiste en 3 fases fundamentales: 1. fase folicular (ovario) o fase proliferativa (útero), 2. Ovulación (ovario), 3. fase lútea (ovario) o fase secretora (útero). La duración de estas fases del ciclo varía en los distintos grupos de mamíferos. Este ciclo estral está basado en las relaciones endocrinas y niveles de concentración de gonadotrofinas y hormonas ováricas. El ciclo estral en la rata-ratón de laboratorio se estudia mediante un frotis vaginal, que se caracteriza por cantidades relativas y específicas de distintos tipos celulares del epitelio vaginal. El ciclo en estos roedores se repite cada 4 o 5 días y consiste en los siguientes estados: diestro (fase luteolítica y de crecimiento folicular), proestro (fase de maduración folicular y preovulatoria), estro (ovulación) y metaestro (fase luteogénica). En el diestro de la rata-ratón los niveles hormonales permanecen bajos durante la mayor parte de dicho estado, solo ocurre un gradual incremento de estrógenos, liberados por el folículo ovárico en desarrollo. En el proestro se produce un pico de FSH y LH debido al aumento significativo de estrógenos. En el estro se desencadena la ovulación y los niveles de LH y estrógenos bajan a sus niveles mínimos basales. En el metaestro (fase lútea temprana) comienza a detectarse un aumento en los niveles de progesterona (producida por el cuerpo lúteo). OBJETIVOS DEL TRABAJO PRACTICO Conocer el ciclo estral de mamíferos. Observar e interpretar las diferentes fases del ciclo estral. Correlacionar la fase del ciclo estral de cada hembra con las características morfológicas del útero y del ovario.

2 MATERIALES A UTILIZAR Instrumental de cirugía, portaobjetos con cubre, pipetas Pasteur de plástico, tips amarillos, solución fisiológica, alcohol, algodón, papel metálico, azul de metileno, pinzas, guantes descartables, batería de tinción, balanzas. Ratonas adultas (60 días de edad). DISEÑO EXPERIMENTAL Y METODOLOGIAS Se utilizarán ratonas de la línea CF1 criadas en diferentes jaulas con el fin de obtener animales en las distintas fases del ciclo estral. Cada turno recibirá 4 jaulas con 4 animales en cada una. Cada grupo de alumnos utilizará dos ratonas de jaulas diferentes. Se sacrificarán los animales en cámara de CO 2 o por dislocación cervical. CICLO ESTRAL Se determinará el ciclo estral del ratón utilizando la técnica de citología vaginal exfoliativa con posterior coloración por la Técnica de Papanicolaou (modificada por Iodice y col., 1988) y por tinción directa con Azul de metileno (AzM). El procedimiento a seguir será: Sujeción del ratón Toma de la muestra mediante lavado vaginal Extendido del material obtenido sobre portaobjeto limpio y desengrasado (preparar 2 portaobjetos x ratón) A un portaobjeto colocarle una gota de AzM y dejar secar (tinción alternativa). Al segundo portaobjeto colocarlo durante 1 minuto en Metanol (fijación de las células). Luego, se procederá a colorear las células fijadas mediante la técnica descripta a continuación: Técnica de tinción para frotis vaginal 1. Pasaje por alcohol 50 (1 min.) 2. Lavado con agua destilada (1 min.) 3. Coloración con hematoxilina (8 min.) (Carazzi) 4. Lavado con agua corriente (enjuague) 5. Pasaje por agua destilada (enjuague) 6. Pasaje por Fucsina (30 segundos) 7. Lavado con agua destilada (enjuague) 8. Pasaje por alcohol 70 (enjuague) 9. Pasaje por alcohol 96 (enjuague) 10. Pasaje por alcohol 100 (enjuague) 11. Dejar secar al aire 12. Observación al microscopio de todos los preparados (4 portaobjetos en total, 2 por cada ratón)

3 - Lectura, interpretación y cuantificación de las observaciones. - Observar los extendidos bajo microscopio con aumento 40X. Análisis cualitativo Identificar los siguientes tipos celulares según sus características morfológicas y su tinción: Células parabasales Células intermedias Células superficiales Células superficiales queratinizadas Leucocitos (neutrófilos, linfocitos, etc.) Caracterización del estado o fase del ciclo estral Para establecer en qué fase del ciclo está la hembra de ratón, se estimará la fase del ciclo estral del animal tomando en cuenta las proporciones relativas aproximadas de los tipos celulares hallados. Para ello, se contarán los diferentes tipos celulares y se establecerán sus proporciones relativas, contando alrededor de 30 células en diferentes campos del frotis vaginal. En el frotis es común encontrar leucocitos; de ser así, en las tablas indicar presencia o ausencia, anotando la cantidad relativa como muchos o pocos, pero no contarlos. Tabla del grupo Expresar el recuento del número de cada tipo de células como sobre un total de células contadas (30) y determinar, en base a esos porcentajes, la fase del ciclo estral. Número de jaula 1 a 4 Parabasales Intermedias Superficiales Queratinizadas (*) Pueden ser estados intermedios, como metaestro-diestro. Leucocitos (muchos/pocos) Fase del ciclo (*) Tabla general de datos de las fases del ciclo por jaula Una vez determinada la fase del ciclo de cada animal, se anotará el número total de ratones (de cada jaula) que se encuentra en cada fase, en la siguiente tabla. Expresar los resultados como de ratones que se encuentran en cada fase del ciclo x jaula. Número de jaula Proestro Estro Metaestro Diestro Otros (*) 1 a 4 (*) Pueden ser estados intermedios, como metaestro-diestro.

4 CARACTERÍSTICAS DEL ÚTERO Colocar el animal en decúbito dorsal. Realizar diéresis de la piel por la línea media ventral con tijera. Realizar diéresis de la pared muscular subyacente por la línea alba (media) con tijera. Reconocer el tracto reproductivo dentro de la cavidad abdominal e identificar los distintos órganos que lo componen (ovario, oviducto, útero, cérvix). Disectar todo el tracto genital en cápsula de Petri (con solución fisiológica SF) y separar el útero en su totalidad, extrayendo oviductos, ovarios, cérvix y tejido graso. Colocar los cuernos uterinos sobre papel metálico y pesar (expresar en mg). Colocar los cuernos uterinos en la cápsula de Petri (con SF) para observarlos macroscópicamente y bajo lupa. Análisis cualitativo: describir el aspecto, en cuanto a coloración, volumen o cualquier característica externa observada. Análisis cuantitativo: completar la siguiente Tabla Número de jaula Peso útero (g) Peso corporal (g) IUS (*) Fase del ciclo (*): Calcular el índice útero-somático (IUS) como: (g peso útero (g) / peso corporal (g)) * 100 Se recogerán los datos de todos lo animales y se agruparán en una tabla general, clasificándolos por fase del ciclo. CARACTERÍSTICAS DEL OVARIO Colocar el ovario en una cápsula de Petri con solución fisiológica, observar y distinguir bajo lupa: - folículos - cuerpos lúteos (si hay, contarlos)

5 INFORME Hipótesis y Objetivo/s: mencionar brevemente Metodologías y Procedimientos: Explicación breve de los procedimientos realizados. Resultados Análisis del ciclo estral: Realizar esquemas de los distintos tipos celulares observados. Expresar los resultados en forma de gráficos de barras, en función del número de la jaula. Analizar si existe alguna relación entre el número de jaula y la fase del ciclo. Análisis uterino: Describir las características de los úteros observados. Analizar los datos agrupados en la tabla general (Fase del ciclo vs. IUS). Discusión y Conclusiones Interpretar los resultados y discutirlos en forma interrelacionada, analizando el estado del ciclo con lo observado en útero y ovarios. Según el estado del ciclo, relacionar con el estado hormonal o endocrino que tendría cada grupo de animales. Enunciar brevemente las conclusiones obtenidas.