Adroer Martori N. y Coletas Seuba J (Adiquímica S.A.), García Estéban T. y Pelaz Antolín C. (Laboratorio de Legionella, Centro Nacional de Microbiología, Instituto de Salud Carlos III, Majadahonda, Madrid ) Congreso Nacional de Sanidad Ambiental, Toledo, 15-17 Junio 2005 I La legionelosis se produce cuando individuos susceptibles inhalan aerosoles contaminados con la bacteria procedentes de una instalación colonizada. Las torres de refrigeración se han asociado con casos, y en ocasiones con brotes de gran magnitud, en España y en otros lugares del mundo (Boletín CAM 1997, Castellani-Pastoris y cols 1997, García Fulgueiras 2003). Desde la publicación del Real Decreto 865/2003 de prevención de legionelosis planes de mantenimiento son de obligado cumplimiento para las instalaciones con capacidad de propagar la bacteria y producir enfermedad. Una variedad de productos biocidas están siendo aplicados en los tratamientos de desinfección de torres de refrigeración, sin embargo, hay pocos estudios en los que se evalúe la eficacia y efectividad de los mismos.!" El principal objetivo fué evaluar la eficacia (in vitro) y la efectividad (en campo) del desinfectante Adiclene 1352 y analizar distintos parámetros recogidos en el RD865/2003 en una torre de refrigeración, durante casi dos años. Con el trabajo in vitro se pretende conocer la actividad del desinfectante frente a 5 cepas de Legionella pneumophila serogrupo 1, utilizando las dosis y tiempos de contacto recomendados en los tratamientos de choque y continuo, el recuento de bacterias a distintos tiempos durante 2 meses, y si se recupera la bacteria tras una estimulación mediante incubación de las alícuotas en medio líquido. Con el trabajo de campo se pretende conocer la evolución de una torre de refrigeración en cuyos planes de mantenimiento se incluye la utilización del desinfectante Adiclene 1352, a lo largo de casi 2 años.
# # $ %!" Cepas: Se estudiaron 5 cepas de Legionella pneumophila serogrupo 1 para comprobar su supervivencia en presencia del biocida: La cepa tipo (Philadelphia ATCC nº33152) y 2 pares de cepas recuperadas de instalaciones asociadas a casos. Cada pareja corresponde a 2 cepas recuperadas en distintos años de una misma instalación (hospital y barco) sometida a sucesivas hipercloraciones. Desinfectante: Cloruro de tributil tetradecil fosfonio (ADICLENE 1352), una sal de fosfonio cuaternario (QUAT) incluida en el Registro de Plaguicidas del Ministerio de Sanidad y Consumo para el tratamiento de torres de refrigeración. Plan de trabajo: Para cada cepa, se preparó 1L de una suspensión bacteriana de (1-3) x 108 ufc/ml. Dicha suspensión se trató con dos concentraciones diferentes del desinfectante a) La recomendada por el fabricante para tratamientos de instalaciones en continuo (80 ppm de QUAT), manteniendo dicha dosis durante 2 meses. b) La aconsejada para tratamientos de choque (150 ppm de QUAT durante 4 horas), eliminando después el desinfectante mediante lavado. Cada ensayo incluyó un control sin desinfectante. Las suspensiones resultantes se incubaron a 30 oc durante 2 meses. Se tomaron alícuotas (10 ml) a distintos tiempos: 0h, 2días, 4d, 7d, 28d y 2 meses y, mediante recuento de colonias en medio sólido (MWY), se determinó la supervivencia de la bacteria tras el contacto con el biocida. Además, cada alícuota recogida en el ensayo anterior se centrifugó a 4.000 rpm durante 20 minutos, tras los cuales se estimuló el crecimiento de Legionella mediante siembra del sedimento en medio líquido (BYE) incubándose durante 14 días a 30ºC. Se sembraron alícuotas (100 ml) a distintos tiempos: 0h, 1d, 2d, 4d, 7d y 14 días y, mediante recuento de colonias, se determinó el efecto del desinfectante (bactericida o bacteriostático), y si el contacto con el mismo modificó la capacidad de crecimiento en BYE de las bacterias supervivientes a los tratamientos. %!" Características de la torre de refrigeración: Instalación ubicada en la provincia de Barcelona, con agua de aporte proveniente de la red de distribución municipal. El agua se somete a un tratamiento previo de ablandamiento antes de su aporte a la torre. Esta torre de refrigeración se utiliza para refrigerar unos hornos de tratamiento térmico de tubos metálicos. Tipo de torre: de tiro inducido (Baltogar). Volumen circuito: 20 m3. El agua enfriada en la torre se acumula en un depósito, del cual aspiran las bombas de impulsión para la refrigeración de los hornos. Funcionamiento: continuo, con paros de fin de semana, Navidad (2 semanas) y Agosto (3 semanas). Fecha notificación al ayuntamiento: 26/06/2001. Revisiones: Se controlan una vez al mes las condiciones operativas de la torre de refrigeración, se revisa la instalación y su estado de conservación, y se toma muestra del agua para analizar los siguientes parámetros: ph, conductividad, temperatura, hierro total, turbidez, aerobios totales, y concentración de desinfectante. Se revisan periódicamente: separador de gotas, relleno y bandeja, y trimestralmente, se toma muestra para analizar presencia de Legionella, siguiendo los requisitos descritos en el Anexo 4A del RD865/2003. Programa de mantenimiento y desinfección: Tratamiento de mantenimiento: anticorrosivo/antiincrustante a 200 ppm según aporte, y Adiclene 1352 a dosis de choque diaria de 50 ppm. Concentración de desinfectante adecuada de actuación: 80-100 ppm. Concentración residual mínima de desinfectante: 40 ppm. Limpieza y desinfección preventivas: 2 al año (8/2003, 2/2004, 8/2004 y 12/2004), según Anexo 4 B del RD865/2003. &' La Tabla 1 detalla, de izquierda a derecha los recuentos bacterianos obtenidos para las 5 cepas de L pneumophila SG 1, tras la aplicación de cada tipo de tratamiento, en los distintos tiempos muestreados, y de arriba hacia abajo los recuentos obtenidos tras la estimulación en BYE de cada alícuota muestreada, expresando los recuentos en Log (ufc/ml). Las Figuras 1 refleja los recuentos leídos de izda a dcha en la Tabla 1 y la Figura 2 los recuentos leídos de arriba abajo, para la cepa tipo del ATCC.
%!() ')*), ()!&$"*+!"#$ $&$&'!"#$%!&' -. -. *-. *-. Contajes inferiores a 2 Log (100 ufc/ml) se expresan como recuento negativo (¾). C es el recuento inicial para cada ensayo (tiempo 0h). 3h, 2d, 4d, 7d, 28d, 2m son los tiempos de muestreo durante el tiempo de contacto con el desinfectante, según el tipo de tratamiento. La supervivencia de la bacteria en agua dura, durante 2 meses, se detalla en horizontal para los valores de 0d en BYE. Figura 1. Supervivencia de L. pneumophila (ATCC) durante 2 meses: (C) en ausencia de tratamiento, (T) durante un tratamiento continuo con 80 ppm de ADICLENE 1352 y (T ) después de un tratamiento de choque con 150 ppm de ADICLENE 1352 durante 4h Figura 2. Comparación del crecimiento en BYE durante 14 días, de L. pneumophila (ATCC): (C) sin tratar y (T ) tratada EN CHOQUE con 150 ppm de ADICLENE 1352 durante 4h. Los aislados comparados se recuperaron a los 7d (C7, T 7) de los 2 meses de ensayo. Log ufc/ml 9 8 7 8,6 8,45 8,4 8,3 Log ufc/ml 11 10 9 8 8,96 9,6 9,3 9,25 9 6 5 4 C T T ' 7 6 5 4 3,88 3,5 3,2 C 7 T' 7 3 3 2 <2 <2 2 0 d 4 h 2 d 4 d 7 d 28 d 2 m Tiempo (h) 2 <2 0 d 1 d 2 d 4 d 7d 14 d Tiempo (h)
Los tratamientos (en continuo o en choque) con el desinfectante ADICLENE 1352 eliminaron definitivamente todas las cepas de Legionella, ya que tras dos meses de ensayo, no se recuperó la bacteria ni por recuento en placa ni tras su incubación en BYE. Sin embargo, en algunos muestreos con aparente ausencia de Legionella, se recuperó nuevamente la bacteria cuando se estimuló su crecimiento en BYE, evidenciando la presencia de la bacteria, aunque su bajo número impidiera su aislamiento por cultivo. Según la cepa estudiada, el tratamiento en continuo (80 ppm durante 2 meses) se mostró igual (cepa del hospital) o más eficaz (cepa estándar o cepa recuperada del barco) que el tratamiento de choque (150 ppm durante 4 horas). Para los dos tipos de tratamientos ensayados (en continuo y en choque), en los dos sistemas de agua estudiados (hospital y barco) la sensibilidad del aislado recuperado en el último año fue similar a la del aislado recogido el primer año, puesto que el tiempo necesario para eliminar la bacteria fue parecido. Por tanto, el contacto con cloro no parece influir en la sensibilidad de Legionella a posteriores tratamientos con sales de fosfonio cuaternarias como el ADICLENE 1352. La torre de refrigeración se mantuvo controlada y sin problemas durante un año y medio. En noviembre de 2004 hubo una incidencia motivada por una avería en el sistema de dosificación del desinfectante. Esto motivó que los niveles de mismo fueran inferiores al residual recomendado (40 ppm), durante unos días. La toma de muestra de agua para analizar Legionella se hizo justo antes de volver a poner en marcha la dosificación automática, después de la reparación. En esta muestra el recuento de L pneumophila SG 1 fué de 5000 ufc/l. También se detectó un nivel de aerobios de 11000 ufc/ml, es decir superior a lo recomendado por el RD865/2003. Se realizó una desinfección según el Anexo 4B del RD865/2003 y, a los quince días, se volvió a tomar muestra cuyo recuento de Legionella fué inferior a 50 ufc/l. Se mantuvo el programa de mantenimiento preestablecido y a los tres meses se volvió a tomar muestra, comprobando que el plan de mantenimiento fué eficaz para el control de Legionella. %!(), 2,0 40 5000 9,0 40 1,5 hierro turbidez 30 4500 4000 30 3500 3000 1,0 20 2500 8,0 20 hierro (mg/l) 0,5 0,0 1/7/2003 1/11/2003 1/3/2004 tiempo 1/7/2004 1/11/2004 1/3/2005 10 0 turbidez (UNF) Conductividad (us/cm) 2000 1500 1000 500 0 1/7/2003 1/11/2003 Conductividad ph temperatura 1/3/2004 1/7/2004 1/11/2004 1/3/2005 ph 7,5 7,0 ºC 0temperatura 10 10 5 El valor recomendado de hierro total es de <2 mg/l que se cumple en todo el período de estudio. El valor fijado para la turbidez es de <15 UNF, que se sobrepasa en un par de ocasiones. Creemos que este hecho no es preocupante ya que consideramos que mantener un nivel por debajo de 15 UNF es muy difícil en algunas torres. 120 10 4 El ph se mantiene dentro de los valores recomendados (6,5-9,0), la conductividad también es correcta, a pesar de un valor punta elevado en mayo del 2004, pero que no afectó al funcionamiento general de la torre. La evolución de la temperatura nos indica claramente en que estación del año nos encontramos, y como curiosidad, si se comparan los valores del verano del 2003 y los del 2004 se observa una diferencia aerobios totales (ufc/ml) 10 4 10 3 10 2 10 1 1/07/03 1/11/03 1/03/04 tiempo 1/07/04 1/11/04 1/03/05 100 80 60 40 concentración de biocida (mg/l) 10 3 10 2 20 0 10 1 conc. biocida aerobios totales Legionella desinfecciones Legionella (ufc/l) El recuento de aerobios se mantuvo bastante regular a lo largo de todo el estudio, a excepción de una disminución puntual coincidente con un aumento en el nivel de desinfectante. La única detección de Legionella coincidió con la desaparición del desinfectante.
El plan de mantenimiento seguido durante 2 años en la torre de refrigeración se mostró eficaz en el control de Legionella. Conocer la evolución de cada parámetro por separado permite evaluar las tendencias y valorar el por qué de las variaciones puntuales. Las tendencias y las variaciones puntuales proporcionan información sobre la bondad de los tratamientos y sobre el estado de la instalación. El desinfectante Adiclene 1352 (Cloruro de tributil tetradecil fosfonio) se mostró eficaz in vitro y en campo, en el tratamiento de la torre de refrigeración. La recuperación de Legionella se debió a una disfunción en el programa de mantenimiento que provocó la eliminación del desinfectante, y no parece tener relación con el nivel de aerobios totales. La evaluación in vitro de la eficacia de un desinfectante debería incluir ensayos de estimulación del crecimiento de Legionella en medio líquido, además de recuentos de colonias en medio sólido. -!. En muestreos con aparente ausencia de Legionella, se recupera la bacteria cuando se estimula su crecimiento en BYE, evidenciando la presencia de la misma, aunque su bajo número impidiera su aislamiento en placa (BCYEa). Boletín CAM. Grupo de trabajo. Informe: Brote de neumonía por Legionella de Alcalá de Henares. Boletín Epidemiológico de la Comunidad de Madrid. Número monográfico. 1997. Castellani-Pastoris M, Ciceroni L, Lo-Monaco R, Goldoni P, Mentore B, Flego G, Cattani L, Ciarrocchi S, Pinto A, and Visca P. Molecular epidemiology of an outbreak of Legionnaires' disease associated with a cooling tower in Genova-Sestri, Ponente, Italy. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 16: 883-92. 1997. García-Fulgueiras A, Navarro C, Fenoll D, García J, González-Diego P, Jiménez-Buñuales T, Rodriguez M, Lopez R, Pacheco F, Ruiz J, Segovia M, Baladrón B and Pelaz C. Legionnaires Disease outbreak in Murcia, Spain. Emerg Infect Dis. 9(8): 915-921, 2003. Real Decreto 865/2003, de 4 de Julio, por el que se establecen los criterios higiénicosanitarios para la prevención y control de la legionelosis. BOE 171, Viernes 18 de Julio de 2003, pag 28055-69.
/ 0$ El ADICLENE 1352 es un biocida para el control de Legionella spp. en los circuitos industriales de refrigeración.. Aspecto Físico... Líquido claro amarillento Olor... Suave ph... 7,0 Punto de ebullición (760 mm) 0... 100 0 101 0 C Peso específico (20 0 C)... 0,99 Solubilidad en agua... Ilimitada Temperatura de descomposición... 300 0 C ) El ADICLENE 1352 presenta una acción biocida o biostática dependiendo de las concentraciones a las que trabaje. Es altamente efectivo para inhibir el crecimiento de Legionella spp. a dosis bajas. A dosis más elevadas, actúa como un poderoso agente limpiante en sistemas invadidos por el crecimiento biológico, gracias a su excelente actividad biocida y su elevada actividad superficial. ' El ADICLENE 1352 se dosifica a dosis de choque, con una periodicidad dependiente de la vida media del sistema. Los niveles que se deben alcanzar para un correcto control biológico oscilan entre 40 y 200 ppm. Para sistemas de vida media corta se recomienda una dosis diaria de 100-150 ppm. Para sistemas con vida media superior a dos días recomendamos dos dosis semanales de 200 ppm. En operaciones de limpieza se recomiendan dosis de 250-400 ppm. dependiendo de las características del sistema. Nuestro Dto. Técnico estudiará las características particulares de la instalación y establecerá la dosis óptima en cada caso. & 1. El ADICLENE 1352 es estable en medio neutro, ácido y básico, pudiendo ser usado a ph comprendido entre 2 y 12. Es compatible con agentes oxidantes como el cloro a los niveles usuales de operación. No es susceptible de degradación por acción de la luz ultravioleta.