Trabajo Práctico de Laboratorio 5 Tema: Aminoácidos y proteínas Fundamentación teórica AMIÁCIDS Propiedades químicas Los aminoácidos poseen en su estructura un grupo ácido y un grupo básico, por lo cual presentan propiedades anfotéricas. Un anfolito es aquella especie que puede aceptar y donar protones ( + ). En una solución de bajo p, los aminoácidos están totalmente protonados y tienen una carga positiva. Si la solución es casi neutra, los aminoácidos existen como iones dipolares, o sea iones con una carga positiva y una carga negativa. Los iones dipolares también se conocen como zwitteriones. Un aminoácido que existe como un ion dipolar es neutro ya que las cargas, positiva y negativa, se cancelan. Para valores de p altos, los aminoácidos se cargan negativamente. En solución se establece un equilibrio entre las tres formas. Por ejemplo, para el aminoácido glicina: A p 2 todos los grupos aparecen protonados: -C - como -C y - 2 como - + 3. El aminoácido tiene una carga positiva neta. A partir de p 2.34 (pk1) el grupo carboxilo se disocia (-C - ) y el amino sigue protonado (- + 3 ). El aminoácido tendrá simultáneamente carga positiva y negativa (zwitterion). A partir de p 9.60 (pk2) el carboxilo sigue disociado (-C - ) y el amino pierde el protón (- 2 ). El aminoácido queda con una carga negativa neta. Si analizamos el movimiento electroforético de los aminoácidos a distintos valores de p, encontraremos un valor al cual su movilidad es nula. Este valor de p corresponde a la condición en la cual la especie dominante es aquella que no posee carga eléctrica neta. Este valor de p recibe el nombre de punto isoeléctrico (pi). Podemos definir entonces al pi como el valor de p al cual un aminoácido, un péptido o una proteína poseen carga neta 0. Este valor se puede calcular a partir de la curva de titulación o empleando la siguiente ecuación: pi= (pk1+ pk2)/2. 1
Titulación en presencia de formaldehido Este procedimiento de titulación de aminoácidos con un hidróxido en presencia de formaldehido fue diseñado por Sørensen en 1907 y se basa en el consumo de la especie con el grupo amino libre, lo cual produce un desplazamiento a la derecha del equilibrio indicado como pk2, con la consiguiente liberación de protones y acidificación del medio. El descenso en los valores de p se registra a partir de la generación de la especie nucleófila, es decir a partir del punto de inflexión correspondiente al valor de pk del grupo amino. En el caso de un aminoácido dicarboxílico, como ácido aspártico como por ejemplo: En este caso, para calcular el pi deben considerarse los valores de pk que rodean a la especie de carga neta 0. 2
Por último, para el caso de un aminoácido dibásico, como arginina, se observa que: Al igual que en caso anterior para calcular el pi deben considerarse los valores de pk que rodean a la especie de carga neta 0, encontrándose el zwitterion a p básico. Una reacción característica de aminoácidos es la conjugación de su grupo amino con ninhidrina. Esta reacción es de gran utilidad debido a que se genera un aducto coloreado que sirve como revelador en cromatografía en placa delgada (CCD). Reacción general de un aminoácido con ninhidrina 3
Mecanismo de reacción Reacción de ninhidrina con prolina 4
ELACE PEPTÍDIC Una unión peptídica es un enlace amida entre el grupo α-amino de un aminoácido y el α- carboxilo de otro. Como cualquier amida, su estructura presenta más de una forma contribuyente con buen peso en su híbrido de resonancia: Esta es una característica central de péptidos y proteínas que determina, no sólo la arquitectura proteica, sino también cuestiones importantes en relación a su química. Una de ellas es la interpretación de su mecanismo de hidrólisis en medio ácido, dónde el análisis de las estructuras contribuyentes al híbrido de resonancia justifica la posición más básica del enlace. 3 3 3 C 2 C 2 C 2 lenta 2 3 C 2 2 3 C 2 3 C 2 5
ISULIA La insulina es una hormona polipeptídica formada por 51 aminoácidos, producida y secretada por las células beta de los islotes de Langerhans del páncreas. La insulina es una hormona anabólica por excelencia, ya que permite disponer a las células del aporte necesario de glucosa para los procesos de síntesis con gasto de energía. Esta hormona reduce el nivel de glucosa en la sangre y promueve el almacenamiento de glucosa como glucógeno y grasa. La insulina está constituida por dos secuencias de aminoácidos. La cadena A tiene 21 aminoácidos, y la cadena B tiene 30 aminoácidos. Las cadenas están unidas entre sí a través tres puentes disulfuro. Las hormonas peptídicas por lo general son diferentes para cada especie, aunque conservan similitudes importantes. La insulina humana es idéntica a la insulina de cerdo, excepto que el último aminoácido de la cadena B del cerdo es alanina (Ala) en vez de treonina (Thr). Trabajo práctico Parte 1: Propiedades anfotéricas de los aminoácidos. Curva de titulación de glicina bjetivo: btener la curva de titulación de glicina en ausencia y en presencia de formaldehido. Comparar las curvas obtenidas, calcular los valores de pka y el pi del aminoácido. 6
PRTCL DE LABRATRI Realizar las siguientes curvas de titulación: 1) 200 ml de glicina 0.05 M en agua, titulado con a 1 M. 2) 200 ml de glicina 0.05 M en agua, con formol (glicina 0.05 M; formol 1 M) titulado con a 1 M. Para realizar la curva 1 preparar la siguiente solución: Glicina 1 M... 10.00 ml (exacto) Cl 1 M... 10.00 ml (exacto) Agua destilada... 180.0 ml (exactos) Para realizar la curva 2 prepare la siguiente solución: Glicina 1 M... 10.00 ml (exacto) Cl 1 M... 10.00 ml (exacto) Formaldehído... 10.00 ml (exacto) Agua destilada... 170.0 ml (exactos) Colocar en un erlenmeyer de 500 ml la mezcla inicial a titular, preparar la bureta con la solución titulante de a 1M. (Asegurar el buen funcionamiento de los robinetes. El pmetro deberá estar calibrado con buffer p 4.0 a temperatura ambiente). Precauciones: La medición de los volúmenes de glicina, ácido clorhídrico y formaldehído deberá realizarse con exactitud, para ello se utilizará pipetas de doble aforo (usar una pipeta distinta en cada caso). Titulación: Colocar en el vaso de precipitación la solución a titular, a temperatura ambiente, con el agitador. Introducir con mucho cuidado el electrodo de vidrio hasta que el líquido cubra el bulbo y el orificio de unión líquida del electrodo. Acercar la bureta de modo que el pico de la misma esté dentro del vaso de precipitación. Agitar por un momento, dejar reposar y medir el p inicial de la solución. Dejar caer un volumen de la solución de titulación y agitar suavemente (los volúmenes a agregar se encuentran en la tabla de valores). Dejar de agitar y proceder a la lectura del p. Continuar agregando la solución de titulación según lo indicado en la tabla de valores, agitando después de cada agregado y realizando la lectura de p. Proseguir la titulación hasta p extremo (alrededor de p 10-12) con a. 7
Tabla de valores a 1M (ml) Glicina p 0 0.3 0.6 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 10.3 10.6 11 11.3 11.6 12 13 14 15 16 17 18 19 20.0 Glicina + Formaldehído p Precauciones: Al llegar al p extremo no dejar el electrodo de vidrio sumergido en la solución por más de 2 ó 3 minutos, dado que el vidrio con el que está fabricado el electrodo es atacado y pierde sensibilidad. Inmediatamente, sacar el electrodo y lavarlo con abundante agua bidestilada. Al finalizar el trabajo práctico, lavar la bureta con Cl al 10 % y con agua destilada, para evitar de esta forma que se pegue el robinete y quede inutilizado. Finalememte, elaborar la curva de titulación para cada solución con p en las ordenadas y miliequivalentes de reactivo agregado en las abscisas. Comparar las curvas de glicina con formaldehído y sin formaldehído. Indicar los respectivos pk y calcular el punto isoeléctrico de glicina. 8
Parte 2: Aminoácidos y proteínas bjetivo: Realizar la hidrólisis química de un péptido natural y observar sus aminoácidos constituyentes por medio de cromatografía en placa delgada. PRTCL DE LABRATRI idrólisis de Insulina: Colocar 1 ml de insulina (80-100 U) en un tubo ampolla y con cuidado, adicionar 1ml de Cl concentrado. bserve la coagulación de la proteína por adición del ácido. Cerrar el extremo del tubo sobre la llama de mechero (esta paso será llevado a cabo previamente por el ayudante de laboratorio). Colocar el tubo en un baño de agua a ebullición durante 45 minutos. La temperatura del baño no debe ser inferior a 100 C. Transcurrido el tiempo de calentamiento, cortar el extremo del tubo ampolla y volcar su contenido con precaución, en un vidrio de reloj. Llevar a seco sobre un manto de evaporación. Una vez seco, retomar el extracto con 2-3 gotas de ácido acético diluido y analizar por cromatografía. Cromatografía en placa del hidrolizado de insulina: Con el extracto obtenido, realizar la cromatografía empleando los patrones de aminoácidos disponibles en el laboratorio disueltos en ácido acético. Emplear como solvente de corrida una mezcla de Butanol:Ác. Acético: 2 0 (60:20:20) y como revelador solución alcohólica de ninhidrina (1.5 %) y posterior calentamiento a 120 C durante unos minutos. 9