Facultad de Química, UNAM 1630 Genética y Biología Molecular Código Genético y Traducción Unidad 7 Dogma Central de la Biología Molecular. Flujo de la Información Genética Replicación Transcripción. Síntesis de RNA Traducción Síntesis de Proteínas 1
Comparación de la expresión génica entre eucariontes y procariontes Eucariontes Procariontes Núcleo Transcripción Traducción Transcripción Traducción Código genético: DNA ------- Bases RNAm ------- Bases Proteína ------- Aminoácidos En DNA y RNA hay 4 bases pero en proteínas: 20 aminoácidos Combinaciones de bases para determinar un aminoácido: Combinaciones de 2 bases: 4 2 = 16 (no alcanzan!!) Combinaciones de 3 bases: 4 3 = 64!! (ahora sobran!!) Codón: Secuencia de tres bases en el RNAm que especifica un aminoácido en la secuencia de la proteína o causa la terminación de la traducción. 2
Nirenberg y Matthaei descifraron el código genético usando un lisado de E. coli para sintetizar proteínas in vitro al cual le agregaban RNAm sintético poli-u, poli-a, poli-ca... RNA Proteína Solamente 61 de las 64 combinaciones posibles codifican para aminoácidos Código Genético 61 codones determinan aminoácidos 3 codones son non-sense y funcionan como señales de término (stop) de la traducción Segunda posición Primera posición 18 de los 20 aminoácidos están determinados por más de un codón. El código genético es redundante. 3
Solamente Met y Trp están determinados por un codón. Codones sinónimos: Para muchos aminoácidos determinados por mas de un codón, las 2 primeras bases no varían y solamente hay cambio en la 3 a posición. Qué característica común tiene esa 3 a base en los aminoácidos determinados por dos codones? Esta propiedad minimiza los efectos de alguna mutación. Sustitución por transición en el que hay un cambio de una purina por otra purina. AAG - AAA El código genético está altamente conservado filogenéticamente. De hecho, por muchos años, se consideró que era UNIVERSAL, hasta que se encontraron las excepciones que son mínimas. La mayor parte de estas excepciones se identificaron en los genomas mitocondriales y en algunos protozuarios. Codón Código genético Excepción Genoma AGA/ AGG Arg Ser Mitocondria animal CGG Arg Trp Mitocondria plantas UAA/ UAG Término Glu Nuclear protozuarios UGA Término Trp Micoplasma 4
Para los aminoácidos determinados por mas de un codón, estos no son usados con la misma frecuencia. Para los aminoácidos determinados por mas de un codón, estos no son usados con la misma frecuencia. 5
En el proceso de traducción participan los RNAt, RNAr y RNAm. Estructura de un RNAm maduro. AUG UAA UAG UGA Codones de término Región codificante Cola de Poli-A CAP Región 5 no traducida 5 -UTR Región 3 no traducida 3 -UTR Marco de lectura abierto (Open Reading Frame) Marco de Lectura 1 Marco de Lectura 2 La misma secuencia de RNAm. Tres secuencias de polipéptidos distintas!!! Marco de Lectura 3 Solamente uno de los marcos de lectura es el correcto para la traducción. Cómo es reconocido este marco por el aparáto traduccional? 6
El codón del RNAm es reconocido por la secuencia anticodón del RNAt 5 C G C 3 RNAm La interacción ocurre por apareamiento de bases complementarias. Las dos moléculas de RNA son antiparalelas. Hipótesis del bamboleo (wobble) Debido a que el código genético es redundante: Algunos aminoácidos están determinados por 6 codones Algunos aminoácidos están determinados por 4 codones Algunos aminoácidos están determinados por 3 codones Algunos aminoácidos están determinados por 2 codones Algunos codones que determinan al mismo aminoácido son reconocidos por el mismo RNAt Esto implica que hay apareamientos de bases tipo Watson-Crick para las dos primeras posiciones del codón, pero no para la tercera. 7
Hipótesis del bamboleo (wobble) La inosina es una purina que forma interacciones débiles con C, U, A I/U C G C 5 3 RNAm Muchos RNAt tienen inosina en la posición 5 del anticodón Los RNAt son las moléculas adaptadoras (traductoras) que decodifican la información en el RNAm acarreando al aminoácido correspondiente. 8
Estructura Secundaria del RNAt Asa D Brazo D * El brazo variable (3-21 nts) puede formar un tallo de hasta 7 pb. Brazo T. Tallo de 4-5 pb * Función de los RNAt RNAt + Aminoácido -- Aminoacil RNAt La reacción ocurre en dos etapas: 1. Activación del aminoácido: Formación del aminoacil adenilato Aminoácido + ATP Aminoácido-AMP + PPi R Se forma el aminoacil adenilato que tiene un enlace de alta energía. La hidrólisis del pirofosfato inorgánico que se produce genera energía para la reacción. 9
2. Formación del aminoacil-rnat Aminoacil adenilato + RNAt Aminoacil-RNAt + AMP El aminoácido se une al extremo 3 -OH del RNAt. En el brazo aceptor. Aminoacil RNAt sintetasas A pesar de que catalizan la misma reacción, estas enzimas pueden ser muy diferentes. Algunas son monómeros, dímeros y tetrámeros. La misma enzima realiza los dos pasos de la reacción. Tiene sitios de unión para: el aminoácido ATP RNAt 10
Aminoacil RNAt sintetasas. Reconocen secuencias en la región interna del RNAt. Tienen muy alta especificidad pues distinguen entre 40 RNAt que tienen una estructura similar, solamente con algunos cambios en la secuencia de bases. Reconocen elementos de identidad en el RNAt que incluyen: Región anticodón Pares de bases en el tallo aceptor. La síntesis de proteínas se lleva a cabo en los ribosomas 2.76 x 10 6 Da El ribosoma procarionte se puede disociar en dos subunidades. Cada una de éstas se compone de RNAr y muchas proteínas 11
La estructura de los ribosomas se resolvió por cristalografía de rayos X Premio Nobel de Química 2009 Estructura de los Ribosomas. Los ribosomas son ribozimas que 1. Decodifican la información genética y 2. Polimerizan los aminoácidos. Aseguran que la síntesis de proteínas ocurra progresivamente y con alta especificidad. Una bacteria en fase exponencial tiene aprox. 10 5 ribosomas. Subunidad Pequeña 30S Subunidad Grande 50S Lectura de los codones Polimerización de Aminoácidos 21 proteínas + RNAr 16S 31 proteínas + RNAr 23S y 5S 12
Sitio de unión al ribosoma En los RNAm procariontes hay una secuencia altamente conservada que está entre 8 y 13 nts del codón de inicio. Esta secuencia es rica en purinas y el consenso es: 5 -AGGAGGU-3 Esta secuencia se aparea por interacciones de puentes de hidrógeno con la secuencia 3 -UCCUCCA-5 que se encuentra en el RNAr 16S de la subunidad pequeña del ribosoma. Se llama Secuencia de Shine-Dalgarno o sitio de unión al ribosoma. Sirve para posicionar de manera correcta al RNAm en el ribosoma con respecto al codón de incio. El codón que marca el inicio de la traducción es AUG que codifica para el aminoácido metionina 5 5 - UTR En procariontes, el codón de inicio AUG codifica para formil metionina: En eucariontes, el codón de inicio AUG codifica para metionina: 13
Formación del complejo de iniciación Ensamblaje del ribosoma en el RNAm Se requiere de: Subunidad pequeña del ribosoma Subunidad grande del ribosoma RNAm Aminoacil-RNAt (formil-met) Factores de iniciación (IF) IF1 e IF3 => se unen a la subunidad 30S y previenen la unión de 50S en ausencia de RNAm IF2-GTP ayudan a la unión del aminoacil-rnat de iniciación Formación del complejo de Iniciación. Los factores IF1 e IF3 se unen a la subunidad 30S del ribosoma y previenen la unión de la subunidad 50S En procariontes, el codón de inicio es reconocido por un aminoacil-rnat que acarrea formil-met RNAt El grupo formilo se añade después de la carga del RNAt, por una enzima (transformilasa) que usa formiltetrahidrofolato. Solamente el RNAt f-met se usa para formar el complejo de iniciación. Todos los demás aminoacil-rnat requieren que el ribosoma esté completamente ensamblado. 14
Formación del complejo de Iniciación. La unión de AA-RNAt(fMet) al codón de inicio es un proceso dependiente de la hidrólisis de GTP. El IF2 se une a GTP acompaña al AA-RNAt f-met Al disociarse IF1, se une la subunidad 50S del ribosoma. Queda formado el complejo de iniciación. Fase de elongación Factores de elongación EF EF-Tu / EF-Ts/ EF-G Aminoacil-RNAt del resto de los aminoácidos. GTP Complejo de Iniciación La fase de elongación se divide en tres etapas Ocupación del sitio aminoacil Formación del enlace peptídico Translocación 15
En el ribosoma se pueden distinguir tres sitios E, P y A, de los cuales el sitio P y A pueden ser ocupados por AA-RNAt Sitio P (Peptidil) del ribosoma Sitio A (Aminoacil) del ribosoma El AA-RNAt f-met ocupa el sitio Peptidil en el ribosoma. FASE DE ELONGACION Ocupación del sitio Aminoacil por el siguiente AA-RNAt Thr EF-Tu GTP GDP 5' AUG ACA 3' P Sitio P (Peptidil) A Sitio A (Aminoacil) EF-Ts EF-Ts regenera el GTP 16
FASE DE ELONGACION Formación del enlace peptídico Thr El grupo amino del AA-RNAt del sitio A está bien posicionado para atacar el enlace éster entre el RNAt que ocupa el sitio P y el aminoácido. 5' AUG ACA 3' P A Mecanismo de Formación del Enlace Peptídico El grupo amino del AA-RNAt del sitio A está bien posicionado para atacar el enlace éster entre el RNAt que ocupa el sitio P el aminoácido que acarrea. 17
Mecanismo de Formación del Enlace Peptídico Se forma un intermediario tetraédrico que es estabilizado por la peptidil transferasa. Intermediario tetraédrico Mecanismo de Formación del Enlace Peptídico El intermediario se cierra para formar el enlace peptídico y liberar al RNAt que está ocupando el sitio P 18
Thr 5' AUG ACA 3' P A El sitio P queda vacío. El centro de peptidil transferasa se encuentra en el RNA ribosomal 23S con participación de algunas proteínas de la subunidad grande del ribosoma. Es una ribozima que acomoda a los sustratos estereoquímicamente para facilitar la formación del enlace peptídico. El centro catalítico responsable de la actividad de la peptidil transferasa se encuentra altamente conservado filogenéticamente. 19
El ribosoma provee la estereoquímica adecuada para la formación de un enlace peptídico, así como la guía para la translocación del sitio A al sitio P y los medios geométricos adecuados para la catálisis mediada por el sustrato. El sitio catalítico del ribosoma, llamado CENTRO DE PEPTIDIL TRANSFERASA (CPT) está situado en una región simétrica altamente conservada: Esta arquitectura le permite al CPT reacomodarse cuando se une el sustrato. Elongación Translocación Thr EF-G 5' 3' P A La translocación es mediada por el factor EF-G, guíado por la hidrólisis de GTP 20
Elongación Thr Translocación EF-G 5' 3' P A El RNAt que acarrea a la cadena polipeptídica creciente ahora ocupa el sitio P. El sitio A queda desocupado para el siguiente AA-RNAt según el codón que está posicionado en el sitio A. Terminación. El ribosoma llega al codón de término del marco de lectura del RNAm Ruptura del enlace éster Factor de liberación o de terminación (RF) Los codones UAA, UAG y UGA no son reconocidos por ningún RNAt UAA (codón de término) STOP RF1=> UAA y UAG / RF2 => UAA y UGA 21
El mecanismo que se ha propuesto para la liberación se basa en la semejanza estructural entre un AA-RNAt y los factores de liberación. El factor de liberación se une al sitio A del ribosoma y acarrea una molécula de agua a la región de elongación de la cadena polipeptídica. La actividad de peptidil transferasa emplea esa molécula de agua para romper el enlace éster y liberar al polipéptido. O H H Polisomas. Un solo RNAm puede ser traducido por varios ribosomas de manera simultánea. 22
La investigación sobre la estructura de los ribosomas tiene aplicaciones prácticas pues muchos antibióticos tienen actividad sobre la síntesis de proteínas de procariontes. Los antibióticos actúan por mecanismos diversos, pero basados en una estrategia común que es la de coincidir con los centros críticos de la función de los ribosomas. Una de las claves para que un antibiótico sea útil es que se unan con mayor afinidad a los sitios de los ribosomas procariontes. Varios inhibidores de la síntesis de proteínas se han usado como antibióticos: ANTIBIÓTICO Estreptomicina Tetraciclina Cloramfenicol Eritromicina Puromicina Cicloheximida ACCIÓN Inhibe la iniciación y causa una lectura incorrecta del RNAm (Procariontes) Se une a la subunidad 30S del ribosoma e inhibe la unión del aminoacil-rnat (Procariontes) Inhibe a la peptidil transferasa (Procariontes) Se une a la subunidad 50S e inhibe la translocación (Procariontes) Causa terminación prematura de la traducción. Actúa como análogo estructural del aminoacil- RNAt Inhibe a la peptidil transferasa (Eucariontes) 23
Origen de los ribosomas. (Protoribosoma) Un vestigio de un aparato de RNA con capacidades de ribozima forma parte del ribosoma. Posible existencia de una maquinaria prebiótica a partir de un oligonucleótido que adquirió una estructura secundaria dada y que posiblemente se dimerizó para formar una hendidura química que permitiera la formación del enlace peptídico. Traducción en Eucariontes. Los ribosomas en eucariontes son más grandes y están formados por un número mayor de proteínas que los ribosomas procariontes. 24
La principal diferencia en la traducción entre procariontes y eucariontes radica en la fase de iniciación. Los RNAm eucariontes carecen de una secuencia consenso de unión al ribosoma (Shine-Dalgarno). Hipótesis del scanning o barrido. La subunidad 40S del ribosoma se une al extremo 5 del RNAm y hace un barrido hasta encontrar el codón AUG. La subunidad 40S Este codón se debe encontrar en el contexto correcto que es: 5 -CCRCCAUGG-3 En eucariontes hay varios factores de iniciación que se pueden clasificar por su función: eif6, eif3, eif4c que se unen a las subunidades del ribosoma. eif4(a,b,e,f) que se unen a la estructura del cap en el extremo 5 del RNAm eif2, eif2b que acarrean al AA-RNAt iniciador 25
El proceso de elongación es similar a los procariontes y la actividad de peptidil transferasa se encuentra en... El proceso de terminación es similar al de los procariontes y se reconocen los mismos codones de término: UAA UAG UGA 26