Instrucciones de Uso Estriol Saliva ELISA Inmunoensayo enzimático para la determinación cuantitativa de estriol en saliva humana. RE52291 96 2-8 C I B L I N T E R N A T I O N A L G M B H Flughafenstrasse 52a Phone: +49 (0)40-53 28 91-0 IBL@IBL-International.com D-22335 Hamburg, Germany Fax: +49 (0)40-53 28 91-11 www.ibl-international.com
1 USO PREVISTO Inmunoensayo enzimático para la determinación cuantitativa de estriol en saliva humana. 2 SIGNIFICADO CLÍNICO El estriol es uno de los tres estrógenos principales producidos por el cuerpo humano. Se produce principalmente durante el embarazo por una unidad materno-placentaria-fetal. La producción fetal-placentaria de estriol lleva, en la madre, a un aumento progresivo en los niveles de hormonas circulantes, que alcanzan un pico al final de la gestación, notablemente superior con respecto a los niveles de las no embarazadas. En la circulación materna, el estriol se conjuga rápidamente en el hígado y se excreta por vía urinaria, con una vida media de aproximadamente 20 minutos. Puesto que la producción normal de estriol depende de una circulación materno-placentaria-fetal intacta y de un metabolismo fetal funcional, los niveles maternos de estriol se usan para controlar el bienestar fetal durante el embarazo, especialmente durante el tercer trimestre. La DHEA-S producida por la corteza suprarrenal del feto se convierte en estriol por la placenta. Unos niveles anormalmente bajos en una mujer embarazada pueden indicar un problema en el desarrollo del niño. Los niveles de estriol en mujeres no embarazadas, con menopausia y en hombres son similares. 3 PRINCIPIO DEL MÉTODO El estriol (antígeno) presente en la muestra compite con el antígeno marcado con peroxidasa frente al anticuerpo anti-estriol absorbido en la microplaca (fase sólida). Después de un período de incubación, la separación libre-unido se obtiene mediante un simple lavado de la fase sólida. La enzima presente en la fracción unida cataliza la reacción entre el substrato (H 2 O 2 ) y el substrato TMB (TMB), desarrollando una coloración azul que cambia a amarillo tras la adición de la solución de parada (H 2 SO 4 ). La intensidad del color desarrollado es inversamente proporcional a la concentración de estriol presente en la muestra. La concentración de estriol en la muestra se calcula a partir de una curva estándar. 4 REACTIVOS, MATERIALES E INSTRUMENTACIÓN 4.1 REACTIVOS Y MATERIALES SUMINISTRADOS EN EL KIT 1. Microplaca recubierta (1 microplaca rompible) MTP Anticuerpo anti-estriol absorbido en la microplaca 2. Conjugado (1 frasco, 1 ml) ENZCONJ CONC Estriol conjugado con peroxidasa 3. Estándares (STD) de estriol (6 frascos, 1 ml cada uno) CAL 0-5 4. Substrato TMB (1 frasco, 15 ml) TMB SUBS H 2 O 2 -TMB 0.26 g/l (evitar el contacto con la piel!) 5. Solución de parada (1 frasco, 15 ml) STOP 0.15 mol/l H 2 SO 4 (evitar el contacto con la piel!) 6. Solución de lavado conc. 50X (1 frasco, 20 ml) WASH CONC NaCl 45 g/l; Tween-20 55 g/l 7. Tampón de incubación (1 frasco, 30 ml) INCBUF Tampón fosfato ph 7,5; BSA 1 g/l 8. Controles (2 frascos, 1 ml cada uno) Control L Control M Version 01/2015 1 / 6
4.2 REACTIVOS NECESARIOS NO SUMINISTRADOS EN EL KIT Agua destilada. 4.3 MATERIALES E INSTRUMENTACIÓN AUXILIARES Dispensadores automáticos. Lector de microplacas (450 nm, 620-630 nm) Dispositivo para la obtención de saliva Nota Conservar los reactivos a 2 8 C, protegidos de la luz. Abrir la bolsa del microplaca recubierta solo cuando se encuentre a temperatura ambiente y cerrarla inmediatamente después de extraer las tiras que se vayan a utilizar; una vez abierta, permanece estable hasta la fecha de caducidad del kit. No retirar las hojas adhesivas de las tiras que no se vayan a usar en la sesión de análisis. 5 ADVERTENCIAS Este kit de ensayo está previsto para usarse in vitro y por personal experto. Non per uso interno o esterno su animali o persone. Usar los equipos de protección individual previstos al trabajar con los reactivos suministrados. Además, el usuario debe seguir estrictamente las regulaciones de GLP (Good Laboratory Practice) u otras regulaciones o leyes aplicables. Algunos reactivos contienen pequeñas cantidades de Proclin 300R como conservante. Evite el contacto con la piel y las mucosas. El cromógeno TMB contiene un irritante que puede ser dañino si se inhala, se ingiere o se absorbe a través de la piel. Para prevenir lesiones, evitar la inhalación, la ingestión o el contacto con la piel y con los ojos. La solución de parada está formada por una solución de ácido sulfúrico diluido. El ácido sulfúrico es venenoso y corrosivo, y puede ser tóxico si se ingiere. Para prevenir posibles quemaduras químicas, evitar el contacto con la piel y con los ojos. Evite la exposición de los reactivos TMB/H 2 O 2 a la luz solar directa, metales u oxidantes. No congelar la solución. Este método permite determinar concentraciones de estriol de 2.5 a 4000 pg/ml. El suministro de esteroides naturales o sintéticos puede alterar los niveles salivales de estriol. 6 PRECAUCIONES Respetar rigurosamente la secuencia de los pasos indicados en este protocolo. Todos los reactivos deben conservarse a una temperatura controlada de 2-8 C en sus recipientes originales. Todas las excepciones están claramente marcados. Los reactivos son estables hasta la fecha de caducidad cuando se almacena y aplica como se indica. Antes del uso, esperar hasta que todos los componentes del kit y las muestras se encuentren a temperatura ambiente (22-28 C) y mezclar cuidadosamente. No mezclar componentes de kits de lotes distintos. Se debe observar la fecha de caducidad indicada en la etiqueta de la caja y de todas las ampollas. No usar componentes después de la fecha de caducidad. Si utiliza un equipo automático, es responsabilidad del usuario asegurar que la metodología aplicada ha sido debidamente validada Un lavado incompleto o impreciso y la aspiración insuficiente del líquido de los micropozos ELISA pueden causar una precisión pobre y/o un elevado fondo. Para mejorar el rendimiento del kit en los sistemas automatizados, se recomienda aumentar el número de lavados. Para la reproducibilidad de los resultados, es importante que el tiempo de reacción sea igual para cada pocillo. El tiempo de dispensación de los pocillos no debe superar los 10 minutos; si se prolongara más allá de los 10 minutos, respétese el orden de dispensación. Si utiliza más de una placa, se recomienda repetir la curva de calibración en cada placa. Al añadir el sustrato TMB inicia una reacción cinética que termina al agregar la solución de parada. Tanto el sustrato como la solución de parada deben agregarse en la misma secuencia para evitar diferentes tiempos de reacción. Version 01/2015 2 / 6
Observar las directrices para la ejecución del control de calidad en los laboratorios clínicos al comprobar controles y/o pool de sueros. Observar la máxima precisión en la reconstitución y dispensación de los reactivos. No use muestras con contaminación microbiana, altamente lipémicas o hemolizadas. Los lectores de microplacas leen las DO verticalmente, por tanto no debe tocarse el fondo de los pocillos. 7 PROCEDIMIENTO 7.1 PREPARACIÓN DE LOS ESTÁNDARES (CAL 0 CAL 5) Antes del uso, dejar durante al menos 5 minutos en el agitador giratorio. A los estándares les corresponden las siguientes concentraciones de estriol: CAL 0 CAL 1 CAL 2 CAL 3 CAL 4 CAL 5 pg/ml 0 2.5 15 100 600 4000 Estables 6 meses a 2-8 C desde la apertura de los frascos. Para unidades del S.I.: pg/ml x 3.5 = pmol/l 7.2 PREPARACIÓN DE LA SOLUCIÓN DE LAVADO Antes del uso, diluir el contenido de cada ampolla de solución de lavado tamponada concentrada (50x) con agua destilada hasta un volumen de 1000 ml. Para preparar volúmenes menores, respetar la relación de dilución de 1:50. La solución de lavado diluida se mantiene estable a 2-8 C durante al menos 30 días. 7.3 PREPARACIÓN DEL CONJUGADO DILUIDO Preparar inmediatamente antes del uso. Diluir 10 μl de Conjugado con 1 ml de Tampón de incubación. Mezclar con cuidado. Estable durante 3 horas a temperatura ambiente (22-28 C). 7.4 PREPARACIÓN DE LA MUESTRA La determinación de Estriol en este kit debe ser realizada con una muestra de saliva. Un método de muestreo apropiado debe ser utilizado. 7.4.1 Método y limitaciones Obtener las muestras de saliva en los tiempos indicados. Para mayor reproducibilidad y precisión, se recomienda obtener al menos 3 muestras en un período de tiempo no inferior a 2 horas y hacer un pool antes de analizarlas. Si no se dan indicaciones específicas para la obtención de saliva, es posible obtener las muestras en cualquier momento, pero teniendo en cuenta los siguientes factores: a) Si la obtención de saliva debe realizarse por la mañana, deberá realizarse antes de lavarse los dientes. b) Durante el día, esperar al menos una hora tras haber comido o bebido antes de obtener las muestras de saliva c) Es muy importante obtener una muestra limpia (no contaminada con comida, cosméticos, sangre, chicle u otros materiales extraños). 7.4.2 Procesamiento de la saliva Hacer fluir la saliva a través de la cánula hasta el tubo de vidrio. 1. Centrifugar la muestra durante 15 minutos a 3000 rpm 2. Dejar a -20 C durante al menos 1 hora. 3. A continuación, descongelar la muestra. 4. Centrifugar durante otros 15 minutos a 3000 rpm 5. La muestra de saliva está lista para el ensayo. 6. Conservar la muestra a 2 8 C durante una semana o a -20 C para períodos más largos. Version 01/2015 3 / 6
7.5 Procedimiento Esperar hasta que todos los reactivos se encuentren a temperatura ambiente (22-28 C). Al final del ensayo inmediatamente poner todos los reactivos a 2-8 C para evitar largos periodos a temperatura ambiente. Las tiras de pocillos no utilizados se deben guardar de inmediato en la bolsa desechable que contiene desecantes y almacenarse a 2-8 C. Para evitar la contaminación microbiana y/o química no regrese porciones de reactivos no usados en los viales originales. Para aumentar la precisión de los resultados de la prueba es necesario trabajar en duplicado: preparar dos pocillos para cada punto de la curva de calibración (C0-C5), dos para cada control, dos para cada muestra, uno para el blanco. Pipetee: Reactivo Estándares Muestra / Controles Blanco Estándar CAL 0 - CAL 5 50 µl Muestra Control L+M 50 µl Conjugado Diluído 100 µl 100 µl Incubar 1 h a temperatura ambiente (22 28 C). Retirar la mezcla de reacción, lavar los pocillos 3 veces añadiendo 300 µl de solución de lavado diluida. Nota importante: agite suavemente la placa durante 5 segundos en cada paso del lavado. Después del último lavado asegúrese haber eliminado completamente la solución de lavado de los pozos, invierta la placa y golpéela repetidas veces contra una servilleta de papel absorbente. Lavados automático: si está utilizando una lavadora automática, lavar los pocillos al menos 5 veces. Substrato 100 µl 100 µl 100 µl Incubar 15 minutos a temperatura ambiente (22 28 C), protegida de la luz. Solución de parada 100 µl 100 µl 100 µl Agitar la microplaca con cuidado. Leer la absorbancia (E) a 450 nm frente una segunda lectura de referencia a 620-630 nm o frente al blanco dentro de los 5 minutos. 8 CONTROL DE CALIDAD Cada laboratorio debe analizar controles para los rangos bajo, medio y alto de estriol para supervisar el rendimiento del análisis. Estas muestras deben tratarse como desconocidas y los valores deben determinarse en cada ensayo realizado. Se deben mantener los gráficos de control de calidad para seguir el rendimiento de los reactivos suministrados. Se deben emplear métodos estadísticos adecuados para determinar las tendencias. El laboratorio debe establecer los límites de aceptabilidad del rendimiento del análisis. Entre otros parámetros que se deben controlar, se incluyen las intersecciones de 80, 50 y 20% de la curva estándar para evaluar la reproducibilidad. Además, la capacidad de absorción máxima debe ser constante con la experiencia anterior. Una desviación significativa del rendimiento establecido puede indicar un cambio inadvertido en las condiciones experimentales o la degradación de los reactivos del kit. Se deben usar reactivos frescos para determinar la causa de las variaciones. 9 RESULTADOS 9.1 ABSORBANCIA MEDIA Calcular la absorbancia media (Em) de cada punto de la curva estándar (S0 S5) y de cada muestra. 9.2 CURVA ESTÁNDAR Trazar en el gráfico de las absorbancias los valores calculados de las absorbancias medias (Em) de cada estándar (S0 S5) en función de las concentraciones. Trazar la curva de ajuste óptimo para los puntos estándar (p.ej.: Logística de cuatro parámetros). 9.3 CÁLCULO DE LOS RESULTADOS Interpolar del gráfico los valores de absorbancia relativos a cada muestra y leer la concentración correspondiente en pg/ml. Version 01/2015 4 / 6
10 VALORES DE REFERENCIA Puesto que los valores de estriol en la saliva tienen un ritmo circadiano, se recomienda obtener las muestras a la misma hora (8 a.m.). Se deben usar los siguientes valores como guía preliminar hasta que cada laboratorio establezca su propio rango de normalidad: Mujeres, Premenopau sia Hora N Rango ± 2DS [pg/ml] Rango Absoluto [pg/ml] 8:00 21 0 21.0 0 32.0 17:00 21 0 6.8 0 8.9 Semanan de embarazo Estriol en Saliva (pg/ml) 22 (700 ± 500) 24 (900 ± 600) 26 (1200 ± 700) 28 (1500 ± 800) 30 (1800 ± 800) 32 (2200 ± 1100) 34 (3200 ± 1300) 36 (4100 ± 1600) 37 (4500 ± 1700) 38 (5000 ± 2000) 39 (5300 ± 2000) 40 (5700 ± 2000) Se recomienda que cada laboratorio establezca su propio rango de valores normales. 11 PARÁMETROS CARACTERÍSTICOS 11.1 PRECISIÓN 11.1.1 INTRA ENSAYO La variabilidad dentro del mismo kit se hadeterminado replicando (16x) la medición de dos controles salivales distintos. La variabilidad intraensayo es 9.7%. 11.1.2 INTER ENSAYO La variabilidad entre distintos kits se ha determinado replicando (10x) la medición de dos sueros de control distintos con kits pertenecientes a lotes distintos. La variabilidad interensayo es 13.7%. 11.2 Exactitud La prueba de recuperación realizada en una muestra de saliva enriquecida con 50 300 2000 pg/ml de estriol ha dado un valor medio (±SD) de 100.6% ± 14.6%. 11.3 SENSIBILIDAD La concentración mínima de estriol medible que se puede distinguir de estándar 0 es 1.0 pg/ml con un límite de confianza del 95%. Version 01/2015 5 / 6
11.4 ESPECIFICIDAD El anticuerpo empleado presenta las siguientes reacciones cruzadas, calculadas al 50% según Abraham: Substancia Reactividad Cruzada Estriol 100.0% 16-epi-estriol 10.5% 15α-OH-estriol 7.0% Estrio-3-sulfato 2.0% Estradiol 0.1% 17-epi-estriol <0.01% Estriol-3α-glucurónido <0.01% Estriol-16α-glucurónido <0.01% Prednisone <0.01% Estrona <0.0001% 11.5 CORRELACIÓN El kit Estriol Saliva (Diametra) se ha comparado con un kit disponible en el mercado. Se han comprobado 30 muestras de saliva. La curva de regresión es: y = 1.03x + 0.68 r 2 = 0.988 y = Estriol Saliva ELISA (IBL) x = Estriol Saliva ELISA (Salimetrics) 12 DISPOSICIONES PARA LA ELIMINACIÓN Los reactivos deben eliminarse de acuerdo con las leyes locales. 13 BIBLIOGRAFÍA Fisher-Rasmussen, W., et al Acta Obstet. Gynecol Scand 60: 417-420 (1981) Truran, P. L., et al Clin. Chem. 28/12, 2393 (1982) Vining, R. F., et al J.Clin.Endoc.Metab. 56, 454 (1983) Bagger, P. V., et al Acta Obstet Gynecol Scand 60: 187 (1981) Osterman, T. M., et al Clin. Chem. 25 (5) 716 (1979) Wisdom, G.B. Clin Chem. 22 (8) 1243-1255 (1976) Version 01/2015 6 / 6
Symbols / Symbole / Symbôles / Símbolos / Símbolos / Σύμβολα REF LOT CONC LYO IVD Cat.-No.: / Kat.-Nr.: / No.- Cat.: / Cat.-No.: / N.º Cat.: / N. Cat.: / Αριθμός-Κατ.: Lot-No.: / Chargen-Bez.: / No. Lot: / Lot-No.: / Lote N.º: / Lotto n.: / Αριθμός -Παραγωγή: Use by: / Verwendbar bis: / Utiliser à: / Usado por: / Usar até: / Da utilizzare entro: / Χρησιμοποιείται από: No. of Tests: / Kitgröße: / Nb. de Tests: / No. de Determ.: / N.º de Testes: / Quantità dei tests: / Αριθμός εξετάσεων: Concentrate / Konzentrat / Concentré / Concentrar / Concentrado / Concentrato / Συμπύκνωμα Lyophilized / Lyophilisat / Lyophilisé / Liofilizado / Liofilizado / Liofilizzato / Λυοφιλιασμένο In Vitro Diagnostic Medical Device. / In-vitro-Diagnostikum. / Appareil Médical pour Diagnostics In Vitro. / Dispositivo Médico para Diagnóstico In Vitro. / Equipamento Médico de Diagnóstico In Vitro. / Dispositivo Medico Diagnostico In vitro. / Ιατρική συσκευή για In-Vitro ιάγνωση. Evaluation kit. / Nur für Leistungsbewertungszwecke. / Kit pour évaluation. / Juego de Reactivos para Evaluació. / Kit de avaliação. / Kit di evaluazione. / Κιτ Αξιολόγησης. Read instructions before use. / Arbeitsanleitung lesen. / Lire la fiche technique avant emploi. / Lea las instrucciones antes de usar. / Ler as instruções antes de usar. / Leggere le istruzioni prima dell uso. / ιαβάστε τις οδηγίες πριν την χρήση. Keep away from heat or direct sun light. / Vor Hitze und direkter Sonneneinstrahlung schützen. / Garder à l abri de la chaleur et de toute exposition lumineuse. / Manténgase alejado del calor o la luz solar directa. / Manter longe do calor ou luz solar directa. / Non esporre ai raggi solari. / Να φυλάσσεται μακριά από θερμότητα και άμεση επαφή με το φως του ηλίου. Store at: / Lagern bei: / Stocker à: / Almacene a: / Armazenar a: / Conservare a: / Αποθήκευση στους: Manufacturer: / Hersteller: / Fabricant: / Productor: / Fabricante: / Fabbricante: / Παραγωγός: Caution! / Vorsicht! / Attention! / Precaución! / Cuidado! / Attenzione! / Προσοχή! Symbols of the kit components see MATERIALS SUPPLIED. Die Symbole der Komponenten sind im Kapitel KOMPONENTEN DES KITS beschrieben. Voir MATERIEL FOURNI pour les symbôles des composants du kit. Símbolos de los componentes del juego de reactivos, vea MATERIALES SUMINISTRADOS. Para símbolos dos componentes do kit ver MATERIAIS FORNECIDOS. Per i simboli dei componenti del kit si veda COMPONENTI DEL KIT. Για τα σύμβολα των συστατικών του κιτ συμβουλευτείτε το ΠΑΡΕΧΟΜΕΝΑ ΥΛΙΚΑ. COMPLAINTS: Complaints may be submitted initially written or vocal. Subsequently they need to be filed including the test performance and results in writing in case of analytical reasons. WARRANTY: The product is warranted to be free from material defects within the specific shelf life and to comply with product specifications delivered with the product. The product must be used according to the Intended use, all instructions given in the instructions for use and within the product specific shelf life. Any modification of the test procedure or exchange or mixing of components of different lots could negatively affect the results. These cases invalidate any claim for replacement. LIMITATION OF LIABILITY: IN ALL CIRCUMSTANCES THE EXTENT OF MANUFACTURER S LIABILITY IS LIMITED TO THE PURCHASE PRICE OF THE KIT(S) IN QUESTION. IN NO EVENT SHALL MANUFACTURER BE LIABLE FOR ANY INCIDENTAL OR CONSEQUENTIAL DAMAGES, INCLUDING DAMAGES FOR LOST PROFITS, LOST SALES, INJURY TO PERSON OR PROPERTY OR ANY OTHER INCIDENTAL OR CONSEQUENTIAL LOSS. IBL International GmbH Flughafenstr. 52A, 22335 Hamburg, Germany Tel.: + 49 (0) 40 532891-0 Fax: -11 E-MAIL: IBL@IBL-International.com WEB: http://www.ibl-international.com Symbols Version 4.5 / 2015-12-07