VITRIFICACION Y BANCO DE OVOCITOS Rocio Díaz, Rocío Peña y Antonio L. González-Utor MasVida Reproducción Avda. Reino Unido nº 1. 41012 Sevilla Han pasado más de 75 años desde la primera vitrificación realizada en espermatozoides de rana, a las recientes altas tasas de supervivencia de ovocitos y embriones obtenidas con este procedimiento. Sin embargo, no ha sido un desarrollo continuo. Hasta la década de los años noventa del siglo pasado, no ha evolucionado la técnica hasta llegar a conseguir los resultados que hoy día son publicados. Inicialmente, esto se observa por el enorme interés suscitado por la vitrificación en el número de artículos publicados que genera una curva exponencial a partir de esa década. No es hasta finales de los 90 cuando nacen los primeros niños fruto de la vitrificación (1998 procedente de embriones vitrificados, 1999 procedente de ovocitos vitrificados y 2001 procedente de blastocistos vitrificados). Denominamos la vitrificación al proceso de conversión de una solución acuosa en un sólido amorfo vítreo, carente de toda estructura cristalina. En nuestra actividad se consigue por el descenso ultrarápido de temperatura con la ayuda de sustancias crioprotectoras hasta llegar a crioconservar los gametos y embriones a muy bajas temperaturas, disminuyendo así las funciones celulares y manteniendo las condiciones de vida suspendida por un largo periodo de tiempo. La vitrificación elimina efectos adversos que antes nos encontramos con congelación a bajas temperaturas o de rampa lenta. Estos hacían que la supervivencia no fuera la deseada por muchos centros. Entre estos daños, nos encontramos, los producidos por el enfriamiento o efecto shilling, los producidos por la formación de cristales de hielo y los producidos por criofracturas en el sólido congelado. Los daños por enfriamiento se producen a temperaturas altas, entre los 15ºC y -5ºC. Entre ellos encontramos la desnaturalización de los lípidos de la membrana, por el cambio en la frecuencia de grupos radicales bivalentes CH2 que transforma la bicapa lipídica desde la fase cristalina líquida o fluida a la
fase cristalina sólida o gel (Ghetler y cols, 2005). También encontramos daños en los microtúbulos tanto del huso meiótico de los ovocitos en metafase II como de su citoesqueleto. La despolimerización de estos microtúbulos del huso puede acarrear una inadecuada segregación cromosómica al finalizar la meiosis y producir ovocitos no balanceados que darán lugar a cigotos aneuploides. Otro de los daños del efecto shilling es el endurecimiento de la zona pelúcida por causa de la reacción de granulos corticales prematura. Los daños por la formación de cristales de hielo se produce a temperaturas entre -5ºC y -80ºC. Estos son fundamentalmente mecánicos debidos a roturas que producen las aristas de los cristales no solo a nivel de membrana plasmática, sino también a diferentes organelas como las mitocondrias. Por último se encuentran los daños producidos por criofracturas que se dan entre la temperatura de transición vítrea de la solución (Tg) y la temperatura de ebullición del nitrógeno (Arav, 2014). Esta se produce por el efecto tijera entre dos masas sólidas que se deslizan una sobre la otra, fracturándose. Si la muestra se encuentra entre ellas, también esta se romperá. Además puede producirse la desvitrificación a causa del calor que desprende esta rotura del material solidificado. Sin embargo, hay inconvenientes que son incrementados por este proceso como son la exposición a altas concentraciones de crioprotectores citotóxicos y los choques osmóticos producidos por ellos. El agua pura puede llegar a vitrificar, pero necesita una velocidad de enfriamiento de unos 100 millones de grados centígrados por minuto, velocidad hoy día inalcanzable. La razón de la utilización de altas concentraciones de crioprotectores es aumentar el valor de Tg y disminuir la temperatura de nucleación homogénea del hielo (Th). La concentración mínima (Cv) para vitrificar una solución es aquella que se encuentra con el mismo valor Tg y Th (Fahy y cols., 2004). En el caso de una disolución de glicerol en agua, se necesita una concentración muy alta (aprox. 60% w/w) para llegar a coincidir estos valores. La solución es realizar un descenso térmico ultrarápido. Hoy día, con los soportes comercializados, podemos llegar a velocidades tan altas como 20.000 a 70.000º C/min., sumergiéndolos directamente en el refrigerante.
También son importantes otros puntos como las mezclas de crioprotectores (tanto permeables como no permeables) que determinan la viscosidad de la solución como el volumen de esta que se deposita en el soporte para vitrificar. Este volumen debe de ser mínimo para que sea mayor la conducción térmica. Por tanto, la probabilidad de la vitrificación puede definirse por (Arav, 2014): =(( µ / Siendo Pv la probabilidad de vitrificación Re y Rc los ratios de enfriamiento y calentamiento. µ la viscosidad de la solución V el volumen de la muestra Esta probabilidad está directamente relacionada con las velocidades de enfriamiento y calentamiento, y con la viscosidad (a mayores valores mayor probabilidad). Sin embargo, es inversamente proporcional al volumen (menor valor mayor probabilidad). Aunque velocidades de enfriamiento y calentamiento están relacionadas con la probabilidad de vitrificación, es la segunda quien domina en la supervivencia. Con velocidades de calentamiento que superan los 100.000º C/min, se obtienen las mismas tasas de supervivencia con ratios de enfriamiento de entre 95 a 69.250º C/min. (Mazur y Seki, 2011). Otros factores a tener en cuenta, en el proceso de vitrificación son: 1.- Las características propias del ovocito por presentar una baja permeabilidad al agua y crioprotectores, y una alta relación superficie/volumen que puede dar lugar a un pseudoequilibrio de los crioprotectores dentro del citoplasma. 2.- La relación de la permeabilidad del agua y los crioprotectores con la temperatura. El tiempo de equilibrio será mayor cuando menor sea la temperatura. 3.- Las propiedades de formación vítrea de los propios crioprotectores. Todos estos avances en el campo de la vitrificación, han dado lugar a excelentes resultados tanto con ovocitos propios como de donante, siendo siempre superiores a los obtenidos con anterioridad con la congelación lenta (Fadini y cols, 2009).
En cuanto a la comparación de ovocitos propios o donados con respecto a si son frescos o vitrificados no presentan diferencias en cuanto a tasas de fecundación, desarrollo embrionario, y tasas de embarazo e implantación (Rienzi y cols, 2010; Sole y cols, 2013). También hay estudios que determinan que la vitrificación del ovocito no afecta a la posibilidad de revitrificar a los embriones sobrantes, teniendo estos las mismas tasas de embarazo que aquellos embriones que no provienen de ovocitos vitrificados (Cobo y cols, 2013). Todas estas evidencias indican que la técnica de vitrificación/desvitrificación no debe de ser tomada ya como experimental y sea una herramienta más en los centros de reproducción humana asistida (ASRM, 2013). Además, hoy día a expensas de estudios más amplios, los datos disponibles acerca del seguimiento de niños nacidos después de la vitrificación hasta el momento no muestran efectos negativos de la técnica (Chian y cols, 2008; Cobo y cols, 2013). Todo ello, conlleva a plantear nuevas estrategias en los servicios que se prestan a los pacientes, como es la instauración de bancos de ovocitos donados (Cobo y cols, 2011). Por un lado, se elimina la necesidad de sincronización donante-receptora y la lista de espera. Por otro lado, la posibilidad de obtener unos buenos resultados con un mínimo número de ovocitos hace que el coste-beneficio para las pacientes receptoras les sea muy aceptable (Glujovsky y cols, 2011). El banco de ovocitos puede ser usado por el propio centro o por otros centros que no puedan tener donantes de ovocitos por diferentes motivos (ciudades pequeñas, falta de fenotipos específicos, etc.). El fundamento del banco de ovocitos como servicio de donación a otros centros, no radica en más que la distribución. En nuestra experiencia, tras estar colaborando con ocho centros nacionales e internacionales, la distribución se ha garantizado con un buen servicio de transporte y la confianza en la recepción en condiciones óptimas de las muestras. Aunque hay autores que indican que por debajo de entre -120 y -130º C, Tg del citoplasma, este puede entrar en transición líquida, promoviendo la desvitrificación y subsecuente recristalización. Por tanto, los ovocitos llegarían a destino sin posibilidad de sobrevivir a la desvitrificación.
Sin embargo, esto no es así pues los estudios fueron realizados con azucares como crioprotectores, y no con las complejas soluciones que se usan hoy día. También estudios recientes determinan que la temperatura de desvitrificación (Td) es mucho menor a Tg (aprox. -102º C) (Sansinena, 2014) pudiendo entonces realizar el transporte sin mayores problemas con un tiempo de permanencia de las muestras, que en nuestra experiencia llega hasta 68h. Bibliografia: Arav, A. Cryopreservation of oocytes and embryos. Theriogenology 2014; 81: 96 102. Chian RC, Huang JY, Tan SL, Lucena E, Saa A, Rojas A, Ruvalcaba Castellón LA, García Amador MI, Montoya Sarmiento JE. Obstetric and perinatal outcome in 200 infants conceived from vitrified oocytes. Reprod Biomed Online. 2008; 16(5):608-10. Cobo A, Remohí J, Chang CC, Nagy ZO. Oocyte cryopreservation for donor egg banking. Reprod Biomed Online. 2011 Sep;23(3):341-6. Cobo A, Castellò D, Vallejo B, Albert C, de los Santos JM, Remohí J. Outcome of cryotransfer of embryos developed from vitrified oocytes: double vitrification has no impact on delivery rates. Fertil Steril. 2013; 99(6):1623-30. Cobo A, Serra V, Garrido N, Olmo l, Pellicer A, Remohí J. Obstetric and perinatal outcome of babies born from vitrified oocytes. Fertil Steril. 2014; 102(4):1006-1015. Fadini R, Brambillasca F, Renzini MM, Merola M, Comi R, De Ponti E, Dal Canto MB. Human oocyte cryopreservation: comparison between slow and ultrarapid methods. Reprod Biomed Online. 2009; 19(2):171-80. Fahy GM, Wowk B, Wu J, Phan J, Rasch C, Chang A, Zendejas E. Cryopreservation of organs by vitrification: perspectives and recent advances. Cryobiology. 2004; 48: 157 178. Ghetler Y, Yavin S, Shalgi R, Arav A. The effect of chilling on membrane lipid phase transition in human oocytes and zygotes. Hum Reprod. 2005; 20(12):3385-9. Glujovsky D, Dominguez M, Fiszbajn G, Papier S, Lavolpe M, Sueldo C. A shared egg donor program: which is the minimum number of oocytes to be allocated? J Assist Reprod Genet 2011; 28:263 267.
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