Vitrificación de Ovocitos en Pacientes de Edad Reproductiva Avanzada. Fátima Olaso. Bióloga
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- Yolanda Camacho Juárez
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1 Vitrificación de Ovocitos en Pacientes de Edad Reproductiva Avanzada Fátima Olaso. Bióloga
2 Índice 1. Introducción. Vitrificación de Ovocitos 2. Calidad Ovocitaria en Edad Materna Avanzada (EMA) 3. Efectos Negativos de la Vitrificación sobre el Ovocito 4. Resultados Clínicos 5. Propuestas para Mejorar los Resultados Clínicos en EMA 6. Conclusiones
3 Introducción La Vitrificación de Ovocitos ofrece resultados espectaculares en Mujeres Jóvenes CONGELACIÓN VITRIFICACIÓN 2006: Efficiency of oocyte cryopreservation: a meta-analysis Oktay K et al. Fertil Steril 2006;86: SV 75% ; PR 20% ; IR 6-10% (CONGELACIÓN) 2009: Vitrification of human mature oocytes in clinical practice Cobo A et al. RBM Online, Vol. 19, Suppl. 4 SV % ; PR 65,2% ; IR 40,8% (VITRIFICACIÓN) 2010: Programa de Donación de Ovocitos (IVI Valencia) N = 170 donantes (Ovocitos vitrificados vs. en fresco) SV: 96,3% ; PR: 59,9% vs 60,3% IR: 40,3% vs 39,7% ; Aborto: 16,1% vs 15,3%
4 Vitrificación de Ovocitos. Indicaciones Preservación de la Fertilidad (Pacientes Oncológicas, Motivos Sociales) (Tulandi et al., 2008; Homburg et al., 2009) Gestión de Bancos de Donantes (Cobo et al., 2008) Evitar Problemas Éticos y Legales asociados a Criopreservación de Embriones BAJA RESPUESTA a la Estimulación Ovárica Vitrificación de ovocitos de un ciclo de estimulación para añadirlos a los conseguidos en un ciclo posterior: IR y PR OBJETIVO Determinar si esta estrategia es eficaz en EMA Mejoran los Resultados Clínicos?
5 Edad Materna Avanzada (>37 años). Tasas de Gestación Reserva Ovárica Receptividad Endometrial Calidad Ovocitaria Fecundidad Tasa de Abortos Complicaciones Obstétricas PR 25-50% (IVI 2010) Alviggi et al. (2009) - Ageing and ART: A waste of time and money? Chung Ho, Hung Yu Ng (2007) - Female reproductive ageing: current knowledge and future trends. Broekmans et al (2006)
6 Calidad Ovocitaria en EMA
7 Calidad Ovocitaria en Edad Materna Avanzada (EMA) COMPETENCIA NUCLEAR/MEIÓTICA alterada Huso Meiótico Aneuploidías Implicaciones Clínicas Bloqueo en el DE COMPETENCIA CITOPLASMÁTICA alterada Aneuplodías Mitocondrias (mtdna y ROS) Disfunción Mitocondrial Fallos de Fecundación Aneuploidías Fragmentación Factores Citoplasmáticos (mrna, proteínas ) Multinucleación Expresión Génica (m-rna) Regulación del Ciclo Celular Estructura Citoesquelética Obtención de Energía Control de la Transcripción Respuesta al Estrés Defectos de Metilación
8 Calidad Ovocitaria en EMA. Expresión Génica Microarrays Genes categorizados según su función La Expresión Génica en las diversas categorías N = 22 pacientes funcionales está afectada por la Edad < 32 años (20 ovocitos) años (10 ovocitos) > 40 años (20 ovocitos) Verde: Gene down-regulation ; Rojo: Gene up-regulation
9 Calidad Ovocitaria en EMA. Mitocondrias Suministran ATP para la Actividad Celular a través de la Fosf. Oxidativa Implicadas en el Envejecimiento Celular y Apoptosis ROS Yau-Huei Wei, et al (2008). Mitochondria and Oxidative stress during aging Wilding et al (2005). The maternal age effect: a hypothesis based on oxidative phosphoryl.
10 Calidad Ovocitaria en EMA. Mitocondrias. Huso meiótico ROS producen Disfunción Mitocondrial (afecta al ΔΨm y ATP) El Estrés Oxidativo está implicado en el descenso de la fertilidad en EMA Control 50μM H2O2 FCCP Terapia ANTIOXIDANTE A mayor tiempo de exposición y dosis se desensambla el HUSO Bloqueo Embrionario, Mosaicismo, Aneuploidías Control 50μM H2O2 100 μm H2O2 2h después D + N-Acetilcisteína (antioxidante) Wang et al (2009). Review: Mitochondrial functions on oocytes and preimplantation embryos
11 Calidad Ovocitaria en EMA. Mitocondrias Variaciones en el ΔΨm y Redistribución Mitocondrial dependiente de estadío En estadío de blastocisto las mitocondrias adquieren una morfología elongada con crestas más desarrolladas alto ΔΨm Cúmulus-Ovocito Ovocito MII Ovocitos MII (óptimo 2pM de ATP) PN Mitocondrias Mitoc. Elongada Blasto (Van Blerkom, 2004)
12 Efectos Negativos de la Vitrificación
13 Efectos Negativos Vitrificación de Ovocitos La vitrificación implica realizar una técnica adicional, aumentando el riesgo de SOBREMANIPULACIÓN de los ovocitos/embriones ESTRÉS OSMÓTICO CRIOPROTECTORES Preactivación Ovocitaria DAÑOS ULTRAESTRUCTURALES (Smith GD et al. 2004) Envoltura Nuclear Compromete Replicación y Transcripción Microtúbulos Huso Meiótico Actina Rotación del Huso Meiótico Migración de Gránulos Corticales Extrusión del CP, Migración de PN Tráfico Intracelular de Moléculas y Orgánulos Citocinesis Redistribución de Mitocondrias Zona Pelúcida Fracturas Polispermia Mitocondrias, Expresión Génica
14 Efectos Negativos de la Vitrificación de Ovocitos. Expresión Génica N = 45 Ovocitos (15 Fresco, 15 Congelación, 15 Vitrificación) mrna que codifica para proteínas implicadas en: 1) Organización Estructural del DNA 2) Mantenimiento de la Estructura de Cromosomas 3) Rutas Congelación Energéticas Mitocondriales = 39,4% mrna 4) Regulación del Ciclo Celular 5) Marcadores de Pluripotencia Vitrificación = 63,3% mrna DAÑO A NIVEL MOLECULAR Fresco Congelación Vitrificación
15 Efectos Negativos de la Vitrificación de Ovocitos. Expresión Génica N = 5 Pacientes jóvenes (2 ovocitos frescos + 3 vitrificados) 25 Ovocitos La Vitrificación NO altera el Perfil Molecular 5 m-rnas esenciales en el Desarrollo del Ovocito: BMP15, GDF 9 FIGLA, OCT 4, TAF 4B de los Ovocitos, NO produce Degradación del mrna Genes no informativos? Nivel de Expresión en 25 ovocitos (N = 5 mujeres) Nivel de Expresión en 5 ovocitos de la misma mujer
16 Efectos Negativos de la Vitrificación de Ovocitos. Huso Meiótico - Morfología del HUSO: 2h después del Warming la Tubulina repolimeriza - Alineamiento de los CROMOSOMAS: similar en los 3 grupos (2h post-w) La Vitrificación afecta negativamente al Huso Meiótico Identificación del Huso Meiótico (POLSCOPE) pero esta situación revierte 2h post-warming INFORMATIVIDAD del HUSO? SV 97% N = 198 ovocitos Noyes et al. (2010) Visualization of meiotic spindle predicts usefulness of female gametes in an oocyte cryopreservation program Oocyte cryopreservation outcomes including pre-cryopreservation and post-thaw meiotic spindle evaluation following slow cooling and vitrification of human oocytes
17 Efectos Negativos de la Vitrificación de Ovocitos. Mitocondrias La Vitrificación afecta negativamente a la Distribución Mitocondrial y disminuye el Potencial de Membrana (ΔΨm) Distribución Mitocondrial Anillo Ausencia de Anillo ΔΨm Fresco Vitrificación
18 Efectos Negativos de la Vitrificación de Ovocitos. Mitocondrias N = 208 Ovocitos MII ( 40 Pacientes) Grupo A Ovocitos en Fresco (self-control) Grupo B Vitrificación + Incubar 90 post warming (Random) Grupo C Vitrificación + Incubar 180 post warming (Random) La Vitrificación tiene un Impacto Negativo en la [ATP] Niveles de ATP 3h post-warming inferiores respecto a Ovocitos Niveles en Fresco ATP Grupo A > Grupo C > Grupo B A C B (Grupo B: ATP no medible en 40,3% de ovocitos)
19 Resultados Clínicos
20 Vitrificación de Ovocitos en EMA. Resultados Clínicos Resultados Vitrificación de Ovocitos según Edad (IVI, 2010) <35 N= N=33 >38 N=47 SV (%) 95,2 91,5 83,5 PR (%) 63, ,2 IR (%) 29,9 27,8 20 Ovocitos MII Rudick et al. (2010) Responding ART Clinics
21 Vitrificación de Ovocitos en EMA. Resultados Clínicos En EMA aumenta el estrés oxidativo y la sensibilidad al estrés extracelular EMA y Vitrificación A medida que actúan aumenta sinérgicamente la Edad disminuyendo Materna, las tasas de Supervivencia, Fecundación y DE temprano los Efectos Negativos de la Vitrificación SV: 98,8% SV: 98,0% SV: 98,5% ovocitaria son Más Evidentes SV: 90,4% N = 76 ; Método Cryoleaf a-d (P<0.05)
22 Vitrificación de Ovocitos en EMA. Resultados Clínicos N = 182 pacientes ICSI (3 ovocitos) Método Cryotop Se alcanzan altas tasas de Gestación Evolutiva Acumulada excepto en el grupo de EMA (41-43 años) Cumulative OPR: <34 años = 62% ; años = 50% ; años = 33% a-h (P>0.05)
23 Vitrificación de Ovocitos en EMA. Resultados Clínicos N = 40 Pacientes Edad 35 años ICSI (3 Ovocitos) Método Cryotop Frescos Vitrificados SV - 96,8% Fecundación 82,3% 79,2% TQE 52% 51,6% Aborto ND 20% Resultados similares en fresco y a partir de ovocitos vitrificados
24 Propuestas para Mejorar los Resultados Clínicos en EMA
25 Propuestas para Mejorar los Resultados Clínicos en EMA OPCIONES DISPONIBLES: (Chung Ho et al, 2007) ; (Alviggi et al, 2009) GH, LH y DHEA en protocolos de estimulación ovárica Assisted Hatching PGS OVODÓN Vitrificación Ovocitos? ALTERNATIVAS: Incidir sobre la Calidad Ovocitaria mejorando la FUNCIÓN MITOCONDRIAL Citotransfer Transferencia de Núcleo NUTRIENTES MITOCONDRIALES (Coenzima Q ; L-carnitina)
26 Propuestas para Mejorar los Resultados Clínicos en EMA. Coenzima Q10 Suplemento dietético de nutrientes mitocondriales (Coenzima Q10) como tratamiento adyuvante en EMA Datos preliminares en ratonas de 52 semanas pretratadas con CoQ10 antes de EOC: Ovario y gl. adrenal doblaron su concentración inicial de CoQ10 Aumento del nº ovocitos recuperados Actividad mitocondrial similar a ratonas jóvenes - Bentinger M et al (2010). Coenzyme Q Biosynthesis and functions - Bentinger M at al (2007). The antioxidant role of coenzyme Q
27 Propuestas para Mejorar los Resultados Clínicos en EMA. L-carnitina El estrés oxidativo está implicado en el envejecimiento ovárico, causando disfunción mitocondrial y un descenso en la cantidad y calidad ovocitarias Efecto terapéutico de L-carnitina (estudio en ratón) Nº de ovocitos 17β-Estradiol 8-OHdG Mitocondrias Mt-DNA
28 Conclusiones La vitrificación de ovocitos mejora los resultados reproductivos en mujeres jóvenes con baja respuesta, alcanzándose altas tasas de implantación y gestación En cuanto a la eficacia de esta estrategia en pacientes de EMA, los pocos estudios publicados hasta la fecha no son concluyentes Sin embargo, teniendo en cuenta el descenso en la calidad ovocitaria unido a los efectos negativos que ejerce la vitrificación sobre el ovocito y el subsiguiente desarrollo embrionario, no parece aconsejable su aplicación en este grupo de pacientes Se propone incidir en la mejora de la calidad ovocitaria administrando nutrientes mitocondriales (Coenzima Q10, L-carnitina) con el fin de reestablecer la función mitocondrial y con ello la competencia ovocitaria
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