Carrera de Especialización en Bioquímica Clínica Endocrinología IV: Módulo Testículo y Semen

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Andrea Ávila Carrizo
hace 8 años
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laboratorio de semen en la reproducción asistida Bioq.

1 Carrera de Especialización en Bioquímica Clínica Endocrinología IV: Módulo Testículo y Semen El laboratorio de semen en la reproducción asistida Bioq. Patricia Chenlo Laboratorio de Fertilidad Masculina. UBA Octubre de 2015

2 Espermatozoide maduro eyaculado Ovocito en metafase II (maduro) + Primer cuerpo polar

6 CAPACITACIÓN Cambios metabólicos y estructurales que ocurren durante su transporte y permanencia en el tracto femenino. remoción alteración adquisición de componentes de la membrana plasmática

7 CAPACITACIÓN HIPERACTIVACION Desarrollar un patrón distintivo de movilidad REACCIÓN ACROSOMAL Para la penetración de las envolturas del ovocito.

8 Movimiento espermático + Arrastre pasivo (contracciones de los músculos del oviducto) 2 mecanismos de guía: Termotaxis y quimiotaxis

9 Penetración de la corona radiada capa muy celular matriz intercelular formada por proteínas y una alta cc de carbohidratos: acido hialurónico.

10 Unión a la zona pelucida y penetración zona pelucida matriz glicoproteica acelular ZP1 ( daltons) ZP2 ( daltons) ZP3 ( daltons)

11 Reacción acrosomal aumento de Ca, aumento de ph, proteínas fosforiladas por vía del DAG y del AMPc, desencadenan los procesos moleculares fusogénicos que dan lugar a las primeras manifestaciones de la RA: múltiples fusiones entre la membrana acrosómica externa y la membrana plasmática del espermatozoide que culminan en su desaparición.

12 Reacción acrosomal

13 Unión a la zona pelucida y penetración Reación Acrosomal denudación penetración de la m. pelucida

14 Bloqueo de la polispermia Reanudación de la meiosis Luego de un breve periodo en el espacio perivitelino hace contacto con el ovocito en dos fases: 1- se fija 2- se fusionan las membranas

15 Enzimas hidrolíticas (proteasas) y polisacáridos

16 FIN DE LA FECUNDACIÓ

17 COMIENZO DE LA PRIMERA DIVISIÓN DE LA CÉLULA HUEVO Desarrollo embrionario segmentación

18 4 días dp de fecundación BLASTOCISTO

19 7 días dp de fecundación

20 Tratamiento de Reproducción Asistida TRA Baja complejidad Alta complejidad Inseminación Artificial Fertilización In Vitro Intrauterina IIU Intra Cervical ICSI FIV

21 Tratamiento de Reproducción Asistida TRA Baja complejidad Inseminación Artificial Fertilización In Vitro Intrauterina IIU Cervical ICSI FIV

22 Técnicas de Selección Espermática Swim up o sobrenado Swim down o Gradientes de densidad

23 Equipamiento Centrifugas Platinas termostatizadas Estufa de cultivo a 37 C con atmosfera de co2 al 5% Indispensable si se utilizan medios de cultivo con Hepes Tubos de centrifuga estériles Pipetas Pasteur estériles Jeringas Filtros Millipore de 0,2 um Crioviales estereriles de 2 ml Campana con flujo laminar Reactivos: Medios de cultivos: HAM F10; HTF (human fluid tubal) Suplementos ATB, suero

24 Técnica de Swim up Medio de Cultivo Fuente de Energía: Piruvato, lactato, glucosa Fuentes de Iones: Bicarbonato, Calcio ATB: Penicilina, Streptomicina Buffer Hepes (reemplaza el HCO 3 -CO 2 para regular el ph y permite trabajar sin necesidad de disponer de estufa gaseada) Rojo fenol Fuente Proteica: suplementos séricos sintéticos, suero inactivado de la paciente, albúmina sérica humana

25 Swim up o sobrenado

26 1 hora a 37 C

28 Plasma seminal Espem. inmóviles Espem móviles Percoll Partículas de silica recubiertas de silano PureSperm Isolate Swim down o Gradientes de densidad

29 Semen Evaluación del semen antes de comenzar la selección y posterior a la selección MP totales del semen Volumen (ml) x cc (Esp/mL) x %MP Producto de Selección MP totales seleccionados Volumen ajustado (ml) x cc post selec.(esp/ml) x %MP p.selec % de Recuperación = (MPtotales post selección/mp totales del semen) x 100

30 Valor pronóstico MP totales seleccionados Volumen ajustado (ml) x cc post selec.(esp/ml) x %MP p.selec Mayor a 5 x 10 6 espermatozoides MP recuperados IIU 1,5 x 10 6 espermatozoides MP recuperados FIV Menos de 1,5 x 10 6 espermatozoides MP recuperados ICSI

31 IIU - Indicaciones Factor cervical (Incompatibilidad moco cervical-semen. Mala calidad o cantidad de moco cervical) Factor coital Factor masculino leve a moderado Endometriosis leve Disfunción ovulatoria Factor peritoneal unilateral ESCA Paternidad diferida (con semen homologo criopreservado): enfermedades que requieren de quimioterapia, enfermedades cronicas, etc. Parejas HIV: serodiscordantes o ambos infectados (para evitar sobreinfecciones)

32 IIU - Condiciones Al menos una trompa permeable. Recuperación espermática > 5x10 6 /ml Ausencia de factor inmunológico en el semen Probabilidad de Embarazo 10 a 20 % por intento No mas de 3 a 6 intentos, si fracasa pasar a una técnica de mayor complejidad

33 Material biológico posible de emplear en TRA Semen Orina Biopsias o punciones de epidídimo (MESA- PESA) o de testículo (TESE TESA)

34 Tratamiento de Reproducción Asistida TRA Alta complejidad Fertilización In Vitro ICSI FIV

35 FIV Incubación en medio de cultivo de cada ovocito con a espermatozoides previamente capacitados en el laboratorio.

36 FIV - Indicaciones Factor tubárico no quirúrgico Factor Masculino (concentración/ml de espermatozoides post swim up > 2.5 millones) Fracaso de tratamientos de baja complejidad previos. Disminución de reserva ovárica. Edad mayor a 38 años Endometriosis severa.

37 ICSI Inyección Intracitoplasmática de espermatozoide. ICSI

38 ICSI - Indicaciones Factor Masculino Severo (concentración/ml de espermatozoides post swim up < 2.5 mill; Kruger < 4-6). Falla de fertilización previa. Criptozoospermia Azoospermia. Muestras congeladas o limitadas (paciente oncológico)

39 Nuevas Estrategias de Selección espermática Selección espermática mediada por ácido hialurónico - PICSI Por estrategias moleculares Separación por Annexin V -MACS (magnetic-actived cell sorting) Por propiedades físicas Selección ultraestructural IMSI Selección electroforética

40 PICSI

41 Anexina V: Marcador de la exposición de fosfatidil serina (PS) en la membrana espermática. MOLECULA DE ANNEXINA V

42 Anexina + = PS expuesta Apoptosis = PS expuesta Anexina + = Apoptosis

43 Espermatozoide con fosfatidilserina en membrana + + Anexina V Acoplado a beads Magneto de alto poder Dra Vanesa Rawe

44 Eluído final que se recoje en tubo cónico y se usa para ICSI

45 Selección Morfológica de alta magnificación Motile sperm organelle morphology examination (MSOME) Microscopio invertido. Óptica de contraste inter-diferencial (DIC). Lentes. Digitalización. Zoom.

46 Bartoov et al

47 ICSI convencional 400 X IMSI 7800 X

48 Desarrollo in vitro de los embriones Embryoscope

49 Requisitos de las Técnicas de Selección Espermática El consenso científico general establece que el procedimiento de selección espermática empleado debe dar seguridad con respecto a: la viabilidad de la gameta los efectos a largo plazo sobre el embarazo logrado

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