REPRODUCCIÓN ASISTIDA EN EL VACUNO DE LECHE FIV

Transcripción

1 REPRODUCCIÓN ASISTIDA EN EL VACUNO DE LECHE FIV J. De la Fuente INIA Reproducción Animal y Conservación Recursos Zoogenéticos jfuente@inia.es Máster Interuniversitario en Zootecnia y Gestión Sostenible: ganadería ecológica e integrada. Instituto de Estudios de Postgrado Universidad de Córdoba Córdoba, Marzo 2012

2 Impacto de las Tecnologías de Reproducción Asistida I.A. Clonación MOET Mejora Reproductiva Bovina 6 3 Transgénesis 5 4 FIV Sexaje OPU

3 ÍNDICE PRODUCCIÓN DE EMBRIONES IN VITRO (FIV): 1.- INTRODUCCIÓN 2.- ASPIRACIÓN DE OVOCITOS : - OVARIOS DE MATADERO - DE ANIMALES VIVOS: * PUNCIÓN LAPAROSCÓPICA * PUNCIÓN ECOGRÁFICA 3.- VALORACIÓN DE OVOCITOS 4.- VENTAJAS E INCONVENIENTES DE LA FIV

4 FISIOLOGÍA REPRODUCTIVA DE LA HEMBRA BOVINA > ovocitos al nacer 1 ovulación por ciclo - 17 ciclos/año Media por vaca < 3 crías Descendencia limitada: Duración de la gestación 1-2 ovocitos ovulados Cómo MEJORAMOS esto?

5 Fecundación in vitro Ovarios Aspiración Ovocitos Espermas Maduración Capacitación Fertilización Embriones In vitro In vivo Cultivo Transferencia

6 ASPIRACIÓN DE OVOCITOS 1.- OVARIOS DEL MATADERO: En caso de accidente No repetible Aplicación en investigación 2.- ANIMALES VIVOS PUNCIÓN LAPAROSCÓPICA: Requiere cirugía Repetibilidad limitada (bienestar animal y adhesiones PUNCIÓN ECOGRÁFICA: Repetible y poco invasivo Fácil para vacas gestantes y con problemas Posible en terneras

7 1.- OVARIOS DE MATADERO: Aspiración de ovocitos Búsqueda de ovocitos

8 2.1.- PUNCIÓN LAPAROSCÓPICA: Anestesia quirúrgica Puertos Suturas

9 2.1.- PUNCIÓN LAPAROSCÓPICA: Ovario SOV Aspiración Punción

10 Producción de embriones in vitro, aspiración laparoscópica en prepúberes Edad, meses Folículos puncionados Ovocitos recuperados Embriones desarrollados (64%) 3 (10%) (33%) 2 (14%) (26%) 3 (60%) (50%) 4 (44%)

11 2.2.- PUNCIÓN ECOGRÁFICA: Aplicaciones Vacas cíclicas: semen caro problema: oviductos bloqueados quistes ováricos fallo en la SOV fallo en la fecundación post parto: durante el anoestro gestantes: durante el primer trimestre Novillas impúberes: desde el primer mes

12 Aspiración en animales prepúberes Aspiración ultrasonográfica: Aguja de 14g ml/min de presión de aspiración. Medio: PBS + BSA, surfactante. Tratamiento de superovulación: 750 a ui de ecg. Neutra ecg + GnRH. A intervalos de 2 a 4 semanas. Intervalo de SOV a la obtención de 48 a 72h.

13 Punción en hembras prepúberes: Direcciones y planos A) Rotación axial B) Plano vertical C) Craneal-caudal D) Plano horizontal Modificación de la sonda para terneras

14 Punción en hembras prepúberes: Terneras de 6 meses Imagen ultrasonográfica: ovario estimulado

15 Punción en hembras prepúberes: Folículo aspiración transvaginal hembras prepúberes Aguja de aspiración Tamaño de los folículos

16 Metodología de FIV: 1. Aspiración folicular 2. Sedimentación 4. Recuperación de ovocitos 3. Búsqueda

17 OBTENCION DE OVOCITOS: Primera visión Poco CODs Denudados

18 SELECCION DE OVOCITOS: SI Expandido NO?

19 SELECCION DE OVOCITOS: Picnóticos Vacuolizados

20 Grado 1 y 2 Placa de maduración Grado 3 y 4

21 Maduración in vitro MIV durante 24 h 39 o C, 5% CO2 1 er corpúsculo polar

22 Fecundación (FIV) Descongelar el semen. Capacitación - heparina. Selección espermática: Swim-up. Gradiente de densidad de Percoll. 0,5-1 X 10 6 spz/ml. Co-cultivo durante 24 h en 5% CO 2 en aire.

23 Separación espermática con Swim-up DESCONGELACIÓN SPZ 0.25 ml semen + 1 ml medio

24 Separación espermática con Percoll Antes de centrifugar Después de centrifugar

25 FIV durante 24h 39 o C, 5% CO 2 Zigoto

26 Diferencias entre toros al fecundar in vitro e in vivo (7 réplicas por semental, P<0.001) Toro Ovocitos Cultivo % División % Desarrollo TNR (IAs) A a 21 a 78% (5.300) B b 14 b 73% (1.500) C b 12 b - D c 5 c -

27 Diferencias entre eyaculados de un mismo semental (17 réplicas, P<0.01) Ovocitos cultivados (%) División (%) Eclosión Eyaculado Eyaculado *

28 Ecuación de Predicción de la Tasa de No Retorno (PTNR) PTNR= 173,11 0,02 (EC) + 1,38 (%ENOR) + 0,95 (%D) + 0,39 (%P) R2 = 0,82 La ecuación para predecir la fertilidad de los toros incluyó cuatro parámetros que explican el 82% de la variación en la fertilidad de los toros estudiados. Estabilidad de la cromatina (EC, explica el 36%). Porcentaje de spz normales determinados por eosina/nigrosina (%ENOR, explica el 25%). Porcentaje de embriones divididos (%D, explica el 16,8%) Porcentaje de ovocitos penetrados in vitro (%P, explica el 3,6%).

29 Desarrollo de embriones cultivados in vitro Día 2 Día 3 Día 4 Día 5 Día 6 Día 7 Día 8-9

30 Cultivo in vitro de embriones a los 7-8 días Blastocistos expandidos Pocillo completo Blastocistos sin ZP, elongados

31 Congelación y vitrificación de embriones producidos in vitro 10% ETG 10 10% Gly 25% Gly 10% Gly 20% ETG 25% ETG Viabilidad (%) Eclosión (%) Congelación 77/150 (51) 46/150 (31) Vitrificación 82/147 (56) 52/147 (35)

32 Viabilidad post descongelación de embriones PIV vitrificados 0.5 M S 10 min 35ºC Viabilidad Eclosión 1 paso 55% (33/60) 35% (21/60) 2 pasos 56% (38/68) 41% (28/68) 3 pasos(4ºc) 72% (47/65)* 63% (41/65)*

33 Comparación entre ambos tipos de producción de embriones bovinos In vivo In vitro Embriones/vaca/año Partos de embriones frescos 60 % 45 % Partos de emb. congelados 50 % 20 % Defectos congénitos 1 % 4 % Distocias 6 % 11 % Peso al nacimiento >10 %

34 FECUNDACIÓN IN VITRO VENTAJAS Disminución del estrés de manejo. Sin interacción sobre la ovulación. Utiliza varios sementales sobre una misma vaca. Evita la transmisión de enfermedades. Realización durante largos períodos fisiológicos. Propicio para la investigación. Insustituible en la Conservación de Recursos Genéticos. INCONVENIENTES Bajos resultados en la congelación. Equipo y formación muy elevada. Síndrome del Ternero Gigante.