MATERIAL DE CULTIVO CELULAR. SUSTRATOS.

Clase Teórica: MATERIAL DE CULTIVO CELULAR. SUSTRATOS. Docente: Dra. Virginia Perdomo vperdomo@fbioyf.unr.edu.ar MATERIAL DE CULTIVO CELULAR. SUSTRATOS. Las condiciones de cultivo varían ampliamente según el tipo de célula utilizado, pero el ambiente artificial donde las células se cultivan consiste invariablemente de: un contenedor apropiado con un sustrato o medio que provea los nutrientes esenciales (aminoácidos, carbohidratos, vitaminas, minerales), factores de crecimiento, hormonas y gases. La mayoría de las células son adherentes y deben ser cultivadas adheridas a un sustrato sólido o semisólido, mientras que otras pueden crecer flotando en medio de cultivo (en suspención). Los requerimientos específicos de un laboratorio de cultivo celular dependen principalmente del tipo de investigación que se lleve a cabo. Pero todos ellos tienen requerimientos comunes, siendo el más importante estar libres de microorganismos patógenos (asepsis), y además utilizan basicamente el mismo equipamiento. Los materiales más comunes en un laboratorio de cultivos son: Vidrio: Prácticamente todos los Medios se preparan y esterilizan para su almacenamiento y clasificación, en botellas de vidrio. También se utilizan diferentes tipos de pipetas de cristal, probetas, vasos y matraces para el trabajo rutinario del Laboratorio. Para preparar medios en general se utilizan botellas de boro-silicato con tapa de plástico. El lavado, preparación y esterilización de dicho material se realiza en los cuartos destinados a dicho fin. En cultivos celulares de células eucariotas es imprescindible que todo el material que se utilice esté estéril. Plástico: Todo el trabajo que se desarrolla en un laboratorio de cultivos se hace en plástico. El material de plástico descartable es muy variado y depende de la aplicación final pero, en general, para cultivo de células eucariotas necesitamos: Botellas o flasks Los primeros frascos de cultivo celular fueron desarrollados por Alexis Carrel en 1923. Eran frascos de vidrio PYREX de fondo plano redondo tanto de cuello derecho como inclinado. Estos fueron llamados frascos D, en referencia al diámetro (Ejemplo: D-3.5, frasco de 3,5 cm de diámetro). Posteriormente William Earle introduce en 1947 los frascos T referidos al área de superficie total del frasco que se encuentra disponible para el crecimiento de las células. Estos eran hexagonales o rectangulares. Así, un T-25 posee un área de crecimiento de 25 cm2. En los 1

años 60s, los frascos T de cuello derecho comenzaron a estar disponibles en poliestireno tratado para la adhesión celular. Existen frascos con distintos tipos de tapas, ventiladas o no. Ventajas: Tradicional y fácil de usar Buen acceso de la pipeta y fácil de remover células y cambiar el medio Crecimiento del cultivo puede ser rápidamente determinado al microscopio Reduce el derrame de medio y las contaminaciones del cultivo No se requiere equipamiento adicional Desventajas: Es muy laborioso para grandes números de células: se requieren 44 T-225 para crecer 1x10 9 celulas Utiliza más espacio en el incubador Las mismas vienen de distintos tamaños: 25 cm 2, 75 cm 2, 150 cm 2, 225 cm 2 crecimiento. También tienen distintas formas: triangular, rectangular o circular (botellas roller). de área de Triangular: buen acceso de la pipeta y scraper a los ángulos. Su base ancha provee mayor estabilidad. Rectangular: pueden tener una rampa desde el fondo del cuello angular para facilitar el volcado y el acceso a pipetas. Otra alternativa son las tradicionales con cuello angular o recto las cuales permiten que se utilice toda el área para el crecimiento celular. Su diseño ahorra espacio y reduce el contacto del medio con el cuello y la tapa. 2

Por otro lado podemos elegir botellas con diferentes tipos de cuello y diferentes tapas. Cuello recto: ideal para volúmenes grandes de medio ya que disminuye el contacto del medio con la tapa. Cuello inclinado: permite volcar el contenido de la botella y hace más sencillo el pipeteo o scraping. Cuello angular: mejora el acceso de la pipeta y reduce el contacto del medio con la tapa. Tapas selladas: para usar en sistemas cerrados, no permiten el paso de líquidos ni gases. Tapas tipo fenólico: cuando se dejan flojas permiten el intercambio de gases. Se usan en sistemas abiertos que requieren la entrada de gases. Tapas ventiladas: contienen una membrana impermeable de 0.2 µm sellada en la tapa que provee un intercambio gaseoso consistente pero minimizando los riesgos de contaminación. Son recomendadas para usar en incubadores de CO 2, especialmente para uso prolongado. Botellas Roller: Se utilizan para la producción de vacunas o proteínas recombinantes con fines terapéuticos. Se fabrican de poliestireno o polietileno, vienen de diferentes tamaños y pueden tener surcos radiales para aumentar la superficie de crecimiento. 3

Frascos de cultivo de multiples capas: Son frascos de múltiples capas que se utilizan para crecer grandes cantidades de células en condiciones similares a los frascos T. En general, están disponible en una, dos, cinco y diez capas; puede realizar cultivos celulares a gran escala de una sola vez. Hecho en poliestireno (PS) y polietileno de alta densidad (HDPE), pueden tener superficie tratada y tapa con venteo. Suelen ser esterilizados con irradiación gamma. 4

Spining flask: De vidrio (reutilizables) o de plastico (descartables). Se utilizan para crecer cantidades grandes de células no-adherentes (1-2 x10 6 celulas/ml). Existen de distintos volúmes, desde 125 ml hasta varios litros. Una desventaja es que necesitan de un agitador magnético, lo cual requeire un mayor espacio en el incubador. La versión de vidrio son dificiles de decontaminar, limpiar, re-esterilizar y re-ensamblar. Erlenmeyers: Se utilizan especialmente para crecer células de insectos que necesitan altos niveles de oxigeno. Vienen de distintos tamaños y con distintas tapas. Solamente para células adherentes y requieren un shaker. Placas de petri: Las placas de petri de poliestireno que tienen superficie tratada sn ampliamente utilizadas en el cultivo celular. Entre sus ventajas podemos destacar: económicas, fáciles de manipular, requiere menos espacio en el incubador que los frascos, el crecimiento celular puede seguirse fácilmente al microscopio, no se requiere equipo adicional. Sin embargo, no son de preferencia cuando se trabaja con grandes volúmenes de células y son mas propensas a derramamientos de medio de cultivo y contaminaciones. 5

Placas con pocillos Existen placas con cantidades diferentes de pocillos, que admiten diferentes volumenes de cultivo. Si se desea medir fluorescencia o luminiscencia es necesario utilizar placas que minimicen la señal cruzada entre pocillos. Para esto se utilizan placas con paredes negras o blancas. Se pueden elegir además distintos tipos de fondos según el uso final. Fondo Plano: Estas placas en blanco y negro se han diseñado con características clave para la adquisición de imágenes. Disponibles con o sin tratamiento para cultivo celular. 6

Fondo en U: están disponibles con y sin tratamiento para cultivo celular. Estas placas son ideales para ensayos de aglutinación. Fondo en V o cónico: La forma del fondo facilita el acceso con la pipeta. Estas placas se han optimizado para robótica, lectores automáticos y sistemas de manipulación de líquidos. Las microplacas de fondo cónico (V) de 96 pocillos son perfectas para la recuperación de muestras. Chambers (Portaobjetos con cámara): El portaobjetos con cámara para cultivo celular permite que se cultiven células y que sean analizadas, a continuación, en un portaobjetos de vidrio para microscopio. Las células crecen en una cámara de plástico fijadas a un portaobjetos para microscopio especialmente preparado. Las mismas se pueden fijar y teñir in situ sin alterar la monocapa de células. Son portaobjetos de vidrio con estructura de poliestireno. La cámara se extrae de forma sencilla y segura mediante la herramienta desechable de extracción. La junta sensible a la presión, biocompatible y adhesiva y acrílica, permanece en el recipiente tras la extracción, no en el portaobjetos, sino facilitando procesamientos posteriores o la colocación de cubreobjetos. El borde de color, hidrofóbico, define las áreas de cultivo. Los pocillos pueden venir numerados para fácil identificación. Transwell (insertos para placas de cultivo) Los accesorios para cultivo celular Transwell son dispositivos de soporte permeables, cómodos y fáciles de usar para el estudio de líneas celulares tanto dependientes como independientes de la adhesión. 7

Características: Soportes permeables para el estudio para el estudio de líneas celulares dependientes e independientes de anclaje. Producen un ambiente celular muy similar al estado in vivo de las células. Permiten que las células polarizadas se alimenten basolateralmente y, por lo tanto, realicen actividades metabólicas de una manera fisiológica. Permiten el acceso al compartimento inferior mediante unas ventanas en la pared del inserto. Su diseño suspendido permite el co-cultivo sin ningún daño de células en el compartimento inferior. Disponibles en una amplia variedad de tamaños de poro (0,1; 0,4; 3,0; 5,0; 8,0; y 12,0 μm), diferentes tipos de membrana (policarbonato, poliéster, tapizada con colágeno) y diferentes número de pocillos (6, 12, 24). Cell Strainer (colador de células): Se utilizan para separar células de sobrenadante. Son fabricados en polipropileno resistente y malla de nylon fuerte. Suelen venir con diferentes tamaños de poro: 40μm, 70μm, o 100μm; los filtros están codificados por colores según el tamaño de poro para mayor comodidad. Se adapta perfectamente a los tubos de centrifugación 50 ml (Falcon). Esterilizados por radiación gamma, no pirogénica. Contenedores para cultivo de Plantas: En el cultivo de plantas se utilizan mayoritariamente contenedores plásticos descartables estériles, de distintas capacidades, dependiendo de del tipo de cultivo que se va a hacer. En algunos casos, pueden utilizarse frascos de vidrio que permiten su esterilización por autoclavado. 8

Scrapers: Para remover mecánicamente las célula adherentes sin romperlas. Vienen esteriles (radiación gamma), son descartables y en general son confeccionado en materiales que no permiten su autoclavado. Pipetas y tips: Las pipetas serológicas utilizadas en el cultivo celular pueden ser de vidrio o plásticas (descartables). Las de plástico son descartables pero las de vidrio requieren el relavado y esterilización. Para esto último deben ser retirado el tapon de algodón antes del lavado, y colocar uno nuevo previa esterilización. También deben ser lavadas correctamente y con cuidado para no romperlas. Son mas económicas que las descartables. Tener en cuenta que para el uso de las mismas se requieren propipetas ya sean automáticas o no. Las pipetas Pasteur son prácticas para transferir líquidos rápidamente. Pueden ser estériles o no-estériles. 9

Los tips con filtro previenen contaminaciones con líquidos o aerosoles durante el pipeteo. Tener en cuenta que el uso de estos tips no evitan las contaminaciones con todas las especies de Mycoplasma. Crioviales: Existen distintos tipos de crioviales, dependiendo del uso. Se utilizan para el almacenaje de células. En general, ningunas de las variantes se recomienda para su uso en N 2 fase líquida. Tubos de centrifuga o falcons: Son confeccionados en plástico, de diferentes capacidades. Los volúmenes más utilizados son 15 y 50 ml. Lo recomendable es adquirirlos estériles y no reutilizarlos. Sin embargo, en algunos casos pueden ser reutilizados con el correcto lavado y esterilización por autoclavado. Unidades de Filtración de medios y soluciones: La filtración estéril de líquidos (medios y soluciones amortiguadoras) para su uso en cultivos celulares y ensayos experimentales es un paso crítico y necesario para garantizar un ambiente libre de contaminación. Para esto, se utilizan unidades de filtración descartables (de polietileno o poliétersulfona; irradiados, vienen estériles) o reutilizables (deben lavarse, secarse, armarse y autoclavarse cada vez). En ambos casos se encuentran disponibles membranas de 0,22 μm (poro), lo que permite tener un flujo rápido con baja adsorción de proteínas. Además, pueden conseguirse filtros con poros de 0,45 o 0,10 μm. El sistema consta de un embudo filtrante unido mediante un anillo adaptador a un frasco de almacenamiento (o no) con un tapón estéril independiente. Cuando la unidad de filtración no cuenta con un frasco en su estructura deben ser acopladas a frascos autoclavables de vidrio tipo Boecco. 10

Unidades Reutilizables: Unidades Descartables: Cuando se necesitan esterilizar volúmenes pequeños de líquido (menores a 50 ml) pueden utilizarse filtros de jeringa estériles. Bilbliografia: https://www.gbo.com 11

http://www.corning.com Gibco Cell Culture Basic Handbook 2015 (www.lifetechnologies.com/cellculturebasics) Cell Culture Tissue Culture Lab Procedures. Alan Doyle. Cell Culture of Animal Cells. Ian Freshney. Growing more cells: a simple guide to small volume cell culture scale-up. Ryan JD. CORNING http://apbiotech.com.ar/productos/cultivo-celular 12